敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠模型应用于疾病研究的实验设计建议
敲除小鼠模型应用于疾病研究的实验设计建议实验设计建议：敲除小鼠模型在疾病研究中的应用引言：近年来，基因敲除小鼠模型在疾病研究中扮演着不可或缺的角色。
通过使用遗传工程技术，研究人员能够敲除或修改小鼠基因，模拟人类疾病的发展及机制，从而为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论基础。
本文将探讨敲除小鼠模型在疾病研究中的应用，并提出实验设计建议，以帮助研究者更好地利用这一模型。
一、敲除小鼠模型的概述敲除小鼠模型是通过基因敲除或敲入技术，对小鼠基因进行改变，来模拟人类疾病的发展和机制。
这一模型的优势在于小鼠与人类的基因组高度相似，其生物学特性和器官结构也与人类相似，因此成为疾病研究的理想模型。
二、敲除小鼠模型在疾病研究中的应用1. 疾病机制研究敲除小鼠模型可以帮助研究人员深入了解疾病的发展机制。
通过敲除特定基因，可以观察到小鼠是否出现与人类相似的疾病症状，从而揭示该基因在疾病发生发展中的作用。
例如，敲除小鼠模型被广泛应用于研究肿瘤和遗传性疾病等领域。
2. 药物筛选和治疗评估敲除小鼠模型可以用于评估新药的疗效和毒副作用。
通过与野生型小鼠进行对比，可以观察到敲除小鼠是否对药物产生特异性反应，从而为药物的开发和临床使用提供重要依据。
三、敲除小鼠模型实验设计建议1. 确定研究目标在开始设计敲除小鼠模型实验前，研究人员应明确研究的目标和疾病模型的特点。
例如，确定是否需要针对特定基因敲除，或是敲入人类特定基因的模型，以及设计实验要素等。
2. 选择敲除方法敲除小鼠模型的创建有多种方法，包括组织特异性基因敲除、胚胎干细胞敲除和基因座敲除等。
研究人员应根据具体需求选择合适的敲除方法。
3. 选择合适的鼠株和胚胎干细胞选择合适的鼠株和胚胎干细胞对于敲除小鼠模型的成功很关键。
鼠株的选择应基于其易感性和适应性，而胚胎干细胞的选择应基于其稳定性和再生能力。
4. 设计合适的实验组和对照组根据研究问题的需要，设计敲除小鼠模型的实验组和对照组。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
●CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）●CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠●CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
apoe敲除小鼠如何敲除？
apoe敲除小鼠如何敲除？
ApoE -/-小鼠是目前最常用的一种转基因小鼠品系[2]。
作为一种自发的动脉粥样硬化模型，其与人的动脉粥样硬化进程最为相似。
ApoE是极低密度脂蛋白(VLDL) 和高密度脂蛋白(HDL) 的组成部分，参与胆固醇的运输。
和人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白（LDL）含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。
敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。
研究表明ApoE -/-小鼠可自发形成高胆固醇血症（300-500 mg/dL），并在正常饮食条件下发生显著的动脉粥样硬化病变。
而高脂肪/高胆固醇的致动脉粥样硬化饮食会使血浆胆固醇水平升高超过1000 mg/dL，加速动脉粥样硬化进程[3]。
ApoE -/-小鼠血浆中三酰甘油水平也比正常小鼠高68%，且不受年龄和性别影响，其高密度脂蛋白只有正常小鼠45%[4]。
此类小鼠的病变部位主要发生于主动脉根部、主动脉弓、无名动脉、主动脉分支及肾动脉分叉。
正常饮食条件下，早期泡沫细胞病变可在10周内发生。
15周后发展成动脉粥样硬化病变。
20周后演变成晚期纤维病变。
高脂肪/高胆固醇饮食可加速这一致病过程，包括促进胆固醇结晶、坏死核心和钙化的形成。
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除小鼠饲养繁殖技巧
基因敲除⼩⿏饲养繁殖技巧科研狗但凡要做动物实验的，哪个不需要伺候⼩⿏？每天好吃的好喝地伺候着，定期更换垫料，还要操⼼它们的⼈⽣⼤事，给它分配对象，⽣了娃还要给帮它们做“亲⼦鉴定”，看见⼩⿏脱发了，要想办法，母⿏不⽣了，要想办法。
回头再看看⾃⼰，没头发，还没对象，天天愁⽂章，担⼼毕不了业，全指望⼩⿏们加油，让⾃⼰早⽇出成果，所以可不得好吃好喝的伺候它们嘛！尤其是基因敲除⼩⿏，⾝价昂贵，从接到它的那⼀刻起，整个⼈都⼜兴奋⼜紧张，⽣怕怠慢了这些⼩家伙，那么收到基因敲除⼩⿏后要如何制定计划进⾏扩群繁殖以满⾜实验需要呢？除了了解所选品系的⽣活习性外，我们还要考虑⾃⼰需要的基因编辑⿏可能出现哪些问题，有没有解决或者是改善的⽅法，这些我们可以通过查阅⽂献看有没有关于该基因敲除⼩⿏的相关信息并作出⼀个初步判断。
