体积排阻色谱和光散射技术SECMALS专题培训课件

合集下载

sec-mals原理

sec-mals原理SEC-MALS（Size Exclusion Chromatography with Multi-AngleLight Scattering）是一种结合尺寸排阻色谱和多角度光散射的分析方法，主要用于分析溶液中的高分子量生物大分子，如蛋白质、多肽、DNA、RNA 等。

SEC-MALS通过测量溶液中生物大分子的光散射强度及其粒径随时间的变化，从而获得样品的分子量、大小和构象等重要信息。

SEC（Size Exclusion Chromatography）是一种基于分子大小的色谱法，常用于高分子量分析。

此方法是基于溶液中生物大分子通过固相填料时的不同分子大小进而被分离出来的原理。

填料一般是由多孔性纳米级固体颗粒构成，形成了一个漏斗状的色谱柱。

溶液中的大分子无法进入填料孔隙，因此会以较快的速度通过色谱柱，而小分子能够进入填料孔隙，因此会以较慢的速度通过色谱柱。

通过对不同时间点的样品进行收集，可以得到不同大小的分子。

SEC相比其他色谱方法，具有样品制备简单、溶液稳定性好、分离速度快等优点。

MALS（Multi-Angle Light Scattering）是一种光散射原理。

当光通过样品中的粒子时，会发生散射现象。

根据散射光的角度和强度变化，可以获得样品中粒子的分子量和分子大小信息。

MALS主要使用的是小角散射（小于5°）和多角散射（5°到90°），这样可以实现对不同粒径粒子的散射信息的检测和分析。

MALS能够克服传统方法中分子大小对测量结果的影响，具有高精确度和高灵敏度的优点。

SEC-MALS结合了SEC和MALS两种原理的优点。

在SEC-MALS实验中，样品首先通过SEC色谱柱进行分离。

然后，在样品通过柱后，使用多角度光散射检测器对溶液中的生物大分子进行测量。

MALS检测器会收集被分离的样品，并且在不同角度下测量其散射光的强度变化。

通过使用与色谱柱联接的在线MALS检测器，可以实现对流动溶液中生物大分子的连续监测。

sec体积排阻色谱法流动相

sec体积排阻色谱法流动相
摘要：
1.SEC 体积排阻色谱法的概述
2.SEC 体积排阻色谱法的流动相种类
3.SEC 体积排阻色谱法的应用领域
4.SEC 体积排阻色谱法的未来发展趋势
正文：
SEC 体积排阻色谱法，全称为凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography），是一种基于样品在多孔凝胶颗粒中分布的不同而达到分离目的的分离技术。

这种技术主要通过样品在凝胶颗粒中的扩散速度来实现分离，因此，其流动相的选择对于分离效果至关重要。

SEC 体积排阻色谱法的流动相种类主要有水、缓冲溶液、醇类等。

其中，水作为流动相在分离极性大分子，如蛋白质和核酸等方面有着广泛的应用。

缓冲溶液则常用于分离生物大分子，如蛋白质和核酸等。

醇类流动相则常用于分离非极性大分子，如聚合物等。

SEC 体积排阻色谱法在生物科学、化学、环境科学等领域有着广泛的应用。

在生物科学领域，SEC 体积排阻色谱法可以用于分离蛋白质、核酸等生物大分子；在化学领域，SEC 体积排阻色谱法可以用于分离聚合物和高分子材料；在环境科学领域，SEC 体积排阻色谱法可以用于分离水中的有机物和重金属离子等。

随着科技的进步，SEC 体积排阻色谱法在分离技术上也有着新的发展。

例
如，采用高效液相色谱（HPLC）系统可以提高SEC 体积排阻色谱法的分离效率；采用质谱（MS）检测器可以提高SEC 体积排阻色谱法的检测灵敏度。

总的来说，SEC 体积排阻色谱法是一种重要的分离技术，其流动相的选择和应用领域的扩展都对其分离效果有着重要的影响。

用SEC-MALS测低分子量化合物

用SEC-MALS 测低分子量化合物
使用体积排阻色谱（SEC ）和多角光散射（MALS ）检测器结合，分析了双酚A 的二环氧甘油醚（DGEBA ，摩尔质量为340g/mol ）和4,4’-二羟基二苯甲烷（DHDPM 摩尔质量为200g/mol ）,目的在于检测30mw miniDAWN 检测器的灵敏度和检测下限。

