Candidalypolytica脂肪酶催化布洛芬酯对映选择性水解

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亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的高水平重组表达、分子体外进化研究及其在手性拆分中的应用

亚罗解脂假丝酵母脂肪酶的高水平重组表达、分子体外进化研究及其在手性拆分中的应用脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)是一种重要的工业酶类,广泛应用于食品、油脂化工、制药和有机合成工业中,酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点,具有巨大的应用潜力。

本实验室培育的亚罗解脂假丝酵母Candida sp.99-125所生产的胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)活性高、催化活性强,已经被成功应用于油脂改性、多元醇酯合成、手性化合物拆分和可替代能源(生物柴油)合成等等,是工业生产中重要的催化剂。

为了进一步促进和拓展假丝酵母脂肪酶YlLip2的商业化应用和生产,本文主要进行了如下工作：1、研究了固定化假丝酵母脂肪酶YlLip2用于外消旋α-苯乙胺的动力学拆分。

本实验中,本文首次利用了含有机助剂的介质作为脂肪酶催化外消旋β-苯乙胺发生选择性酰基化反应的体系,实现了外消旋α-苯乙胺两种对映体的拆分。

在动力学拆分的过程中,脂肪酶YlLip2具有R型对映体优先选择性且对映体过量值由于3%(v/v)极性有机助剂DMSO的加入得到了显著增长,对映体过量值(e.e.p)由0.35增长到了0.96,对映体比率(E)提高约20倍,最终达到190；而E值大于50一般即认为具有工业应用价值。

这是该酶首次应用于手性胺类的拆分。

2、由于芽孢杆菌具有高效、功能性表达外源蛋白的优势,本文研究了假丝酵母脂肪酶YlLip2在枯草芽孢杆菌(Bacillus su btilis)体系中的重组表达策略。

首先,构建了基于游离型质粒的表达平台。

通过分离、克隆了多个枯草芽胞杆菌内的表达元件,包括组成型启动子(PdegQ、PglpD和PaprE)和诱导型启动子(PamyE、 PsacB),以及α-淀粉酶的信号肽和终止子序列,构建了一系列新的分泌型表达质粒。

质粒中插入脂肪酶基因YlLip2后,转化蛋白酶缺失型的枯草芽胞杆菌DL3p菌株,实现了重组脂肪酶的分泌性表达,胞外酶活表达水平达到0.2-4.5U/mg总蛋白。

Candida sp. 99-125脂肪酶及其在化学品合成中的应用

（京化工大学生命科学与技术学院，北京１０２；华大学化学工程系，北京１０８）北００９清００４
摘要：传统的酯化或转酯化产品的合成通常需要高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件，脂肪酶由于其生物催化过程具有高效、高选择性、条件温和和环境友好等特点，在化学品的合成中越来越受到人们的关注。本课题组开发了一种可以用于酯类合成的新脂肪酶，并且实现了该酶的工业化生产。来源于Ｃｎｉａｓ．９１５的脂肪酶ａｄｄｐ９－２在非水相中对酯化和转酯化反应具有高效的催化活性和稳定性。本文介绍了该脂肪酶的发酵生产及其在中长链脂肪酸酯、二元酸酯、维生素Ａ棕榈酸酯、手性化合物以及生物柴油等多种化学品的合成中的应用。
第６卷１
第７期
化
工学
报
．７ＶｏＮｏＬ６１Ｏ１Ｊｌ２Ｏｕｙ
２１００年７月
ห้องสมุดไป่ตู้ＣＩＣＪｕｎｌＥＳｏｒａ
Ｃｎｉａｓ．９１５脂肪酶及其在化学品ａｄｄｐ９ — ２
合成中的应用
谭天伟陈必强，
在非水相中脂肪酶lipase能催化酯proftantianweimailbucteducn合成酯交换反应聚酯合成以及酰胺合成等其中有些产品往往是用化学方法难以得到的而在常温常压下利用脂肪酶催化却能一举成功前脂肪酶催化以其高效性高选择性环境友好性以及催化底物广泛酯酸醇酰胺等都可以成为它的底物的优势成为国内外研究的热点领域在酯化产品合成油脂改性手性拆分以及生物柴油合成等方面有广泛的应用建立酶法合成工艺的首要问题是寻找高效低成本的催化剂酶

