磁珠提取DNA原理 (2)

磁珠纯化DNA原理

1、DNA与磁珠作用原理

分选磁珠的作用原理就是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化

方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG与盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程就是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。

纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状

材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心就是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面就是羧基(-COOH)修饰

的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。

在整个体系中,PEG就是影响DNA回收的决定性因素(其她因素还包括DNA 大小与浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要就是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。

当处于PEG与盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这就是由于带正

电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG与盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。

磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收方式,还具有3个明显的优势:1)效率更高,以DNA为例,1μL磁珠的承载量可达7μg;2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,更加安全;3)操作简单,无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。

2、蛋白酶K的作用

蛋白酶K具有降解蛋白的功能,而细胞膜主要就是由蛋白质构成的富有弹性的半透性膜,因此蛋白酶K能够裂解细胞,从而DNA能够释放出来。

3、无水乙醇沉淀DNA

用无水乙醇沉淀DNA,这就是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点就是可以任意比与水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此就是理想的沉淀剂。当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。

4、TE缓冲液溶解DNA

采用Tris-HCl(pKa=8、0)的缓冲系统,由于缓冲液就是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,并且TE 缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

5、为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。