1.背景品系的特点这个不⽤多说，需要做动物实验的同学，谁还没养过⼏只⼩⿏呀，养之前肯定已经把它的⽣活习性、繁殖特点、饲养要求等了解的很清楚了，举个栗⼦，⽐如说C57BL/6J,该品系的雄⿏好⽃，尤其是刚断奶后不同窝的雄⿏不宜放⼀笼饲养。
2.饲养环境的要求应尽可能地给⼩⿏提供适宜的⽣活环境和营养，这⽅⾯可以参照国家标准来进⾏饲养管理。
⽐如，⼩⿏对于噪⾳、光照⽐较敏感，所以我们应给⼩⿏提供安静的环境，尽量选在⼈员⾛动少的地⽅，也不要频繁查看⼩⿏情况，这样⼩⿏会有压⼒的。
母⿏有筑巢的天性，可以向笼中放柔软的棉垫，⿎励其筑巢，有助于提⾼产量。
3.基因敲除⼩⿏饲养管理应注意哪些问题⼤多数基因敲除⼩⿏相对野⽣型⼩⿏⽽⾔，在某些⽅⾯会存在或⼤或⼩的问题，所以我们需要查阅相关的⽂献，看看有没有该基因敲除⼩⿏的⽂献报道，该基因被修饰后会出现哪些问题？这些问题有没有解决或者是改善的⽅法。
如果是某种基因被修饰后会导致⼩⿏不能合成某种物质，那么可以给⼩⿏额外补充该物质；若是基因敲除⼩⿏的成活率低，问题有可能出现在着床期⾄成年期的任意时间段，通过代乳和改善饲养条件也许能得以解决；如果基因敲除⼩⿏的⽣殖⼒低。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法
1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种高效的基因编辑工具，可以用来精确地敲除小鼠基因。
首先，科学家设计合成一段RNA序列，使其与目标基因序列相匹配，然后将这段RNA和Cas9蛋白复合体导入小鼠胚胎内。
复合体会通过识别并切割目标基因，导致基因敲除。
2. 胚胎干细胞技术，另一种常见的基因敲除小鼠方法是利用胚胎干细胞。
科学家可以将设计好的基因敲除载体导入小鼠胚胎干细胞中，使其发生基因敲除。
然后，这些修改过的干细胞可以被植入小鼠胚胎内，从而产生基因敲除小鼠。
3. 遗传改造小鼠技术，除了CRISPR/Cas9和胚胎干细胞技术，科学家还可以利用遗传改造技术来实现基因敲除。
这种方法涉及到选择性育种和杂交，通过选择性地交配和繁殖，最终得到具有特定基因敲除的小鼠品系。
总的来说，基因敲除小鼠的方法主要包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、胚胎干细胞技术和遗传改造小鼠技术。
这些方法都是在实验室条件下进行的，需要经过严格的实验设计和操作流程，以确保
基因敲除的准确性和有效性。
同时，这些方法也为科学家提供了强大的工具，用于研究基因在生物体内的功能和作用机制。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理
基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过人工干预使目标基因无法正常表达。
基因敲除小鼠则是在小鼠模型中应用基因敲除技术。
基因敲除的原理是利用DNA重组技术制备特定的敲除载体。
该载体中携带有目标基因的一部分DNA序列，同时还含有选择标记基因和其他必要的DNA片段。
敲除载体经过转染进入靶细胞后，在细胞内会发生DNA重组，导致目标基因发生敲除。
继而，选择标记基因的表达使得细胞能够被筛选出来。
在基因敲除小鼠的制备上，可以通过体外受精的方式将敲除载体导入受精卵中，或者通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9在早期胚胎阶段实现基因敲除。
随后，带有敲除基因的胚胎会被移植到代孕母鼠体内进行发育。
通过基因敲除小鼠模型，研究人员可以研究目标基因的功能以及生理、病理学功能。
这种技术广泛应用于研究基因对发育、生长、免疫应答、代谢、行为等方面的影响。
基因敲除小鼠模型也被用于疾病模拟，如研究癌症、神经系统疾病等。
总之，基因敲除小鼠是通过敲除目标基因实现对特定基因功能的研究，为深入理解基因的功能以及疾病发生机制提供了重要工具。
【干货】基因敲除小鼠鉴定方法
【⼲货】基因敲除⼩⿏鉴定⽅法
1、基因敲除阳性⿏的鉴定
在敲除的⽚段两端设计引物，扩增后电泳。
理论上敲除成功的⼩⿏扩增出的⽚段⼤⼩=野⽣型⼩⿏的⽚段⼤⼩－敲除的⽚段⼤⼩，所以可通过电泳图的条带⼤⼩来进⾏鉴别，但实际上，若敲除的⽚段过⼤，有的酶是扩增不出来野⽣型⽚段的，⽐如有的酶，1.5K以下基本可以P出条带，⼤于1.5K的⼤部分是P不出的，所以当野⽣型的条带⽆法扩增时，这对引物就不能鉴定纯杂合了。
PCR鉴定⽆阳性，都是⼩⿏的错？
1.1、野⽣型⽚段扩增不出来时
敲除的⽚段较⼤时，野⽣型相应的⽚段往往扩增不出来。
电泳结果若是⽆条带，则为野⽣型；若是只有⼀条条带，则为敲除⼩⿏（纯合或杂合）。
PS:条带⼤⼩=野⽣型⽚段⼤⼩-敲除⽚段⼤⼩
PCR鉴定⽆阳性，都是⼩⿏的错？
1.2、野⽣型⽚段可以扩增出来时
假设
条带1⼤⼩=野⽣型条带⼤⼩
条带2⼤⼩=野⽣型⽚段⼤⼩-敲除⽚段⼤⼩
当野⽣型的⽚段可以扩增出来时，电泳结果若是只有条带1，则为野⽣型；若是既有条带1⼜有条带2，则为杂合敲除⼩⿏；若是只有条带2，则为纯合敲除⼩⿏。
