基于GC_TOFMS测定技术的Wistar大鼠血浆代谢谱增龄性变化研究
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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (10): 1095−1101
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基于 GC/TOFMS 测定技术的 Wistar 大鼠血浆代谢谱增龄性变化研究
黄 闫 青 1, 2, 陆益红 1, 2, 王广基 2*, 王新文 3, 孟 鑫 3, 张 颖 2, 刘林生 2, 郝 刚 2, 严 楠 3, 高 洁 3, 卢 迪 3,
(1. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China; 2. Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 3. China Pharmaceutical University – the Members of University Students Practices and Innovation Programme, Nanjing 210009, China)
Metabonomic profiling of plasma metabolites in Wistar rats to study the effect of aging by means of GC/TOFMS-based techniques
HUANG Qing1, 2, LU Yi-hong1, 2, WANG Guang-ji2wenku.baidu.com, WANG Xin-wen3, MENG Nan3, GAO Jie3, LU Di3, YAN Xin3, ZHANG Ying2, LIU Lin-sheng2, HAO Gang2, YAN Bei2, GU Sheng-hua2, A Ji-ye2
收稿日期: 2009-05-04. * 通讯作者 Tel: 86-25-83271128, E-mail: guangjiwang@hotmail.com
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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (10): 1095−1101
代谢组学 (metabonomics)[1] 是关于生物体系内 源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。通过分 析机体体液和组织中成百上千种代谢组分的变化 , 研究机体整体生物学状况和功能调节 , 从而认识以 生物体内源性物质为基础的整体的、内在的、本质的 状态。其研究对象主要是生物体液, 如尿液、血液等, 其主要手段是 NMR、GC/MS、LC/MS 等分析技术与 模式识别技术的结合。 代谢组是机体内所有小分子物质的总称 , 反映 了机体小分子物质组成的状况 , 所有对机体有影响 的因素, 如基因、 环境、 药物/毒物等对机体的作用最 终都会反映在代谢组的改变中, 对代谢组的表现 (代谢表型) 产生影响。 因此, 作者认为代谢组是评价 机体健康和药物治疗效果的合适的分子集合 。对于 不同动物模型的代谢组学研究是疾病、药效、药物毒 性代谢组学研究的基础 , 目前已开展的工作主要有 对不同种属、品系动物模型的代谢状态的比对; 动物 突变体异常代谢表型研究 ; 疾病模型动物和正常动 物的代谢组比较; 鉴别和确证药理和疾病模型等
及数据解析依照已建立的基于气相色谱 / 飞行时间 质谱测定技术的代谢组学研究方法进行[17, 。1 µL 衍生化样品无分流进样 , Agilent 7683 自动进样器 (Agilent, China, GA); Agilent 6890 GC; 毛细管柱 10 m × 0.18 mm, 0.18 μm DB-5-MS 固定相 (J&W scientific, Folsom, CA); 进样口温度 250 ℃; 载气氦 气流速 1 mL·min−1, 吹扫时间为 60 s, 吹扫流速为 20 mL·min−1, 平衡时间为 1 min; 采用程序升温模式, 柱 温初始值设定为 70 ℃, 维持 2 min, 然后从 70 ℃以 30 ℃·min−1 的速度升温至 310 ℃, 保持 2 min。毛细 管柱流出组分进入 Pegasus III TOFMS 离子源 (Leco Corp.St Joseph, MI)。 传输管温度设定为 250 ℃, EI 离 子源 (electron impact ionization) 温度为 200 ℃。离 子化电压为 −70 eV, 电流 2.0 mA, MS 采用全扫描方 式进行数据采集 , 扫描范围 50～800 m/z, 采集速度 为 20 pectra/s, 溶剂延迟 170 s, 检测电压 −1 650 V。 利用 ChromaTOF 2.0 软件 (Leco Corp.) 自动对 峰进行检测, 对内标及化合物峰面积进行计算。软件 计算标准 : 自动峰检测和质谱图去卷积法中的峰宽