脂肪酶

脂肪酶催化药物合成院系：化工学院班级： 2009级制药工程2班学号： 20009650818姓名：李红霞脂肪酶催化药物合成摘要：将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分等研究。

常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。

从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。

关键词：脂肪酶；酶催化；手性拆分；药物合成；应用一、综述脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。

在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。

脂肪酶结构有2个特点：(1) 脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser- W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；(2) 活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护。

脂肪酶的特性脂肪酶底物专一性酶的底物专一性取决于酶分子结构，脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成。

活性中心靠近分子疏水端。

不同来源的脂肪酶存在着结构上的差异，使得不同的来源的脂肪酶有不同的底物专一性。

1.1来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

微乳液凝胶固定化脂肪酶催化消旋布洛芬辛酯水解反应的研究

摘要：初步研究了ＡＴ一正庚烷一明胶微乳液凝胶固定化脂肪酶催化消旋布洛芬辛酯水解反应的影响因素。结果Ｏ表明：在正庚烷中，布洛芬辛酯水解反应能够顺利进行，产物为光学纯度很高的ｓ一构型布洛芬，转化率为０３１．２７时，其对映体过量值为０９２；．８６凝胶Ｒ值（与ＡＴ的摩尔数之比）水Ｏ对酶催化反应有较大影响，佳Ｒ值为７；最３当酶含量固定，物浓度为０１］Ｌ时，底．０ｍｏ／转化率最大并能得到较高对映体过量值的产物；当反应时间超过１，６ｈ时水解反应达到平衡；固定化酶的重复使用次数与溶剂中的含水量有关，庚烷中少量的水有助于增加酶的重复使正
（．ＣｌｇｆＣｅｉｒｎｔｒｌｃｅｃ，Ｓａｄｎｒｃｌｒｌｎｖｒｔ，ａａ７０８，ｈｎ；１ｏｌｅｏｈｍｓｙａｄＭａｉｉｅｈｎｏｇＡｇｉｔａｉｓｙＴｉ２１１ＣｉａｅｔｅａＳｎｕｕＵｅｉｎ２ｎｔｕｅｏＰａｍａｕｉｓＳｈｏｏＰａｍｃｕｉｌｃｎｅｈｎｏｇＵｉｒｉ，Ｊａ２０１．Ｉｓｔｔｆｈｒｃｔ，ｃｏｌｆｈｒａｅｔａｉｃ，Ｓａｄｎｎｖｓｔｉｎ５０２，ＣｉａｉｅｃｃＳｅｅｙｎｈｎ）
ａｔｏｏｖ￣ｉｎａｉｓｔｅｍａｉｍｔｉｈｒｅｎｏｒｃｅｃｓｖｌｅｏｒｄｃｓｌｐａｅｃｎｅｒ — ｃｉｎｃｎｅｏｒｔｏｗａｈｘｍｕｗｉｈｈｇｅｎａｆｍｅｘｅｓａｕｆｐｏｕｔａｉｓｏｃｎｔａｉｉ

脂肪酶催化红花油水解的选择性研究

器．１３分离及检测方法．
１３１水解产物中脂肪酸与混合酯的分离方法．．
向洗去酶粉后的水解产物中加入酚酞指示剂，入０５ｍｏ／加．ｌＬＫＯＨ／乙醇至溶液呈深红色，ＫＯＨ优先与脂肪酸（Ｆ形成水溶性皂，ＦＡ）加入适量水、正己烷及适量乙醇，液中脂肪酸皂与混合酯分离；溶上
择性．
关键词：花油；脂肪酶；水解；选择性红中图法分类号：１．Ｑ８４９文献标识码：Ａ
０引言
酶催化反应的选择性有很好的实用价值，年来日益受到人们的重视．年来对酶的选择性的研究主近近要集中在立体选择性及对映体的拆分上，对水解中酶的位置选择性和脂肪酸类型选择性的研究鲜而有报道．文所用脂肪酶ＬｐｓＶＫ来源于黑曲霉，本ｉａｅＬ文献对其专一性的报道并不一致．另外，肪酶Ｉ脂ｐｓ — １ａｅＦＡＰ５是一种ｓ一，选择性脂肪酶，ｎ１３位其选择性水平有待研究．本文对脂肪酶ＬｐｓＶＫ、ｉａｅｉａｅＬＬｐｓ
花油水解，试了水解产物中脂肪酸与酯的碘值及酯中单甘酯的含量，究了脂肪酶对脂肪酸测研种类的选择性以及对甘油酯键位置的选择性．果表明，肪酶ＬｐｓＶＫ、Ｌｐｓ结脂ｉａｅＬｉａｅＡＹ３Ｇ没有位置选择性和脂肪酸选择性，Ｌｐｓ — １０而ｉａｅＦＡＰ５无脂肪酸选择性，有一定的位置选但