所以这种情况就不需要再设计引物鉴定纯杂合了。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法基因敲除小鼠模型是生物医学研究领域中常用的实验动物模型之一。
通过对特定基因进行敲除，科研人员可以研究该基因在生物体内的功能和影响，从而深入了解该基因对生物体的生理和病理过程的调控作用，为人类疾病治疗和药物研发提供重要的实验基础。
下面我们将介绍关于基因敲除小鼠的方法。
一、基因敲除小鼠的原理和意义1.1 基因敲除原理基因敲除是指通过人工手段破坏特定基因的DNA序列，使其失去功能。
在小鼠模型中，通常利用基因敲除技术将目标基因进行突变或删除，从而观察小鼠在不同生理状态下的表型变化，探索目标基因在生物体内的功能和作用机制。
1.2 基因敲除的意义基因敲除小鼠模型可以帮助科研人员研究特定基因的生物学功能，了解其在生物体内的作用机制。
基因敲除小鼠模型也能够为疾病研究和药物开发提供重要的实验依据，有助于发现新的治疗靶点和疾病治疗方法。
二、基因敲除小鼠的制备方法2.1 基因敲除小鼠的选择在进行基因敲除小鼠实验前，首先需要选择合适的小鼠品系和基因靶向。
常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c等，而基因敲除的选择通常基于目标基因在疾病或生理过程中的重要性。
2.2 敲除载体的构建和筛选制备基因敲除小鼠需要先构建敲除载体，通常采用基因工程技术将靶向基因进行突变或删除，然后将这些构建好的载体导入至小鼠胚胎干细胞中，进行筛选和培养。
2.3 胚胎干细胞的培养与筛选在培养和筛选过程中，科研人员需要将导入敲除载体的胚胎干细胞引入小鼠胚胎中，然后进行体外培养和筛选，以筛选出正常的敲除基因小鼠。
2.4 敲除小鼠的鉴定和繁殖成功培育出的敲除小鼠需要进行PCR鉴定和繁殖，以得到稳定传代的敲除小鼠品系。
对敲除小鼠进行系统的表型观察和分析，以确定目标基因敲除后的表型变化。
三、基因敲除小鼠的应用和前景3.1 基因敲除小鼠在生物学研究中的应用基因敲除小鼠模型广泛应用于生物学研究领域，包括生理学、免疫学、神经科学、遗传学等各个领域。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过人为地改变生物体的基因组，使得某个特定基因在生物体中失去功能。
基因敲除技术在动物模型研究中得到了广泛的应用，特别是在小鼠模型的构建中发挥着重要作用。
下面将介绍基因敲除小鼠的原理及其应用。
基因敲除小鼠原理。
基因敲除小鼠是指通过基因工程技术，将小鼠的某个特定基因进行改变，使得该基因在小鼠体内失去功能。
基因敲除小鼠的构建通常分为以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先需要选择需要敲除的目标基因，通常选择与某种疾病或生理过程相关的基因作为目标。
2. 构建敲除载体，将目标基因的敲除载体导入到小鼠的胚胎干细胞中，使得目标基因在胚胎干细胞中发生敲除。
3. 胚胎干细胞筛选，经过敲除载体导入后，对胚胎干细胞进行筛选，筛选出发生了基因敲除的干细胞。
4. 小鼠胚胎的移植，将发生了基因敲除的胚胎干细胞移植到受精小鼠卵母细胞内，通过体外培育和移植到母体小鼠子宫内，使得基因敲除小鼠的胚胎发育成熟。
5. 基因敲除小鼠的鉴定，对出生的小鼠进行基因型分析，确认是否成功构建了基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠的应用。
基因敲除小鼠模型在生物医学研究中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 功能基因研究，通过敲除特定基因，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生物体生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
2. 疾病模型构建，基因敲除小鼠模型可用于构建各种疾病模型，如肿瘤模型、免疫缺陷病模型等，用于研究疾病的发病机制及寻找治疗方法。
3. 药物筛选，基因敲除小鼠模型可用于药物的筛选和评价，通过观察敲除某个基因后对药物疗效的影响，为新药的研发提供重要参考。
4. 基因治疗研究，基因敲除小鼠模型可用于基因治疗的研究，通过敲除某个致病基因或导入正常基因，探索基因治疗的可行性及疗效。
总结。
基因敲除小鼠模型是一种重要的生物医学研究工具，通过对特定基因的敲除，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
基因敲除鼠原理 -回复
基因敲除鼠原理-回复基因敲除鼠是一种常用的实验动物模型，用于研究基因功能和疾病机制。
基因敲除是指通过人为手段删除动物体内的特定基因，从而观察基因缺失对生物体的影响。
在本文中，我们将详细介绍基因敲除鼠的原理和步骤。
1. 鼠标基因组定位和筛选首先，需要确定目标基因在鼠标基因组中的位置。
通过鼠标基因组浏览器等数据库和工具，我们可以获取目标基因的相关信息，包括基因的结构、启动子和剪接变异等。
在确认目标基因的位置后，接下来需要选择适合的切割位点。
2. 制备敲除载体基因敲除的一个关键步骤是通过亚克隆技术制备敲除载体。