蓓 2, 顾胜华 2, 阿基业 2
(1. 江苏省食品药品检验所, 江苏 南京 210008; 2. 中国药科大学药物代谢动力学重点实验室, 江苏 南京 210009; 3. 中国药科大学-大学生实践创新训练计划项目成员, 江苏 南京 210009) 摘要: 研究 Wistar 大鼠血浆中小分子化合物随生长而产生的增龄性差异, 揭示实验大鼠生长过程中机体内 源性物质基础的变化规律。运用基于 GC/TOFMS 检测技术的代谢组学方法, 分析 Wistar 模型大鼠 12、14、16、 18 及 20 周龄时血浆中内源性小分子代谢物, 经数据处理和模式识别后, 不同周龄组的大鼠可被清晰区分并呈明 显的动态变化轨迹。血浆中柠檬酸、乌头酸、十六碳烯酸、苯丙氨酸、羟脯氨酸、α-生育酚、精氨酸等代谢产 物的相对含量发生了明显改变, 提示为潜在的生物标志物, 这些化合物与能量代谢、脂质过氧化、抗氧化平衡等 密切相关。本研究一方面为探索实验大鼠生长过程中的生理变化及生物学本质提供了基础信息 , 此外还发现即 便是生理学上正常的动物, 其体内代谢水平 (随生长有一定改变) 也不是恒定不变的, 提示在利用代谢组学、生 物标志物评价药物毒性和药效时, 需结合正常对照组的动态变化规律, 以便作出独立于生长因素的正确判断。 关键词: 代谢组学; 生长; 气相色谱/飞行时间质谱 中图分类号: R969.1 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2009) 10-1095-07
Abstract: The global metabolite profiles of endogenous compounds of Wistar rats from 12 to 20 weeks old were investigated to take deep insight into and get better understanding of the pathogenesis of development and aging. Plasma from Wistar rats at 12, 14, 16, 18, and 20 weeks old were analyzed using GC/TOFMS. Multivariate data analysis was then used to process the metabonomic data which indicated excellent separation between different weeks and showed that the metabolic profiles of the samples changed with age, enabling age-related metabolic trajectories to be visualized. Decreased concentrations of citric acid, cis-aconitic acid, 9-(z)-hexadecenoic acid along with increased levels of hexanedioic acid, α-tocopherol, 3-indole propionic acid, etc contributed to the separation. Several major metabolic pathways were identified to be involved in metabolic regulation. This suggests that GC/TOFMS-based metabonomics is a powerful alternative approach to identifying potential biomarkers and investigating the physiological developments of aging and it is important to employ suitable age-match control group in metabonomic study of physiological monitoring, drug safety assessment, and disease diagnosis, etc. Key words: metabonomics; development of aging; GC/TOFMS
[3−6] [2]