DGEBA 和DHDPM 分别是环氧树脂和酚—甲醛缩合物的低聚体在科学上和实际上是重要的，它们从电子学到自动化的多种工业上得到应用。

图1和2分别表示DGEBA 和DHDPM 的MALS 和DRI 信号。

对两种化合物得到极好的信躁比，这表明在miniDAWN 中30mw GaAs 激光器的灵敏度用于这些极低摩尔质量化合物已足够了。

在低摩尔质量下的可重现性
注入摩尔质量（g/mol ）
DGEBA DHDPM 1 374+4 212+2 2 370+3 215+2 3 368+3 216+2 各化合物三次注入所得摩尔质量列于上表。

使用Optilab 干涉折光仪在与miniDAWN 相同波长，测定比折光指数增量(dn/dc)。

上述数据证实：30mw 激光器（DAWN EOS 相同）是高度灵敏的，甚至对低于500g/mol 化合物得到极好的可重复性和好的准确度。

图1 尽管分子量比400g/mol 还小，30mW miniDAWN 对DGEBA 的反应信号仍很好。

图2尽管分子量比400g/mol 还小，30mW miniDAWN 对
DHDPM 的反应信号仍很好。

2024年度CEMS培训课件

2024/3/23
26
THANKS
感谢观看
2024/3/23
27
案例四
软件故障排除。对软件程序进行调试、修复或重新安装操作系统等方式，解决软件故障导致的系统崩溃或无法正常运行问题。
22
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW ERA
06
性能评估优化提升策略探讨
2024/3/23
23
性能评估指标体系和标准制定
确定性能评估的关键指标
远程监控中心
接收并处理现场传输的数据，实现远程实时监控、数据分析和报警等功能。
系统架构
CEMS通常采用分布式架构，包括现场监测设备、数据传输网络、远程监控中心等组成部分。
现场监测设备
包括气体分析仪、颗粒物分析仪、气象参数监测仪等，用于实时采集污染源排放数据。
数据传输网络
通过有线或无线方式，将现场监测数据传输至远程监控中心。
ERA
2024/3/23
11
软件平台功能介绍
数据采集与传输
支持多种数据源接入，实现实时数据采集和稳定传输。
数据处理与分析
提供丰富的数据处理和分析工具，满足用户多样化的数据分析需求。
2024/3/23
数据存储与管理
提供高效、安全的数据存储机制，支持数据的快速检索和访问。
数据可视化与报表生成
支持多种数据可视化方式，可快速生成各类报表和图形。
通过对系统性能数据的深入分析，找出性能瓶颈所在，为优化提升提供方向。
2024/3/23
制定优化策略
针对性能瓶颈，制定相应的优化策略，如调整系统配置、优化算法、升级硬件等。
设定优化目标

体积排阻色谱法与光散射检测技术联用高效分析蛋白多聚体

静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs ）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。

光散射也是在荧光检测之外蛋白质多聚体的最敏感检测方法之一。

就其尺寸而言，mAb 多聚体产生散射光时比其吸收214或280 nm 的UV 光时更有效率。

尽管如此，与简单的紫外检测相比，光散射并非一种即插即用的技术。

本文提供了一些有助于提高信噪比和整个系统稳定性的建议。

首先，务必保持整个系统清洁并经常更换洗脱溶液。

当使用不含叠氮化钠的缓冲溶液时，应该要每天更换。

当检测对象为蛋白质时，叠氮化钠不会在散射信号中引起任何问题。

因此建议在含水缓冲溶液中加入0.05 %的叠氮化钠，防止细菌生长。

在使用有机溶剂时，对洗脱溶液进行适当的脱气至关重要。

对任何洗脱溶液，无论是有机溶剂还是水溶液，都需要进行彻底过滤。

因为UV 检测不到的气泡和小颗粒，对光散射信号会产生严重干扰。

建议定期更换在线过滤器，并使用0.1 μm 滤膜过滤缓冲溶液，以避免基线噪音。

由于样品自身杂质污染检测器的情况会经常出现，建议在没有安装色谱柱的系统中使用含1 % SDS 的水冲洗4～5小时，接着用水快速排气，并用20 %乙醇和80 %水的混合溶液过夜冲洗。