首先，需要设计合成两个与目标基因两侧序列互补的引物。
引物设计时需要考虑到引物的特异性和合成的效率。
然后，利用聚合酶链反应(PCR)和DNA合成技术，我们可以扩增和合成两个互补的引物序列。
接下来，将扩增得到的两段DNA序列进行连接，形成敲除载体。
3. 选择胚胎干细胞接下来，在实验室条件下，需要选择和培养适合的胚胎干细胞。
胚胎干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和分化为不同类型细胞的能力。
这些细胞通常从早期胚胎中获得，可以通过培养和传代来扩增。
4. 转染敲除载体和选择阳性克隆将敲除载体转染到胚胎干细胞中是基因敲除鼠实验中的关键步骤之一。
转染一般采用电穿孔法或者病毒介导的转染技术。
转染后，通过添加适当的选择性抗生素，可以选择出转染了敲除载体的阳性克隆。
5. 形成敲除鼠模型得到阳性转染克隆后，可以通过将这些细胞注入早期胚胎的内质网，进一步培养和发展。
通过将这些胚胎移植到代孕母鼠子宫中，可以等待胚胎发育并诞生敲除鼠模型。
6. 验证基因敲除效果最后一步是验证基因敲除的效果。
可以通过PCR和DNA测序等分子生物学技术进行验证。
PCR可以检测目标基因的DNA序列是否被成功替换或删除。
而DNA测序则可以进一步验证目标基因的序列是否发生了改变。
基因敲除鼠模型的建立可以提供对特定基因功能的深入了解，并帮助研究人员揭示基因的作用和疾病机制。
小鼠基因敲除的基本步骤
小鼠基因敲除的基本步骤小鼠基因敲除听起来可能有点复杂，但别担心，我来给你简单明了地讲讲这个过程，顺便还想聊聊小鼠这个家伙的可爱之处。
首先，咱们得知道，基因敲除就是把某个特定基因给“关掉”，这样就能研究这个基因对小鼠的影响，简而言之，就是给科学家们提供了一扇观察基因如何工作的窗子。
1. 准备工作1.1 选择目标基因在一切开始之前，科学家得先决定要敲除哪个基因。
这个就像选口味一样，你可以选择巧克力、香草，还是草莓？每个基因都有自己的“性格”，而你要的就是找到那个特别的、让你心动的。
为了决定哪个基因最重要，科学家们通常会做一些文献调研，看看过去的研究成果，找出哪些基因和疾病、行为等方面有关系。
1.2 制备小鼠胚胎干细胞一旦选定了目标基因，接下来就要制备小鼠胚胎干细胞。
这些细胞就像是小鼠未来的“小宇宙”，能够发展成任何细胞。
科学家们会取小鼠的胚胎，经过一系列的处理，把这些细胞培养出来。
想象一下，就像是种花一样，浇水、施肥，让它们茁壮成长。
不过，咱们这次不是为了观赏，而是为了科学实验！2. 基因编辑2.1 设计靶向载体这一步就有点像是制作一张地图，科学家要设计一个靶向载体，把这个载体引导到目标基因的位置。
这个载体就像是一个快递包裹，里面装着“关掉”目标基因的指令。
科学家们利用一些分子生物学的技术，把这个载体制作好，准备在小鼠胚胎干细胞里实施“任务”。
2.2 转染小鼠胚胎干细胞有了载体，接下来就是把它送进小鼠的胚胎干细胞里。
这一步可得小心翼翼，像是把珍贵的陶瓷小心翼翼地放进柜子里。
科学家们会用一些化学试剂，或者电穿孔的方法，把载体导入细胞内。
这时，载体就会开始和目标基因“打招呼”，并实施敲除的计划。
3. 产生转基因小鼠3.1 筛选成功的细胞完成转染后，科学家需要筛选出那些成功“敲掉”基因的细胞。
这个过程有点像考试，只有通过了才能进入下一轮。
科学家会用一些特定的标记物来检测这些细胞，看看有没有成功的小伙伴。
如果找到了，哇，那可是大大的喜讯！3.2 复制小鼠最后一步是把这些成功的细胞注入到小鼠胚胎里，然后再将这些胚胎植入到代孕母鼠的体内。
基因敲除小鼠的原理
基因敲除小鼠的原理嘿，小伙伴们！今天咱们来聊聊基因敲除小鼠这个超级有趣的东西。
想象一下，小鼠的基因就像一本本小秘籍，每本秘籍都写着小鼠身体各个部分怎么生长、怎么工作。
而基因敲除呢，就像是一个调皮的小魔法师，把其中一本秘籍的好多页给撕掉或者改写了。
那这个小魔法师是怎么做到的呢？首先呢，科学家们得找到一种很厉害的工具，这个工具就像是一把超级小剪刀，这个小剪刀的名字叫做核酸内切酶。
它能专门识别小鼠基因里特定的小片段，就像钥匙和锁一样匹配。
比如说，有个基因片段长得像个小月亮，那这把小剪刀就专门找这种小月亮形状的片段。
然后呢，当小剪刀找到这个特定的片段后，咔嚓一下就把这个片段给剪断啦。
这一剪断可不得了，就像在那本秘籍中间挖了个大坑一样。
这个基因片段被剪断以后啊，小鼠的身体就会像突然接到了一个错误指令。
原本这个基因告诉身体要长出长长的尾巴，现在因为这个基因被破坏了，可能尾巴就长不长啦，或者长得奇奇怪怪的。
但是这个过程可不是随随便便就能成功的哦。
科学家们要做很多准备工作。
他们得精心挑选那些能够准确找到目标基因的小剪刀，这就好比是在一堆钥匙里找一把能开特定锁的钥匙，得特别细心才行。
而且，这个小剪刀要很稳定，不能乱剪其他不该剪的基因片段，不然小鼠身体里就乱套啦，就像把整个图书馆的书都弄乱了一样。
在这个过程中呢，还有一个很重要的步骤，就是要把这把小剪刀送到小鼠的细胞里面去。
这可不容易呢，就像要把一个小快递准确无误地送到一个超级小的收件箱里。
科学家们有时候会用一些特殊的方法，比如说把小剪刀和一些能轻松进入细胞的小物质结合起来，就像给小剪刀装上了一个导航仪，让它能顺利地到达目的地。