(C8−C40, Fluka); 吡 啶 (Fluka); MSTFA+1% TMCS (Pierce); 甲醇 (Tedia); 正庚烷 (Merck)。 GC/TOFMS 联用仪 (Leco); 减压浓缩装置 (Thermo); 高速冷冻 离心机 (SORVALL® Biofuge stratos)。 实验动物和血样采集 雄性 Wistar 大鼠购自北 京维通利华公司 (许可证号: SCXK- (京) 2007-0001), 8 周龄, 体重 (220 ± 13) g。 饲养 4 周待大鼠完全适应 环境, 于 12、14、16、18 及 20 周龄时, 分别从眼眶 静脉丛取全血约 250 µL, EDTA 抗凝, 4 000 r·min−1 离 心 10 min 后精密转移血浆 100 µL 于 Eppendorf 管中, 置 −80 ℃保存。 血浆的处理及衍生化 测定时, 血浆经 37 ℃解 冻 15 min, 100 µL 血浆中加入甲醇 (含内标甲基肉蔻 酸 0.5 mg·mL−1) 400µL, 涡旋提取 5 min, 4 ℃静置 1 h, 20 000 r·min−1 离心 10 min, 取上清液 100 µL 于 GC 小瓶中, 减压挥干溶剂。向 GC 小瓶中加入甲氧胺吡 啶溶液 (15 µg·mL−1) 30 µL, 涡旋 4 min, 肟化反应 17 h。在样品中加入 MSTFA (含 1% TMCS 作为催化 剂) 30 µL, 涡旋 1 min, 三甲硅烷基化反应 1 h。最后 加入外标甲基硬脂酸庚烷液 (30 µg·mL−1) 30 µL, 涡 旋 4 min 后即作为待测样品。 GC/TOFMS 数据采集和处理 GC/TOFMS 检测
18]
。
现已证明多种生理条件、 环境因素的改变会影响动物 体液中的代谢物的组成和水平 , 如内源性因素 : 性 别、年龄、激素水平、遗传差异性、肠道菌群等[7−11]。 国内外一些研究者在对抗衰老药物筛选、 肥胖小鼠模 型、 人种间差异的多项代谢组学研究中[12−16], 逐渐发 现了长期实验中代谢组经时漂移的问题。 这些研究和 发现均基于对尿液样本的 NMR[12−15]及 LC/MS[13−16] 分析, 而基于 GC/TOFMS 的、对实验大鼠生长过程 中血浆代谢谱变化规律及相关生物标志物变化规律 的系统研究至今未见报道。因此, 建立和完善生理条 件下对动物模型代谢谱变化规律的正确认识 , 是研 究各种病理条件或机体对外源性刺激 ( 包括药物和 病源等) 干预的基本前提, 也将为生长老化相关生物 标志物的探索提供依据。 本文运用已建立的基于气相色谱 /飞行时间质谱 (GC/TOFMS) 测定技术的代谢组学研究方法 [17−20], 对 Wistar 大鼠 12～20 周龄间血浆中内源性代谢物的 变化进行表征和辨识 , 寻找与鼠龄增长相关的体内 代谢组差异 , 揭示生长老化所对应机体内源性物质 基础的变化。
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基于 GC/TOFMS 测定技术的 Wistar 大鼠血浆代谢谱增龄性变化研究
黄 闫 青 1, 2, 陆益红 1, 2, 王广基 2*, 王新文 3, 孟 鑫 3, 张 颖 2, 刘林生 2, 郝 刚 2, 严 楠 3, 高 洁 3, 卢 迪 3,
(1. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China; 2. Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 3. China Pharmaceutical University – the Members of University Students Practices and Innovation Programme, Nanjing 210009, China)
Metabonomic profiling of plasma metabolites in Wistar rats to study the effect of aging by means of GC/TOFMS-based techniques
HUANG Qing1, 2, LU Yi-hong1, 2, WANG Guang-ji2wenku.baidu.com, WANG Xin-wen3, MENG Nan3, GAO Jie3, LU Di3, YAN Xin3, ZHANG Ying2, LIU Lin-sheng2, HAO Gang2, YAN Bei2, GU Sheng-hua2, A Ji-ye2
收稿日期: 2009-05-04. * 通讯作者 Tel: 86-25-83271128, E-mail: guangjiwang@hotmail.com
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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (10): 1095−1101