亲水-疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的研究

亲水-疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的研究胡彧，王玉军*，高思亮，骆广生，戴猷元（清华大学化工系化学工程国家重点联合实验室）摘要:布洛芬是一种广泛应用的解热镇痛药，其分子具有手性。

酶法动力学拆分利用脂肪酶催化布洛芬酯不对称水解实现手性对映体的分离。

由于脂肪酶具有特殊的界面特性，因此，复合膜作为脂肪酶固定化的载体有很大优势。

本文提出了利用亲水-疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的方法。

其中，疏水层为PTFE材料的疏松多孔层；亲水层为CA材料的致密超滤层。

使用复合酶膜反应器对固定化酶催化布洛芬乙酯不对称水解的操作条件和规律进行了研究。

通过对底物浓度、酶用量、温度、pH条件的研究，得到了反应最佳操作条件。

同时，通过与乳液体系实验的对比，发现固定化酶酶活保留率达65%以上，半衰期达183h，比游离态酶增长约384.4%。

进一步证明了固定化酶用于催化布洛芬手性拆分的优势。

关键词:布洛芬手性拆分复合膜脂肪酶固定化1.概述布洛芬（Ibuprofen）是一种广泛应用的非甾体类解热镇痛药，药效显著、毒副作用小，已成为全球最畅销的非处方药之一[1，2]。

布洛芬分子具有手性，常规方法合成的布洛芬分子是手性对映体S-(+)-布洛芬和R-(-)-布洛芬的等量混合物。

药理研究表明[3，4]，S-(+)-布洛芬的药理活性是R-(-)-布洛芬的约160倍，而布洛芬的毒副作用却主要由R-(-)-布洛芬引起的，因此，对布洛芬进行手性拆分具有很强的实际意义。

目前广泛应用的布洛芬的手性拆分工艺主要通过脂肪酶催化外消旋布洛芬酯不对称水解实现，其正反应式如下[4]：图1 布洛芬酯的酶促水解反应由于某些脂肪酶催化 (S)-布洛芬酯水解的速率远远大于 (R)-布洛芬酯，且 (S)-布洛芬在水中有更大的溶解度，因此能够实现布洛芬的手性拆分。

酶的优势是高效，低能耗，条件温和专一性强，但也具有对环境敏感、只能催化间歇反应和回收困难的缺点，为了解决这些问题，引入了酶的固定化。

一种立体选择性酶催化酯化拆分布洛芬对映体的方法[发明专利]

专利名称：一种立体选择性酶催化酯化拆分布洛芬对映体的方法
专利类型：发明专利
发明人：唐课文,袁欣,张盼良,许卫凤
申请号：CN201811103860.2
申请日：20180921
公开号：CN109295154A
公开日：
20190201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本专利介绍了获得(R)‑布洛芬对映体的一种新的手性拆分方法，即脂肪酶催化立体选择性酯化布洛芬对映体拆分布洛芬单一对映体的方法。

