第六讲NMR介绍
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CH3
down field deshielding high frequency
13/43
NOE效应 (Nuclear Overhouser Effect)
• NMR 之所以能解出蛋白质分子在水溶液的 三维结构，主要的就是要靠NOE效应。 • NOE＝(I ′ －I0) / I0 • I ′为质子对被照射时的intensity • I0 为质子对未被照射时的intensity • 如果NOE愈強，表示二质子间距离愈短。 • NOE 的大小与质子对之间距(γ)的6 次方成反 比：NOE ∝ 1 / γ6
14/43
Non-sequential contacts
secondary and tertiary structure
15/43
核磁共振波谱仪
一. 主要组成及部件的功能
工作原理基仪器结构框图（连续波核磁共振波谱仪） 射频发射 单元 射频监测 单元
磁 场
磁 场
射频和磁场 扫描单元
探头
数据处理 仪器控制
28/43
29/43
30/43
The NMR “band shift” and binding site mapping
Chemical shift perturbation upon ligand binding Mapping of the ligand binding Site onto the structure
第六讲：NMR介绍 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy For Short： NMR
1/43
1. 一般认识 NMR 是 研 究 处 于 磁 场 中 的 原 子 核 对 射 频 辐 射 (Radio-frequency
Radiation)的吸收，它是对各种有机和无机物的成分、结构进行定
11/43
以 ppm (parts per million)为单位 化学位移= (s r)/SF s = 样品(sample)频率(in Hz) r = 参考(reference)频率(in Hz) SF = 光谱仪频率(spectrometer frequency, in MHz)
McKenna, S. et al, Biochemistry, 2003
31/43
32/43
NMR spectroscopy of protein in living cells (In-cell NMR)
Sakakibara et al, Nature, 2009
33/43
NMR structure of protein in living cells (In-cell NMR)
Inomata et al, Nature, 2009
34/43
Combination of NMR and X-ray techniques in structural biology
PDZ1 PDZ2 PDZ3 L1 PDZ4 PDZ5 PDZ6 L2(KBD) PDZ7
Fras1
Takamiya et al, Nat genet. 2004
Magnetic field strength, B0
5/43
具有I = ±1/2的原子核之磁矩及能阶 具有I = ±1/2的原子核在磁场B0中，其磁矩的取向取决于其磁量子 态，有二种 ，如上图所示。此二取向代表兩个量子态，原子核的 位能E为 二能阶之位能差为
6/43
核磁共振仪的射频器(transmitter)打了一個 脉冲(pulse)，将此净磁化量偏移z轴，此偏 移的磁化量就沿著磁场方向(z轴軸)做运动 (precession)。造成此磁化量形成陀螺的轨迹， 如下图所示。此磁化量的轨迹，会引导一 个振荡电流而被记录下來。
产生不同的NMR讯号
9/43
10/43
化学位移(Chemical Shift) ()
化学位移( 以表示 )起源于原子核周围的电子运动所造 成对磁场感应的遮蔽效应( shielding effect )致使其讯 号偏离标准的共振频率。不同功能基的原子核即会因遮 蔽效应不同而表现出不同的化学位移值。原子的负电性 越大，因电子效应造成质子附近的电荷密度降低，遮蔽 效应減少，使光谱向左移( 低磁场或高频率 )，化学位 移会增大。化学位移可提供分子结构信息，温度改变、 产生结构等因素会造成化学位移的改变，化学位移的单 位为ppm
Fraser syndrome is a recessive multisystem disorder characterized by embryonic epidermal blistering, cryptophthalmos, syndactyly, renal defects 35/43
Folding research of GRIP1-PDZ12 by NMR and CD spectroscopy 36/43
PDZ12/Fras1 复合物晶体
晶体衍射图
PDZ12/Fras1 复合物的晶体结构
Long et al, JMB, 2008
37/43
38/43
39/43
40/43
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
41/43
42/43
43/43
7/43
不同核种
不同的gyromagnetic ration (旋磁比）