代谢组学 (metabonomics)[1] 是关于生物体系内 源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。通过分 析机体体液和组织中成百上千种代谢组分的变化 , 研究机体整体生物学状况和功能调节 , 从而认识以 生物体内源性物质为基础的整体的、内在的、本质的 状态。其研究对象主要是生物体液, 如尿液、血液等, 其主要手段是 NMR、GC/MS、LC/MS 等分析技术与 模式识别技术的结合。 代谢组是机体内所有小分子物质的总称 , 反映 了机体小分子物质组成的状况 , 所有对机体有影响 的因素, 如基因、 环境、 药物/毒物等对机体的作用最 终都会反映在代谢组的改变中, 对代谢组的表现 (代谢表型) 产生影响。 因此, 作者认为代谢组是评价 机体健康和药物治疗效果的合适的分子集合 。对于 不同动物模型的代谢组学研究是疾病、药效、药物毒 性代谢组学研究的基础 , 目前已开展的工作主要有 对不同种属、品系动物模型的代谢状态的比对; 动物 突变体异常代谢表型研究 ; 疾病模型动物和正常动 物的代谢组比较; 鉴别和确证药理和疾病模型等
及数据解析依照已建立的基于气相色谱 / 飞行时间 质谱测定技术的代谢组学研究方法进行[17, 。1 µL 衍生化样品无分流进样 , Agilent 7683 自动进样器 (Agilent, China, GA); Agilent 6890 GC; 毛细管柱 10 m × 0.18 mm, 0.18 μm DB-5-MS 固定相 (J&W scientific, Folsom, CA); 进样口温度 250 ℃; 载气氦 气流速 1 mL·min−1, 吹扫时间为 60 s, 吹扫流速为 20 mL·min−1, 平衡时间为 1 min; 采用程序升温模式, 柱 温初始值设定为 70 ℃, 维持 2 min, 然后从 70 ℃以 30 ℃·min−1 的速度升温至 310 ℃, 保持 2 min。毛细 管柱流出组分进入 Pegasus III TOFMS 离子源 (Leco Corp.St Joseph, MI)。 传输管温度设定为 250 ℃, EI 离 子源 (electron impact ionization) 温度为 200 ℃。离 子化电压为 −70 eV, 电流 2.0 mA, MS 采用全扫描方 式进行数据采集 , 扫描范围 50～800 m/z, 采集速度 为 20 pectra/s, 溶剂延迟 170 s, 检测电压 −1 650 V。 利用 ChromaTOF 2.0 软件 (Leco Corp.) 自动对 峰进行检测, 对内标及化合物峰面积进行计算。软件 计算标准 : 自动峰检测和质谱图去卷积法中的峰宽
蓓 2, 顾胜华 2, 阿基业 2
(1. 江苏省食品药品检验所, 江苏 南京 210008; 2. 中国药科大学药物代谢动力学重点实验室, 江苏 南京 210009; 3. 中国药科大学-大学生实践创新训练计划项目成员, 江苏 南京 210009) 摘要: 研究 Wistar 大鼠血浆中小分子化合物随生长而产生的增龄性差异, 揭示实验大鼠生长过程中机体内 源性物质基础的变化规律。运用基于 GC/TOFMS 检测技术的代谢组学方法, 分析 Wistar 模型大鼠 12、14、16、 18 及 20 周龄时血浆中内源性小分子代谢物, 经数据处理和模式识别后, 不同周龄组的大鼠可被清晰区分并呈明 显的动态变化轨迹。血浆中柠檬酸、乌头酸、十六碳烯酸、苯丙氨酸、羟脯氨酸、α-生育酚、精氨酸等代谢产 物的相对含量发生了明显改变, 提示为潜在的生物标志物, 这些化合物与能量代谢、脂质过氧化、抗氧化平衡等 密切相关。本研究一方面为探索实验大鼠生长过程中的生理变化及生物学本质提供了基础信息 , 此外还发现即 便是生理学上正常的动物, 其体内代谢水平 (随生长有一定改变) 也不是恒定不变的, 提示在利用代谢组学、生 物标志物评价药物毒性和药效时, 需结合正常对照组的动态变化规律, 以便作出独立于生长因素的正确判断。 关键词: 代谢组学; 生长; 气相色谱/飞行时间质谱 中图分类号: R969.1 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2009) 10-1095-07
Abstract: The global metabolite profiles of endogenous compounds of Wistar rats from 12 to 20 weeks old were investigated to take deep insight into and get better understanding of the pathogenesis of development and aging. Plasma from Wistar rats at 12, 14, 16, 18, and 20 weeks old were analyzed using GC/TOFMS. Multivariate data analysis was then used to process the metabonomic data which indicated excellent separation between different weeks and