一旦小剪刀成功进入细胞，并且找到了目标基因并且剪断了它，这个细胞就开始按照新的指令来工作啦。
这个新的指令就是没有了被敲除的那个基因的指令。
然后这个细胞就会不断地分裂，产生更多的细胞，每个细胞都带着这个被改变的基因信息。
慢慢地，整只小鼠就会表现出因为这个基因被敲除而产生的各种变化啦。
巨噬细胞条件敲除小鼠
巨噬细胞条件敲除小鼠巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，具有重要的抗菌，抗病毒和免疫调节的作用。
巨噬细胞在机体内发挥着重要的生物学功能，扮演着“清道夫”的角色，负责捕捉、吞噬、消化和呈递细胞外抗原，刺激T 细胞和B细胞的免疫应答，参与免疫途径的激活和维持。
条件敲除是目前常用的基因功能研究方法之一，它是利用CRISPR 基因编辑技术，通过改造目标基因来探究基因功能的重要性。
巨噬细胞条件敲除小鼠是利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠体内巨噬细胞表达的目标基因，从而研究其对生物学过程的影响。
条件敲除技术是一种基因修饰技术，可以使一些特定的基因在特定的组织器官或细胞类型中被靶向调控，从而产生目标基因的失活和表达减弱，使得研究人员可以更好地了解这些基因在特定细胞类型中的作用。
巨噬细胞条件敲除小鼠，就是利用条件敲除技术来靶向敲除小鼠体内巨噬细胞表达的目标基因，从而研究巨噬细胞在机体内的功能。
通过巨噬细胞条件敲除小鼠的研究，可以更加深入地了解巨噬细胞在维持免疫调节和抗菌、抗病毒中的作用机理。
例如，对脾脏中巨噬细胞条件敲除肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的小鼠进行研究发现，与正常小鼠相比，敲除小鼠脾脏中的巨噬细胞数量明显降低，免疫应答意愿减弱，对大肠杆菌、沙门氏菌等细菌感染的清除能力也显著下降，说明TNFR1在免疫细胞抗菌和免疫调节中扮演着重要的作用。
除此之外，巨噬细胞条件敲除小鼠还可以用于研究巨噬细胞对肿瘤发展的影响。
例如，针对Tie2-Cre介导的STAT3条件敲除小鼠进行研究，发现敲除小鼠中的肿瘤细胞比正常小鼠中的肿瘤细胞更容易被巨噬细胞吞噬和消化，暗示了STAT3在肿瘤和巨噬细胞的相互作用中的重要性。
总之，巨噬细胞条件敲除小鼠是一种重要的实验动物模型，它可以为解决免疫学和肿瘤学等领域的一些重要问题提供有力的研究工具。
有了它的存在，我们可以更好地了解巨噬细胞在机体内的生物学功能，并可针对巨噬细胞在抗菌、抗病毒和免疫调节中的作用机理，寻找新的免疫干预方法和肿瘤治疗策略。
巨噬细胞条件敲除小鼠构建步骤
巨噬细胞条件敲除小鼠构建步骤巨噬细胞条件敲除小鼠的构建，这可不是一件简单的事儿啊！就好像盖房子，得一步一步来，每一步都要稳稳当当的。
首先呢，咱得选择合适的小鼠品系。
这就好比是挑选盖房子的地基，得结实牢固才行。
不同的品系可能有着不同的特点和适用性，得仔细琢磨琢磨。
然后就是设计针对巨噬细胞的条件敲除策略啦。
这就像是给房子设计一个独特的风格，要精准又巧妙。
得确定好要敲除的基因片段，可不能有一点儿差错。
接下来，得准备各种工具和材料，就像盖房子时准备砖块、水泥啥的。
这里面包括各种试剂、酶啊等等，一个都不能少。
有了这些，就可以开始进行基因编辑的操作啦。
这可是个精细活儿，就跟雕刻大师精心雕琢一件艺术品似的。
要小心翼翼地把不需要的基因部分去掉，换上我们想要的条件。
之后，把编辑好的细胞培养起来，让它们好好生长发育。
这就好比是看着房子一点点建起来，充满了期待。
等细胞培养好了，就得把它们移植到小鼠体内啦。
这就像是给房子添上最后一块瓦片，得稳稳当当放好。
移植之后，还得密切观察小鼠的情况。
看看它们是不是健康，有没有出现啥问题。
这就像随时检查房子有没有裂缝啥的。
经过一段时间的等待和观察，如果一切顺利，那就恭喜啦，我们的巨噬细胞条件敲除小鼠就初步构建成功啦！但这还不算完哦，还得对它们进行各种检测和验证，确保真的达到了我们想要的效果。
你说这是不是很不容易啊？但当看到这些经过精心构建的小鼠，就像看到自己亲手盖起来的漂亮房子一样，那种成就感简直无与伦比！所以啊，可别小瞧了这每一个步骤，每一个环节都至关重要呢！只有认真对待，才能得到我们想要的结果呀，你说是不是呢？。
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
用了条件性基因敲除小鼠就能发高分文章？首先你得跨过这些坑
用了条件性基因敲除小鼠就能发高分文章？首先你得跨过这些坑在学习跨坑之前，先来了解一下条件性基因敲除小鼠真身。
条件性基因敲除 CKO条件性基因敲除（Conditional Knockout）是指将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段，实现对小鼠基因组的时空特异性修饰。