利用来自米黑根毛霉的Novozym®40086脂肪酶，高选择性、高催化效率酯化外消旋布洛芬从而获得高光学纯度的(R)‑布洛芬。

获得的(R)‑布洛芬的对映体过量值达到了93.78%，收率为62.20%，此时外消旋布洛芬的总转化率为67.90%。

与其它方法相比，该方法具有反应浓度高、反应速率快、产品光学纯度高、操作及后处理简单、成本低、生产过程绿色环保等优点，实现了布洛芬的高效手性拆分。

申请人：湖南理工学院
地址：414000 湖南省岳阳市岳阳楼区奇家岭街道439号
国籍：CN
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一种立体选择性酶催化水解拆分α-环戊基苯乙酸对映体的方法[发明专利]

专利名称：一种立体选择性酶催化水解拆分α-环戊基苯乙酸对映体的方法
专利类型：发明专利
发明人：唐课文,袁欣,张盼良,成晴
申请号：CN201811472692.4
申请日：20181204
公开号：CN109457011A
公开日：
20190312
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本专利公开了一种手性拆分α‑环戊基苯乙酸的方法。

该方法利用脂肪酶的高效选择性，在水相介质中通过催化水解外消旋α‑环戊基苯乙酸酯，获得(S)‑α‑环戊基苯乙酸。

该方法采用的脂肪酶价格低廉，选择性高，其产物光学纯度≥95%。

在反应体系中加入表面活性剂，可加快反应速率，提高转化率。

与其他拆分技术相比，该反应条件温和，无需有机溶剂，环境污染小。

申请人：湖南理工学院
地址：414000 湖南省岳阳市岳阳楼奇家岭街道439号
国籍：CN
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离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究

目录摘要 (1)1 前言 (2)1.1脂肪酶简介 (2)1.2离子液体概述 (3)1.3酯化反应 (4)1.4本论文选题目的和意义及主要内容 (5)2 实验部分 (5)2.1实验材料 (5)2.2酶催化拆分反应 (5)2.3产物分析 (5)2.4对映选择性的计算 (6)3 结果与讨论 (6)3.1酶的筛选 (6)3.2异辛烷和[BMIM][PF6]溶液比例的影响 (8)3.3反应时间的影响 (9)3.4酶的负载效应 (10)4 结论 (11)参考文献 (12)谢辞 (13)离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究摘要：在分别含有[BMIM][PF6]和[BMIM][BF4]两种离子液体的体系中，将两种天然酶和四种商品酶用于拆分布洛芬的反应。

与纯异辛烷相比，在含有离子液体的异辛烷体系中脂肪酶表现出较高的转化率。

虽然，柱状假丝酵母菌商品酶的对映体选择性（E=8.5）相比其他酶高，但还有另一种天然脂肪酶，同样具有良好的对映体选择性（E=4.6）。

通过反应条件的优化（异辛烷/离子液体的比例，酶量和反应时间），AN脂肪酶(15%w/v)在[BMIM][PF6]：异辛烷=1:1体系中反应96小时后可以获得更高的对映体选择性（E=9.2）。

关键词：脂肪酶；布洛芬；离子液体Esterification of (R, S)-Ibuprofen by native and commercial lipases in a two-phase system containing ionic liquidsHou Lei-lei( College of Chemistry and Chemical Engineering, Baoji University of Arts and Sciences, Baoji 721013 China )Abstract:Four commercially available lipases and two native lipases from Aspergillus niger AC-54 and Aspergillus terreus AC-430 were used for the resolution of (R, S)-Ibuprofen in systems containing the ionic liquids [BMIM][PF6] and [BMIM][BF4]. The lipases showed higher conversion in a two-phase system using [BMIM][PF6] and isooctane compared to that in pure isooctane. Although the best enzyme was a commercially available lipase from Candida rugosa (E =8.5), another native lipase, produced in our laboratory, from A niger gave better enantioselectivity (E= 4.6) than the other lipases tested (E=1.9-3.3). After thorough optimization of several reaction conditions (type and ratios of isooctane/ionic liquid, amount of enzyme, and reaction time), the E-value of A. niger lipase (15% w/v) could be duplicated (E= 9.2) in a solvent system composed of [BMIM][ PF6] and isooctane (1:1) after 96 h of reaction.Keywords: lipases, Ibuprofen，ionic liquid1.前言1.1 脂肪酶简介脂肪酶( Lipase EC3，甘油酯水解酶)是一类水解油酯的酶类。

