RP—HPLC测定腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱的含量

RP—HPLC测定腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱的含量
作者：钱伟汪明志张咏梅
来源：《中国中医药信息》2012年第08期
摘要：目的建立腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱的含量测定方法。

方法采用反相高效液相色谱法测定腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱含量，色谱柱SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5
µm），流动相为乙腈-0.2%冰乙酸（用三乙胺调pH为6.30），梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长232 nm，柱温为30 ℃。

结果次乌头碱和乌头碱分别在进样量0.007 2～0.072 µg、0.004 6～0.046 µg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r分别为0.999 5、0.999 8，平均加样回收率分别为98.2% （RSD=1.6%）、97.4%（RSD=1.9%）。

结论该方法准确、方便、快速，可以用来测定腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱的含量。

关键词：腰痛合剂；次乌头碱；乌头碱；反相高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0055-03
腰痛合剂是张家港市中医医院院内制剂，由制草乌、制川乌、附子、羌活、独活等20味中药组成，功能祛风胜湿、蠲痹止痛，主治腰痛。

方中制草乌、制川乌[1]分别为毛茛科植物
北乌头、乌头的干燥块根的炮制品，附子为毛茛科植物乌头的子根的加工品，三者均有止痛功效，但三者都有毒。

为保障临床安全有效用药，本试验选择制草乌、制川乌和附子中共有成分乌头碱和次乌头碱为指标，通过建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定腰痛合剂中乌头碱和次乌头碱含量的方法，为制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪；PAD检测器；色谱柱：SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5
µm），SCQ-250超声波清洗器。

腰痛合剂（批号101002、110310、110816，张家港市中医医院制剂室制备）；乌头碱对照品（批号110720-200410）、次乌头碱对照品（批号110798-200404）购自中国药品生物制
品检定所，供含量测定；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，冰乙酸、三乙胺均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱 SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）。

流动相：A为乙腈，B为0.2%冰乙酸（用三乙胺调pH为6.30）。

梯度洗脱：0～30 mim，A 30%→40%，B 70%→60%；30～45
min，A 40%→30%，B 60%→70%；40～55 min，A 30%→30%，B 70%→70%。

流速：1
mL/min；检测波长：232 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。

理论塔板数以次乌头碱峰面积计不小于4 500。

2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液的制备精密吸取50 mL腰痛合剂于干净蒸发皿内，置于水浴锅上蒸干，用40 mL无水乙醇溶解、转移至锥形瓶中，超声（250 W，40 kHz）20 min，过滤，药渣再加入30 mL无水乙醇，超声（250 W，40 kHz）20 min，过滤，合并2次滤液，挥干，残渣加0.6 mol/L盐酸溶解并转入分液漏斗中，加乙醚萃取3次（20、20、10 mL），取酸水层，加氨水调pH为10，用乙醚萃取3次（20、20、10 mL），取乙醚层，挥干乙醚，残渣用甲醇溶解转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经0.22 µm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 阴性对照品溶液的制备按腰痛合剂生产工艺制备缺制草乌、制川乌和附子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备精密称取次乌头碱对照品
3.6 mg于50 mL容量瓶内，加甲醇完全溶解并定容至刻度，得72 µg/mL次乌头碱对照品溶液。

精密称取乌头碱对照品2.3 mg于50 mL容量瓶内，加甲醇完全溶解并定容至刻度，得46 µg/mL乌头碱对照品溶液。

分别精密吸取次乌头碱对照品溶液和乌头碱对照品溶液各1 mL于10 mL容量瓶内，加甲醇定容至刻度，制成每1 mL含次乌头碱7.2 µg和乌头碱
4.6 µg的溶液，即得混合对照品溶液。

2.3 系统适用性试验
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液20 µL进样测定，结果乌头碱和次乌头碱分离度良好，供试品溶液和混合对照品溶液在相同时间出峰，阴性样品无干扰，见图1。

2.4 线性关系考察
分别精密吸取混合对照品1、2、4、6、8、10 µL，按上述色谱条件进样，测定次乌头碱和乌头碱的峰面积，以峰面积为横坐标，进样量为纵坐标，进行回归，得到标准曲线。

回归方程分别为：次乌头碱Y=1 222 200.48X-327.04，r=0.999 5，乌头碱Y=1 350 208.46X-359.29，
r=0.999 8。

结果表明，次乌头碱进样量在0.007 2～0.072 µg、乌头碱进样量在0.0046～0.046 µg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品20 µL，连续进样6次，测定次乌头碱和乌头碱的峰面积，RSD分别为1.5%、1.7%，结果表明仪器精密度良好，符合分析要求。

2.6 稳定性试验
按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h时进样，测定次乌
头碱和乌头碱的色谱峰面积，计算次乌头碱和乌头碱的含量，RSD分别为1.9%、2.2%，结果表明次乌头碱和乌头碱的含量在8 h内稳定。

2.7 重复性试验
按上述色谱条件，吸取同一批供试品溶液20 µL进样，连续进样6次（n=6），测定次乌
头碱和乌头碱的色谱峰面积，计算次乌头碱和乌头碱的含量，RSD分别为1.2%、1.7%，结果表明重复性良好，符合分析要求。

2.8 加样回收率试验
3 讨论
据文献报道，有用甲醇-水-三乙胺、甲醇-0.1%三乙胺、乙腈-0.1%三乙胺、乙腈-0.2冰乙
酸等作为流动相，有的使用三乙胺调pH配成缓冲溶液，有的则没有用缓冲溶液[2-4]。

通过比较不同流动相下次乌头碱和乌头碱的分离度及色谱图形和保留时间，通过系统适用性试验和专属试验，选择乙腈-0.2冰乙酸（三乙胺调pH=6.30）作为流动相，进行梯度洗脱，次乌头碱和乌头碱分离度良好，阴性对照无干扰。

腰痛合剂是由多种中药组成的中药复方制剂，成分比较复杂，为了减小杂质对目标成分的干扰，通过无水乙醇的超声处理，除去不溶于乙醇的大部分杂质，利用次乌头碱和乌头碱的碱性，通过酸提碱沉，最后用有机溶剂乙醚进行萃取，降低了杂质对次乌头碱和乌头碱的干扰，更有利于准确测定次乌头碱和乌头碱的含量。

通过样品测定可知，次乌头碱和乌头碱平均含量分别为0.881 0、0.204 7 µg/mL，故可以
制定腰痛合剂中次乌头碱含量应在0.704 8～1.057 2 µg/mL范围内，乌头碱含量应在0.163 7～0.245 6 µg/mL范围内。

本试验建立了方便、稳定、准确测定腰痛合剂中次乌头碱和乌头碱含
量的方法，为腰痛合剂的质量控制提供了一定的依据。

参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：37.
[2] 李智勇，邓亚利，孙冬梅.HPLC法测定癌痛巴布剂中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱[J].中成药，2011，33（6）：988-991.
[3] 辛杨，王淑敏，刘志强.高效液相色谱法测定草乌叶中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱[J].现代药物与临床，2008，23（4）：170-171.
[4] 丘振文，罗丹冬，王沛坚.HPLC法测定舒痹宁颗粒中次乌头碱、新乌头碱的含量[J].中药新药与临床药理，2008，19（4）：304-306.
[5] 叶震强，张辉珍.高效液相色谱法测定附子中次乌头碱的含量[J].时珍国医国药，2006，17（2）：197-198.
（收稿日期：2012-02-25，编辑：陈静）。