对于持续的噪音，可以使用样品降解溶剂冲洗系统。

分析蛋白质样品时，蛋白酶可能会有所帮助。

按照色谱柱操作手册中的清洗方法清洗色谱柱，可以减少HPLC 色谱柱产生的噪音。

色谱柱过载也会导致保留时间之外出现样品分子，导致噪音和漂移基线。

TSKgel SW XL 系列色谱柱可使用0.1 M 甘氨酸/盐酸缓冲溶液（pH 3）过夜冲洗以进行有效清洗。

由于系统流速也会影响噪音级别，只可对流速渐进调整。

用4～5倍柱体积的洗脱溶液在运行流速下平衡色谱柱可稳定基线。

1色谱柱：流速：流动相：进样量：检测：HPLC 系统：MALS 检测器：TSKgel G3000SW XL , 5 µm, 7.8 mm ID x 30 cm L ； 1 mL/min ； PBS ； 20 µl ； 90°LS （红色），RI （灰色）和UV @ 280nm （蓝色）； LC-20A prominence, Shimadzu ；minDAWNTM TREOS, Wyatt Technology Corp.时间分钟0.250.200.150.100.050.00SEC-UV-RI-MALS 法高效分析蛋白质多聚体单克隆抗体的SEC-UV-RI-LS 分析应用笔记分析实际上，静态光散射是一种多检测器测试方法，来自于浓度检测器UV 或RI 的浓度信号对其非常重要。

CEMS培训资料

烟气排放连续监测系统培训纲要述概统系测监续连放排气烟章一第概的 MSCE．1 念述描和成组的 MSCE．2求要术技要主 MSCE．3MSCE．4 置位量测和装安点样采和置位样采法方比参．5检 MSCE．6 证保量质测术技量测的用采统系测监续连放排气烟章二第．1 术技量测度浓尘烟术技量测物染污态气．2技量测数参气烟．3 术则细护维的统系测监续连放排气烟章三第放排气烟章四第用使作操的DAS统系测监续连停运和投运时的注意事项统系测监续连放排气烟章五第1. 作工备准的时运停作工备准的前运投2.1烟气排放连续监测系统概述第一章的概念1.CEMSflue for systems monitoring emission Continuous （烟气排放连续监测系统简称）gas 或气态污染物浓度或排放速率所需的全/测定污染源颗粒物和，CEMS 部设备。

它是由采样、测试、数据采集和处理三个子系统组成的监测体系。

采样系统：采集、输送烟气或使烟气与测试系统隔离。

测试系统：检测污染物，显示物理量或污染物浓度。

数据采集、处理系统：采集并处理数据，生成图谱、报表，控制生动操作功能。

的组成和描述2 .CEMSCEMS 是由颗粒物CEMS 烟气烟气参数、）CO或 O（含CEMS或气态污染物/和 22）。

通过采样方式和非采样方式，1测量子系统、数据采集处理子系统组成（图测定烟气中污染物浓度，同时测量烟气温度、烟气压力、流速、流量、烟气含湿;量（或输入烟气含湿量）、烟气含氧量（或二氧化碳含量）计算烟气污染物排图表并通过数据图文传输系统传输至管理显示和打印各种参数、排放量；放率、部门。

2监测系统示意图续烟气排放连1 图3烟气连续在线监测系统示意图2 图主要技术要求CEMS ．3外观要求3.1仪器各部连接可靠，刻度、数,标志和产品铭牌CMC 仪器应有制造计量器具仪器外壳或外罩应耐腐蚀、密封性能良好、防尘、防雨。

,字清晰环境条件3.2仪器在以下环境中应正常工作。

多角度激光光散射联用仪

尺寸排阻色谱-多角度激光光散射联用仪（SEC-MALLS）基本操作步骤一、尺寸排阻色谱（Agilient1100高压液相色谱，示差检测器RID）1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server 程序。

2、打开1100 LC 各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online 图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

添加进样、高压泵、色谱柱、示差检测器各模块。

4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 调用已建立的方法“YJK”（多糖体系），或从“Method”菜单中选择“Edit entire method”项新建方法。