在相同的磁场
产生/吸收不同共振频率的电磁波
产生不同的NMR讯号
8/43
相同核种
相同的gyromagnetic ration (旋磁比）
不同的化学环境
虽然在相同静磁场Bo 但感受到不同净磁场（Beff）
产生/吸收不同共振频率的电磁波
仪器组成部分：磁场、探头、射频发射单元、射频和磁场扫描单元、射频 监测单元、数据处理仪器控制六个部分。
16/43
香港科技大学核磁共振中心（750MHz）
17/43
H
O H
-OH
TMS -CH2
H C C H H H
低分辨率NMR仪器
8.0 7.0 6.0 5.0
-CH3
δ /ppm
4.0
3.0
2.0
2：OD600 = ~ 0.45, add IPTG to induce protein expression 3：PBS buffer, pH 7 4：sample concentration: ~ 1 mM
20/43
21/43
Long et al, JMB, 2008
22/43
23/43
12/43
Tetramethylsilane
将TMS 加入样品中 H3C Si CH3 因Si比C有较小的电负度 CH3 TMS的氢原子有较大的遮蔽效应 將TMS的讯号定为0 ppm 一般有机化合物的氢原子讯号会于 TMS 的左方
Spectrum up field shielding low frequency
性分析的最强有力的工具之一，有时亦可进行定量分析。 在强磁场中，原子核发生能级分裂(能级极小：在1.41T磁场中， 磁 能 级 差 约 为 2510-3J) ， 当 吸 收 外 来 电 磁 辐 射 (109-1010nm,4-
900MHz)时，将发生核能级的跃迁----产生所谓NMR现象。
射频辐射——原子核(强磁场下能级分裂)——吸收──能级跃迁──NMR
1946年：Harvard 大学的Purcell和Stanford大学的Bloch各自首次发现并证实
NMR现象，并于1952年分享了诺贝尔奖； 1953年：Varian开始商用仪器开发，并于同年制作了第一台高分辨NMR 仪； 1956年：Knight发现元素所处的化学环境对NMR信号有影响，而这一影响与物质 分子结构有关。 1970年：Fourier(pilsed)-NMR 开始市场化（早期多使用的是连续波NMR 仪器）； 1991年：R.R.Ernst 发展高分辨率核磁共振波谱学（脉冲傅利叶变换核磁共振谱、 二维核磁共振谱），获1991年度诺贝尔化学奖； 2003年：美国科学家Paul Lauterbur 和 英国科学家Peter Mansfield因在(核)磁共 振成像技术领域的突破性成就，共同获得2003年度诺贝尔生理学或医学 奖。 3/43
25/43
Malate synthase G (723 AAs, 81.4 kDa) (2002)
26/43
15N-HSQC
spectrum of a folded (A) and an unfolded (B) protein B
A
27/43
smTEEQPVASW ALSFERLLQDPL GLAYFTEFLKKE FSAENVTFWKA CERFQQIPASDT QQLAQEARNIYQ EFLSSQALSPVNI DRQAWLGEEVL AEPRPDMFRAQ QLQIFNLMKFDS YARFVKSPLYRE CLLAEAEGRPLR EPGSSRLGSPDA T
4/43
外加磁场(Bo)与能阶差(E)之关系
b spin state
randomly oriented nuclei (no magnetic field)
E 200 MHz for 1H
E 400 MHz for 1H
Energy
0
a spin state 4.7 9.4
High Field NMR • increased sensitivity • increased dispersion
1.0
0
-OH TMS -CH2 高分辨率NMR仪器
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
-CH3
δ /ppm
18/43
19/43
NMR 样品的制备
1：M9 minimal medium
Na2HPO4 (6.78 g/L); KH2PO4 (3 g/L); NaCl (0.5 g/L); MgSO4 (2 mM); CaCl2 (0.1 mM); NH4Cl (1 g/L, 15N-98%+); D-Glucose (1 g/L, 13C6-99%)
测定有机化合物的结构，1HNMR──氢原子的位置、环境以及 功能团和C骨架上的H原子相对数目） 与UV-Vis和红外光谱法类似，NMR也属于吸收光谱，只是研究的对
象是处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收。
2/43
2. 发展历史
1924年：Pauli 预言了NMR 的基本理论，即，有些核同时具有自旋和磁量子数， 这些核在磁场中会发生分裂；
1: Exchange 1H for 2H
Pfuhl M. and Driscoll, P.C. NMR in the new millennium. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2000).