布洛芬工艺合成简介

10
酸化脱羧
将3-（4-异丁苯基）-2,3-环氧丁酸钠压入脱羧釜中，慢慢滴加计量的盐酸，控制釜内的温度60 ℃ ，加毕，物料温度升至100 ℃ 以上，回流脱羧3h后降温，静置2h分层，有机层吸入蒸馏釜，减压蒸馏，收集 120~128 ℃每2kpa馏分，即得2-（4-异丁苯基）丙醛，收率77~80%.
石油醚中加入配置好的稀碱液，搅拌15min后静置0.5h，碱层分入钠盐贮罐，再将计量的水加入石油醚层，搅拌 15min后静置0.5h，水层并入钠盐贮罐，有机层吸入石油醚回收罐。
12
合成工艺
13
注意事项
• 三氯化铝结块时不能使用（吸水） • 傅克反应适当搅拌，否则影响收率
和质量 • 生产过程pH≤3 • 石油醚温度≤17°C（闪点）
6
设备一览表与主要设备的生产能力
7
工艺过程
羰基化合物的亲核加成-酰化反应将计量好的石油醚、三氯化铝加入反应釜内，
搅拌降温至5 ℃以下，加入计量的异丁苯，期间控制釜内温度小于5 ℃ ，再加入计量的乙酰氯，搅拌反应4小时，将反应液在10 ℃以下压入水解釜中，滴加稀盐酸，保持釜内温度不超过10 ℃ ，搅拌0.5h后，静置分层，有机层为粗酮，水洗至 pH=6，减压蒸馏回收石油醚后，再收集130 ℃ /2kpa馏分，即为4-异丁基苯乙酮，收率80%。
• 布洛芬的结构式
分子量：206.28 化学名：2-（4-异丁基苯基）丙酸，又名异丁苯丙酸
1
药理作用
布洛芬是临床应用的第一个烷基苯丙酸类非甾体抗炎药，广泛用于消炎、镇痛、解热、抗风湿等。扎托布洛芬是其中一种强效消炎、镇痛药，由日NipponChemiphar 公司开发，1993年在日本首次上市，主要用于治疗疼痛和类风湿关节炎等骨骼肌肉系统病变。因其抗炎效果好，镇痛作用强，副作用小而受到医药界好评。

脂肪酶催化药物合成的研究进展

脂肪酶催化药物合成的研究进展熊小龙;杜鹏飞;金鹏;王秋岩;谢恬【摘要】脂肪酶是工业中常用的生物催化剂,由于其催化的反应类型多样、反应条件温和、催化效率高、具备良好的区域和立体选择性,被广泛应用于药物合成领域.为了跟踪掌握脂肪酶在药物合成领域的最新进展,综述了近5年来脂肪酶在催化合成抗炎镇痛药物、抗抑郁药物、抗菌药物、抗肿瘤药物、维生素类药物及其中间体方面的最新应用,对新构建的工艺实例中脂肪酶的性质和优化的反应条件进行了重点描述.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)008【总页数】8页(P1-7,23)【关键词】酶法催化;脂肪酶;药物合成;手性中间体【作者】熊小龙;杜鹏飞;金鹏;王秋岩;谢恬【作者单位】杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江,杭州,310036;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江,杭州,310036;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012【正文语种】中文【中图分类】Q556脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)可以水解三酸甘油酯产生脂肪酸、单甘油酯、双甘油酯及甘油，在有机溶剂(包括超临界流体)中，亦可催化逆水解反应，例如酯化、交酯化、氨解、交流酯化及肽解等反应。

脂肪酶已广泛应用于食品、造纸、皮革、洗涤剂、化工材料和医药合成等诸多领域，其中，药物合成一直是脂肪酶研究领域的热点。

目前，临床上超过60%的常用药物为手性药物。

通常的化学工艺对手性分子的合成并不理想，存在反应路径长、重金属催化剂残留和收率低等缺点；而脂肪酶对底物具有高度的立体选择性，只需单步反应就可以高效率地制备出手性产物，这使得脂肪酶在光学纯化合物制备和药物手性转换中具有独特的优势。