5、把流动相（如0.1M氯化钠）放入溶剂瓶中。

设置泵的流速0.5 mL/min，“Solvent B”处为100，其他均为0。

6、排完气后扭紧排气阀。

以0.2 mL/min的流速装预柱和色谱柱（Shodex系列，根据分子量不同选择合适的柱子803、805、806）。

7、以0.1 mL/min递增的趋势增加泵的流速到0.5 mL/min，单击示差检测器图标，进入Control选项，打开purge阀，平衡示差检测器600-800 min。

8、选择单进样方式进样，进样体积100 μL，进样位置为2号。

从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。

两者区别：Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。

Prefix—在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。

二、多角度激光光散射（DAWN HELEOS II，ASTRA V软件）9、待示差检测器平衡好后，打开DAWN HELEOS II多角度激光光散射检测器，打开软件ASTRA V。

SEC-MALS分子量检测

SEC-MALS分子量检测SEC-MALS（Size Exclusion Chromatography - Multi-Angle Light Scattering）是一种联用尺寸排阻色谱（SEC）和多角度激光散射（MALS）以精确测量分子质量和分子大小的绝对测定技术。

SEC根据不同分子量大小的蛋白通过多孔载体时所用的时间不同实现样品分离，而MALS技术则通过测量每个分子在不同角度下的散射光强度，计算获得分子的质量和大小。

SEC-MALS分析能提供关于分子质量、尺寸、形状和组装状态的准确信息，是深入理解生物大分子的结构和功能的重要工具。

SEC-MALS分子量检测基本原理。

SEC-MALS无需依赖柱校正和标样即可直接测定溶液中的大分子和纳米粒子的分子量和尺寸，被广泛应用于蛋白质、聚糖、聚合物、纳米粒子等的结构和动力学研究，以及生物药物的聚合和变性研究中广泛应用。

百泰派克生物科技BTP基于高效液相色谱仪建立了分子量测定平台，并通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，我们可以为您提供直接的SEC-MALS分子量检测服务，并提供包括方法学建立、验证和转让的完整服务。

实验仪器高效液相色谱（紫外检测器）：Waters 2695/2996。

技术应用可以对混合样品的分子量进行检测，适用于较为复杂的混合样品。

案例示意将准备好的样品加入SEC系统中，大的分子因为无法进入孔隙而先被洗脱出柱，小的分子则因为进入孔隙内部而后被洗脱出柱。

从SEC柱中洗脱的样品接着流入MALS检测器。

MALS检测器通过向样品散射激光并从多个角度测量散射光的强度，可以计算出样品的绝对分子量。

最后通过数据分析软件对MALS原始数据进行分析以获取样品的分子量和聚合度信息。

样品色谱检测示意图示，横坐标为出峰时间，纵坐标为紫外信号值。

分子量检测结果示意图，横坐标为时间，纵坐标为摩尔质量。

样品分子量分布表。

中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。

第二章：体积排阻色谱(GPC)与光散射技术 SEC-MALS

9
SEC - MALS 测定法几点建议
• 对于水相体系，建议使用0.1 µm 对流动相过滤；而对于有机相体系，建议使用0.2 µm 对流动相过滤；
• 使用在线脱气装置（In-line degasser）； • 添加在线过滤器（ In-line membrane filter ）：
水相体系：PEEK 材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器；
© Wyatt Technology Corporation – All Rights Reserved
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
17
数据分析 – Peaks
UV, RI LS
• 单分散性高分子：选峰范围对结果影响很小。 • 多分散性高分子：选峰范围对结果影响较大。
© Wyatt Technology Corporation – All Rights Reserved
基于高分子分子尺寸大小不同而分离的色谱法。（分子尺寸大小： hydrodynamic volume.）
• MALS = Multi-Angle Light Scattering（多角度光散射）
• SEC-MALS: 多角度光散射与体积排阻法联用技术
© Wyatt Technology Corporation – All Rights Reserved
• 逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速；
* 以上建议有助于延长泵、柱子的寿命（即使不使用光散射仪）。
© Wyatt Technology Corporation – All Rights Reserved
10
摩尔质量 - 定义
Number average molar mass: Weight average molar mass:

体积排阻色谱的原理

体积排阻色谱的原理
体积排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特特性，主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，也称为空间排阻色谱法（Steric exclusion chromatography）。