24/43
2: TROSY-experiment
2D 1H/15N correlation (right) , TROSY (left); 24kD fragment of phosphoinositide 3-kinase Pfuhl M. and Driscoll, P.C. NMR in the new millennium. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2000).
down field deshielding high frequency
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NOE效应 (Nuclear Overhouser Effect)
• NMR 之所以能解出蛋白质分子在水溶液的 三维结构，主要的就是要靠NOE效应。 • NOE＝(I ′ －I0) / I0 • I ′为质子对被照射时的intensity • I0 为质子对未被照射时的intensity • 如果NOE愈強，表示二质子间距离愈短。 • NOE 的大小与质子对之间距(γ)的6 次方成反 比：NOE ∝ 1 / γ6
14/43
Non-sequential contacts
secondary and tertiary structure
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核磁共振波谱仪
一. 主要组成及部件的功能
工作原理基仪器结构框图（连续波核磁共振波谱仪） 射频发射 单元 射频监测 单元
磁 场
磁 场
射频和磁场 扫描单元
探头
数据处理 仪器控制
28/43
29/43
30/43
The NMR “band shift” and binding site mapping
Chemical shift perturbation upon ligand binding Mapping of the ligand binding Site onto the structure
第六讲：NMR介绍 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy For Short： NMR
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1. 一般认识 NMR 是 研 究 处 于 磁 场 中 的 原 子 核 对 射 频 辐 射 (Radio-frequency
Radiation)的吸收，它是对各种有机和无机物的成分、结构进行定
11/43
以 ppm (parts per million)为单位 化学位移= (s r)/SF s = 样品(sample)频率(in Hz) r = 参考(reference)频率(in Hz) SF = 光谱仪频率(spectrometer frequency, in MHz)
McKenna, S. et al, Biochemistry, 2003
31/43
32/43
NMR spectroscopy of protein in living cells (In-cell NMR)
Sakakibara et al, Nature, 2009
33/43
NMR structure of protein in living cells (In-cell NMR)
Inomata et al, Nature, 2009
34/43
Combination of NMR and X-ray techniques in structural biology
PDZ1 PDZ2 PDZ3 L1 PDZ4 PDZ5 PDZ6 L2(KBD) PDZ7
Fras1
Takamiya et al, Nat genet. 2004
Magnetic field strength, B0
5/43
具有I = ±1/2的原子核之磁矩及能阶 具有I = ±1/2的原子核在磁场B0中，其磁矩的取向取决于其磁量子 态，有二种 ，如上图所示。此二取向代表兩个量子态，原子核的 位能E为 二能阶之位能差为
6/43
核磁共振仪的射频器(transmitter)打了一個 脉冲(pulse)，将此净磁化量偏移z轴，此偏 移的磁化量就沿著磁场方向(z轴軸)做运动 (precession)。造成此磁化量形成陀螺的轨迹， 如下图所示。此磁化量的轨迹，会引导一 个振荡电流而被记录下來。
产生不同的NMR讯号
9/43
10/43
化学位移(Chemical Shift) ()
化学位移( 以表示 )起源于原子核周围的电子运动所造 成对磁场感应的遮蔽效应( shielding effect )致使其讯 号偏离标准的共振频率。不同功能基的原子核即会因遮 蔽效应不同而表现出不同的化学位移值。原子的负电性 越大，因电子效应造成质子附近的电荷密度降低，遮蔽 效应減少，使光谱向左移( 低磁场或高频率 )，化学位 移会增大。化学位移可提供分子结构信息，温度改变、 产生结构等因素会造成化学位移的改变，化学位移的单 位为ppm
Fraser syndrome is a recessive multisystem disorder characterized by embryonic epidermal blistering, cryptophthalmos, syndactyly, renal defects 35/43
Folding research of GRIP1-PDZ12 by NMR and CD spectroscopy 36/43
PDZ12/Fras1 复合物晶体
晶体衍射图
PDZ12/Fras1 复合物的晶体结构
Long et al, JMB, 2008
37/43
38/43
39/43
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
41/43
42/43
43/43