showed that the metabolic profiles of the samples changed with age, enabling age-related metabolic trajectories to be visualized. Decreased concentrations of citric acid, cis-aconitic acid, 9-(z)-hexadecenoic acid along with increased levels of hexanedioic acid, α-tocopherol, 3-indole propionic acid, etc contributed to the separation. Several major metabolic pathways were identified to be involved in metabolic regulation. This suggests that GC/TOFMS-based metabonomics is a powerful alternative approach to identifying potential biomarkers and investigating the physiological developments of aging and it is important to employ suitable age-match control group in metabonomic study of physiological monitoring, drug safety assessment, and disease diagnosis, etc. Key words: metabonomics; development of aging; GC/TOFMS
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(C8−C40, Fluka); 吡 啶 (Fluka); MSTFA+1% TMCS (Pierce); 甲醇 (Tedia); 正庚烷 (Merck)。 GC/TOFMS 联用仪 (Leco); 减压浓缩装置 (Thermo); 高速冷冻 离心机 (SORVALL® Biofuge stratos)。 实验动物和血样采集 雄性 Wistar 大鼠购自北 京维通利华公司 (许可证号: SCXK- (京) 2007-0001), 8 周龄, 体重 (220 ± 13) g。 饲养 4 周待大鼠完全适应 环境, 于 12、14、16、18 及 20 周龄时, 分别从眼眶 静脉丛取全血约 250 µL, EDTA 抗凝, 4 000 r·min−1 离 心 10 min 后精密转移血浆 100 µL 于 Eppendorf 管中, 置 −80 ℃保存。 血浆的处理及衍生化 测定时, 血浆经 37 ℃解 冻 15 min, 100 µL 血浆中加入甲醇 (含内标甲基肉蔻 酸 0.5 mg·mL−1) 400µL, 涡旋提取 5 min, 4 ℃静置 1 h, 20 000 r·min−1 离心 10 min, 取上清液 100 µL 于 GC 小瓶中, 减压挥干溶剂。向 GC 小瓶中加入甲氧胺吡 啶溶液 (15 µg·mL−1) 30 µL, 涡旋 4 min, 肟化反应 17 h。在样品中加入 MSTFA (含 1% TMCS 作为催化 剂) 30 µL, 涡旋 1 min, 三甲硅烷基化反应 1 h。最后 加入外标甲基硬脂酸庚烷液 (30 µg·mL−1) 30 µL, 涡 旋 4 min 后即作为待测样品。 GC/TOFMS 数据采集和处理 GC/TOFMS 检测
18]
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现已证明多种生理条件、 环境因素的改变会影响动物 体液中的代谢物的组成和水平 , 如内源性因素 : 性 别、年龄、激素水平、遗传差异性、肠道菌群等[7−11]。 国内外一些研究者在对抗衰老药物筛选、 肥胖小鼠模 型、 人种间差异的多项代谢组学研究中[12−16], 逐渐发 现了长期实验中代谢组经时漂移的问题。 这些研究和 发现均基于对尿液样本的 NMR[12−15]及 LC/MS[13−16] 分析, 而基于 GC/TOFMS 的、对实验大鼠生长过程 中血浆代谢谱变化规律及相关生物标志物变化规律 的系统研究至今未见报道。因此, 建立和完善生理条 件下对动物模型代谢谱变化规律的正确认识 , 是研 究各种病理条件或机体对外源性刺激 ( 包括药物和 病源等) 干预的基本前提, 也将为生长老化相关生物 标志物的探索提供依据。 本文运用已建立的基于气相色谱 /飞行时间质谱 (GC/TOFMS) 测定技术的代谢组学研究方法 [17−20], 对 Wistar 大鼠 12～20 周龄间血浆中内源性代谢物的 变化进行表征和辨识 , 寻找与鼠龄增长相关的体内 代谢组差异 , 揭示生长老化所对应机体内源性物质 基础的变化。