其分离机理是分子的体积排阻。

样品组分和固定相之间原则上不存在相互作用，色谱柱的固定相是具有不同孔径的多孔凝胶，只让临界直径小于凝胶孔开度的分子进入（保留），其孔径大于溶剂分子，所以溶剂分子可以自由地出入。

高聚物分子在溶液中呈无规则线团，线团的体积和分子量有一定的线性关系，对不同大小的溶质分子可以渗透到不同大小的凝胶孔内不同的深度。

因此小的溶质分子保留时间长，洗脱体积大，而大的溶质分子保留时间短，洗脱体积小。

试验四体积排除色谱SEC法测定聚合物的分子量及分子量分布

实验四体积排除色谱(SEC)法测定聚合物的分子量及分子量分布分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。

聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。

体积排除色谱( size exclusion chromatography , SEC)是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。

其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。

采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。

该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。

体积排除色谱在一段时期内常称为凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)、凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography ，GFC )、凝胶色谱。

从分离机理看，使用体积排除色谱较为确切。

一、实验目的：1．了解SEC 法测定高聚物分子量及分子量分布的原理；2．掌握Waters—510 型仪器的操作技术；3．掌握SEC 数据处理方法。

二、基本原理：体积排除色谱(SEC)分离机理认为在多孔载体(其孔径大小有一定的分布，并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球)充填的色谱柱里引入聚合物溶液，用溶剂淋洗，体系是处于扩散平衡的状态。

聚合物分子在柱内流动过程中，不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同，大分子能渗透进去的孔洞数目比小分子少，有些孔洞即使大小分子都能渗透进去，但大分子能渗透的深度浅。

溶质分子的体积越小渗透进去的几率越大，随着溶剂流动，它在柱中保留的时间越长。

如果分子的尺寸超过载体孔的尺寸时，则完全不能渗透进孔里，只能随着溶剂从载体的粒间空隙中流过，最先淋出。

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长，于是整个样品即按分子尺寸由大到小的顺序依次流出。

色谱柱总体积为V t,载体骨架体积为V g，载体中孔洞总体积为V i,载体粒间体积为V o，则V t= V g+ V°+ V iV0 和V i 之和构成柱内的空间。

重组蛋白疫苗SEC-MALS分析

重组蛋白疫苗SEC-MALS分析重组蛋白疫苗是一类不包含完整病原体，并由异源表达系统中生产的特定蛋白质抗原配制而成的一类疫苗。

常见的异源表达系统有：细菌、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等，往往需要根据所生产的抗原种类选择合适的异源表达系统。

重组蛋白疫苗由于其具有安全性好、稳定性强以及成本较低等几大优势，近年来也受到研究者们的广泛青睐。

目前，重组蛋白疫苗已被广泛应用于多种传染病，如预防乙型病毒性肝炎（即乙肝）、破伤风、百日咳、流行性感冒等等。

疫苗研究生产过程中，分析疫苗质量和净度的步骤尤为重要，而尺寸排阻色谱联用多角度光散射（SEC-MALS）分析就是其中一种极其重要的工具。

SEC-MALS是一种能够测量蛋白质分子大小和分子量的技术。

首先，蛋白质样品通过尺寸排阻色谱柱（SEC）分离。

SEC基于分子大小实现分离，大分子因阻碍大而通过色谱柱的时间较长，而小分子则可以进入色谱柱的孔洞中，因此通过的时间较短。

然后，从色谱柱出来的蛋白质流经一个多角度光散射（MALS）检测器，利用散射光的强度和散射光的角度分布来测定蛋白质的分子量和大小。

生物药物表征SEC-MALS分析示意图。

通过SEC-MALS，我们可以得到重组蛋白疫苗的详细分子信息，包括其大小、形状和组装状态等，从而评估其质量和功效。

此外，由于SEC-MALS技术可以在无标记、无破坏的情况下进行分析，所以可以避免疫苗在分析过程中的损失或损害，确保其完整性和活性。

百泰派克生物科技（BTP）采用ISO9001认证质量控制体系管理实验室，获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务。

我们基于现有的理化分析平台和结构表征平台，为您提供一站式的重组蛋白疫苗SEC-MALS 分析，只需要将您的实验目的告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责所有项目后续，包括样品处理、上机分析、数据分析和项目报告。

欢迎免费咨询。

百泰派克生物科技传统疫苗表征内容。

8-4 液相色谱之体积排阻色谱

体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。

SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。