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不同核种
不同的gyromagnetic ration (旋磁比）
在相同的磁场
产生/吸收不同共振频率的电磁波
产生不同的NMR讯号
8/43
相同核种
相同的gyromagnetic ration (旋磁比）
不同的化学环境
虽然在相同静磁场Bo 但感受到不同净磁场（Beff）
产生/吸收不同共振频率的电磁波
仪器组成部分：磁场、探头、射频发射单元、射频和磁场扫描单元、射频 监测单元、数据处理仪器控制六个部分。
16/43
香港科技大学核磁共振中心（750MHz）
17/43
H
O H
-OH
TMS -CH2
H C C H H H
低分辨率NMR仪器
8.0 7.0 6.0 5.0
-CH3
δ /ppm
4.0
3.0
2.0
2：OD600 = ~ 0.45, add IPTG to induce protein expression 3：PBS buffer, pH 7 4：sample concentration: ~ 1 mM
20/43
21/43
Long et al, JMB, 2008
22/43
23/43
12/43
Tetramethylsilane
将TMS 加入样品中 H3C Si CH3 因Si比C有较小的电负度 CH3 TMS的氢原子有较大的遮蔽效应 將TMS的讯号定为0 ppm 一般有机化合物的氢原子讯号会于 TMS 的左方
Spectrum up field shielding low frequency
性分析的最强有力的工具之一，有时亦可进行定量分析。 在强磁场中，原子核发生能级分裂(能级极小：在1.41T磁场中， 磁 能 级 差 约 为 2510-3J) ， 当 吸 收 外 来 电 磁 辐 射 (109-1010nm,4-
900MHz)时，将发生核能级的跃迁----产生所谓NMR现象。
射频辐射——原子核(强磁场下能级分裂)——吸收──能级跃迁──NMR
1946年：Harvard 大学的Purcell和Stanford大学的Bloch各自首次发现并证实
NMR现象，并于1952年分享了诺贝尔奖； 1953年：Varian开始商用仪器开发，并于同年制作了第一台高分辨NMR 仪； 1956年：Knight发现元素所处的化学环境对NMR信号有影响，而这一影响与物质 分子结构有关。 1970年：Fourier(pilsed)-NMR 开始市场化（早期多使用的是连续波NMR 仪器）； 1991年：R.R.Ernst 发展高分辨率核磁共振波谱学（脉冲傅利叶变换核磁共振谱、 二维核磁共振谱），获1991年度诺贝尔化学奖； 2003年：美国科学家Paul Lauterbur 和 英国科学家Peter Mansfield因在(核)磁共 振成像技术领域的突破性成就，共同获得2003年度诺贝尔生理学或医学 奖。 3/43
25/43
Malate synthase G (723 AAs, 81.4 kDa) (2002)
26/43
15N-HSQC
spectrum of a folded (A) and an unfolded (B) protein B
A
27/43
smTEEQPVASW ALSFERLLQDPL GLAYFTEFLKKE FSAENVTFWKA CERFQQIPASDT QQLAQEARNIYQ EFLSSQALSPVNI DRQAWLGEEVL AEPRPDMFRAQ QLQIFNLMKFDS YARFVKSPLYRE CLLAEAEGRPLR EPGSSRLGSPDA T
4/43
外加磁场(Bo)与能阶差(E)之关系
b spin state
randomly oriented nuclei (no magnetic field)
E 200 MHz for 1H
E 400 MHz for 1H
Energy
0
a spin state 4.7 9.4
High Field NMR • increased sensitivity • increased dispersion
1.0
0
-OH TMS -CH2 高分辨率NMR仪器
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
-CH3
δ /ppm
18/43
19/43
NMR 样品的制备
1：M9 minimal medium
Na2HPO4 (6.78 g/L); KH2PO4 (3 g/L); NaCl (0.5 g/L); MgSO4 (2 mM); CaCl2 (0.1 mM); NH4Cl (1 g/L, 15N-98%+); D-Glucose (1 g/L, 13C6-99%)
测定有机化合物的结构，1HNMR──氢原子的位置、环境以及 功能团和C骨架上的H原子相对数目） 与UV-Vis和红外光谱法类似，NMR也属于吸收光谱，只是研究的对
象是处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收。
2/43
2. 发展历史
1924年：Pauli 预言了NMR 的基本理论，即，有些核同时具有自旋和磁量子数， 这些核在磁场中会发生分裂；
1: Exchange 1H for 2H
Pfuhl M. and Driscoll, P.C. NMR in the new millennium. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2000).
24/43
2: TROSY-experiment
2D 1H/15N correlation (right) , TROSY (left); 24kD fragment of phosphoinositide 3-kinase Pfuhl M. and Driscoll, P.C. NMR in the new millennium. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2000).