应用•胚胎致死性基因的研究•研究靶基因在特定组织或细胞中的功能•研究靶基因在特定时期或阶段发挥的作用优势•多功能的基因敲除模型，可与不同工具鼠灵活搭配使用•明确了目的基因缺失的细胞类型或缺失发生的特定时间，更加客观而系统地研究目的基因在不同组织器官发生、发育或疾病发生、治疗过程中的作用与机制•克服了重要基因完全敲除后的胚胎致死或过早死亡，研究表明约有 1/3 的基因纯合敲除后会导致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡•避免由于全身性敲除目的基因可能引发的其它基因的代偿，导致基因敲除后没有明显表型改变为什么拥有条件性基因敲除小鼠模型更容易发高分文章？一篇好文章，意味着我们需要一个好故事。
时间、地点、人物，这故事的三大基本要素自然是缺一不可！简单的来说，故事的主人公就是我们所研究的基因。
而 CKO 除了可以明确目的基因的缺失在特定组织或细胞类型之中发生，还可以限制发生的特定时间。
与普通的 KO 相比，CKO 无疑提供了更精准确凿的不在场证明。
这样的故事当然也就更有说服力，再也不怕 reviewer 质疑啦！完美！不过，如果你看到这里就满心欢喜，小编只能说：TOO YOUNG TOO SIMPLE!条件性基因敲除美丽的背后可是暗藏玄机呢！条件性基因敲除的这些坑，你踩过几个？组织特异性 Cre 其实没那么特异？我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一样？原来 Cre 小鼠用雌鼠和用雄鼠还不一样？我的 CKO 小鼠为什么基因还没被敲除？Cre 小鼠也会不育？广泛表达的 Cre 在所有组织表达不一样高？诱导型 Cre 其实会漏？下面就让小编来给你填土埋坑！文末有彩蛋哦，可别等不及直接拉到最后看，错过前面的干货就可惜了～组织特异性 Cre 真的那么特异吗？师兄，应该是肝脏特异表达的 Cre，怎么好像在脑里也有表达？唉，理想是丰满的，而现实往往是骨感的。
基因敲除技术试题2则
基因敲除技术试题2则1．曾有科学家用“基因敲除”的方法生成嵌合体小鼠。
具体过程是将外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA 序列中，使某一个基因被取代或破坏而失活，形成杂合体细胞，然后将其植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。
请回答下列问题；（1）将外源基因整合到小鼠细胞的DNA序列中__________（填“属于”或“不属于”）基因突变。
（2）在基因敲除过程中要用到的酶有______________、______________等。
（3）要检测外源基因是否整合到小鼠胚胎干细胞的DNA序列中，常用的方法是______________________。
（4）嵌合体小鼠的生成涉及到的生物工程技术有______、______、______等。
（5）基因敲除技术有利于人类对某些遗传因素引发的疾病进行研究，下列疾病中，可能利用基因敲除技术治疗的有______。
A．囊性纤维病B．21三体综合征C．猫叫综合征D．镰刀型细胞贫血症2．基因剔除动物模型一直以来是开展基因功能研究的重要工具，其原理是通过导入外源分子使动物的某特定基因失活，进而培养出有基因缺陷的动物来研究相应基因的功能。
下图是制作某类基因剔除小鼠流程示意图。
请据图回答相关问题：（1）图中①过程常用的技术是______，②过程是______。
（2）体外受精时需要对精子进行______处理，然后与处于______期的卵母细胞在专用的受精溶液中完成受精过程。
（3）为更多地获得基因剔除小鼠，可对囊胚阶段的胚胎进行分割移植，此时要对______进行均等分割。
请说明理由：__________________________________________________________________________。
（4）研究发现人的SP1基因与乳腺癌细胞的异常表达和增殖密切相关。
你认为基因剔除技术可以为乳腺癌的治疗提供怎样的新思路：_______________________________________________________________。
小鼠酶敲除
小鼠酶敲除
哎呀，说起这个小鼠酶敲除嘛，那可真是科学界的一大壮举啊！你晓得不，咱们陕西那边，老一辈人都喜欢说：“做实验就像种地一样，得细心耕耘才能有好收成。
”这小鼠酶敲除，就得像咱们种地那样，一步步来，不得马虎。
咱们先说说这个酶，它可是咱们身体里头的小助手，帮忙干这干那的。
要是小鼠里头的某个酶不对劲了，那小鼠就得生病。
科学家们就想了个法子，把这个不对劲的酶给敲除掉，看看小鼠会变成啥样。
四川那边有句话说得好：“实践出真知。
”这些科学家们，就是通过实践，一点一点摸索出来的。
他们先是把小鼠的基因给修改了，然后观察这些小鼠有啥变化。
这可不是一朝一夕能搞定的，得花费好多时间和精力呢。
不过话说回来，这小鼠酶敲除也不是啥简单活。
有时候，敲除这个酶，小鼠没啥大变化；有时候，敲除那个酶，小鼠又变得奇奇怪怪的。
科学家们就得一直试，一直改，直到找到那个关键的酶。
这其中的辛苦，可不是一般人能想象的。
但正是这些科学家们的不懈努力，才让咱们对生命科学有了更深的了解。
他们用实际行动告诉我们：“科学无国界，但科学家有情怀。
”
所以说啊，这小鼠酶敲除，不仅是科学上的一大进步，更是咱们人类智慧的一种体现。
咱们得感谢这些科学家们，是他们的辛勤付出，让咱们对这个世界有了更多的认识。
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敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
它们的毛色不同。
因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。
ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。
常见问题1、你们是否接受打靶载体或者重组的胚胎干细胞之后的服务工作？目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服务，同时也可以承担打靶载体构建、细胞转染和显微注射等服务项目。
2、您公司的C57BL/6 野生型胚胎干细胞株是否可以出售？C57BL/6 野生型胚胎干细胞株我们是不对外出售的。
这个细胞株是我们自主研发并具有自主知识产权的细胞系。
鉴于基因敲除工作的重要环节以及是否可以得到一个比较好的Germline transmission的关键就是是否有一个高质量的ES cell line，因此这个ES cell line已经成为我们公司的最核心的资产。
所以，非常抱歉！我们不能对外出售，请您谅解！3、公司最后提供给客户多少只F1代小鼠？有相关的检测方法或检测报告吗？我们最后提供给客户的是不少于两只的F1杂合子小鼠。
一般情况下，我们可以提供更多的F1代杂合子小鼠。
我们会有相关的检测方法和最终的检测报告提供给您，您也可以自己进行核实检测！也可以在我们的帮助之下完成。
4、客户委托公司制备基因敲除小鼠需要提供哪些材料？客户只需要告诉我们要操作的基因名字和您的特殊要求。
对于没有经验的客户，我们会免费为您提供咨询，了解您的需求，以及想得到的结果，为您提供最佳的设计方案。
我们会对该基因进行序列分析后，给您一个初步的设计，双方沟通没有问题后，我们会签署一份技术服务合同，然后我们进行BAC的订购，开始模型的制备。
直到您得到F1代小鼠。
5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服务？我们公司现在主要是提供各种基因敲除小鼠模型的制备服务。
有关基因敲除的大鼠模型，我们公司正在对技术进行研发和优化。
所以现在还不能为您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！请关注我们公司的网站。
我们一旦开始提供大鼠基因敲除服务，我们将在公司网站上公布（估计在2013年）。
6、公司提供基因敲进服务时，对敲进的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？公司提供基因敲进服务时，对于特殊的基因，需要客户提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比较好。
对于5-10kb的，效率可能会低一些。
对于大片段的敲进，由于重组效率将大大地降低，我们可能会收取较多的费用。
7、公司会安排多少个阳性克隆进行囊胚注射？我们通常在注射的时候会安排四个克隆，但是我们做阳性重组胚胎干细胞筛选的时候通常要求得到不少于6-8个克隆，以备筛选更好的注射克隆之用。
而且，我们的最终目标是要得到优良的Germ-line transmission。
8、公司如何对转染的ESC进行筛选，如何确保目的基因的正确插入?我们在构建打靶载体时会引入NEO抗性基因筛选标记，同时在打靶载体特定位置引入酶切位点。
打靶载体电转细胞后，首先进行G418的抗性初筛。
之后，我们会通过两次Southern 杂交实验，对插入位点的两端进行验证，以此确保目的基因完整的插入到正确位置，以及其它位置没有随机插入。
9、公司制备完成的小鼠如何运输？公司在根据客户的要求得到F1杂合子小鼠后，我们会根据客户的具体要求选择运输方式与运输日期。
如果您没有特殊要求，我们会通过专业的实验动物运输公司，以空运的方式安排运输。
10、何谓Flox小鼠？所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。
另一个系统是为了把目的基因去掉。
Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。
理论上是没有区别的。
只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。
其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。
现在大家做一个Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。
2) Flip酶的活性比较低。
Flip酶是从酵母中分离出来的。
其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。
尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。
把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。
即使Flip的活性不高，也可以得到Flox 小鼠。
这些Flox小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。
反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。
这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。
如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。
那个时候筛选起来特别麻烦。
因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。
需要很多的时间和精力。
12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2）条件性基因敲除（Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP, LacZ, TdTomato等）；4）基因敲降（Knock-down): 通过降解mRNA的方法降低蛋白的表达水平（一般是用microRNA 或siRNA)。
5）转基因：在体内过表达一个特定基因，就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。
13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。
许多实验室，包括我们公司，都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。
原因不是很清楚,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。
可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。
另外，毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一定完全一致。
也有人认为雄性ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。
现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。
14、ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入,在原来的设计中，目的基因cDNA上游带有一段转录终止序列“Stop”（3个拷贝的SV40多聚A序列，tPA）,转录终止序列的两端各有一个Loxp位点，将此结构定点嵌入Rosa26基因位置，整个结构的转录受Rosa26启动子控制。
在没有Cre的情况下，由于Rosa26启动子与目的基因之间“STOP”的存在，目的基因不能被表达。
如果有Cre表达， Cre重组酶将去除“STOP”，Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。
但是，由于Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。
为了解决这一问题，可以对原Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG启动子, 该启动子由鸡actin启动子和CMV增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。
15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从exon1敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计，不能从exon1开始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到启动子区域，因为很难预测启动子和所有调控元件的位置，loxp的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1开始敲除。
16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技术方法主要是siRNA。
对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个siRNA，并对每一个siRNA进行验证（一般利用细胞系），这就造成筛选具有干扰作用siRNA的选择难度相当大。
2）一般情况下，RNAi对于基因的抑制不会很完全。
在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5天，以验证siRNA的抑制功能。
而在小鼠体内，siRNA尽管可以降低mRNAs的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。