脂肪酶+Novozyme+435+选择性催化2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸

2010Chinese Journal of CatalysisVol. 31 No. 6文章编号: 0253-9837(2010)06-0651-05DOI : 10.3724/SP.J.1088.2010.91101研究论文: 651~655收稿日期: 2009-10-30.联系人: 王普. Tel/Fax: (0571)88320389; E-mail: wangpu@基金来源: 浙江省重大科技攻关项目 (2005C13024); 浙江省高校优秀青年教师资助计划 (G0801116042610).脂肪酶 Novozyme 435 选择性催化 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯合成 S -(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸王普, 祝加男, 何军邀浙江工业大学药学院, 浙江杭州 310032摘要：采用脂肪酶催化外消旋 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯 (DMCPE) 不对称水解合成西司他丁关键手性中间体 S -(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸 (S -(+)-DMCPA). 比较了 5 种不同来源的脂肪酶, 从中优选出立体选择性较高和催化活性较高的脂肪酶 Novozyme 435, 系统考察了影响该酶催化不对称水解反应的关键因素, 获得了优化的生物催化工艺条件. 结果表明, 当脂肪酶 Novozyme435 用量为 16 g/L, 底物 DMCPE 浓度为 65 mmol/L 时, 以 pH 值为 7.2 的磷酸缓冲液 (1 mol/L) 为反应介质, 30 oC 反应 64 h, 产物的收率和光学纯度分别为 45.6% 和 99.2%. 脂肪酶 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解制备 S -(+)-DMCPA 工艺的产物光学纯度高, 路线可行, 并且酶可重复使用, 具有良好的工业化应用前景.关键词：脂肪酶; 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯; 不对称水解; S -(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸; 手性中间体中图分类号：O643/Q55 文献标识码：AEnantioselective Synthesis of S -(+)-2,2-Dimethylcyclopropanecarboxylic Acidfrom Ethyl-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylateCatalyzed by Lipase Novozyme 435WANG Pu *, ZHU Jianan, HE JunyaoCollege of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, Zhejiang, ChinaAbstract: S -(+)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid (S -(+)-DMCPA) was synthesized by asymmetric hydrolysis of racemic ethyl-2,2- dimethylcyclopropane carboxylate (DMCPE) over different lipases. Among the five enzymes investigated, Novozyme 435 showed higher enantioselectivity and activity. The influence of reaction parameters, such as ionic strength, the ratio of lipase/DMCPE, buffer pH, reaction temperature, and reaction time, on the biosynthesis of S -(+)-DMCPA was investigated. The optimum DMCPE concentration, enzyme dosage, buffer pH, reaction temperature, and reaction time were 65 mmol/L, 16 g/L, 7.2, 30 ºC, and 64 h, respectively. Under the optimal conditions, the higher yield of 45.6% and enantiomeric excess of 99.2% for S -(+)-DMCPA were obtained. The biocatalytic activity of Novozyme 435 was relatively stable, retaining 70.3% of the initial activity after reuse three times. The results demonstrated that lipase Novozyme 435 is a suitable biocatalyst for the synthesis of S -(+)-DMCPA and has great potential for industrial applications.Key words: lipase; ethyl-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate; asymmetric hydrolysis; S -(+)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid; chiral intermediateS -(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸 (S -(+)-DMCPA) 是制备西司他丁的重要手性中间体[1]. 西司他丁为肾脱氢二肽酶抑制剂, 它与亚胺培南制成的复合剂泰能是第一个应用于临床的新型碳青霉烯类抗生素, 不仅具有极强的广谱抗菌活性, 还具有β-内酰胺酶抑制作用, 是目前抗重症感染的首选药物和全球畅销药之一. S -(+)-DMCPA 的制备方法主要有化学法和生物法两种. 石晓华等[2]采用化学拆分方法, 以L -肉碱草酸盐为拆分试剂, 经酰化、成盐、部分结晶、水解得到 S -(+)-DMCPA, 收率为 16.7%, 产物 ee 值652 催化学报Chin. J. Catal., 2010, 31: 651–655为 98.9%. Wang 等[3]采用异丁烯为原料, 手性铜试剂为催化剂直接不对称合成S-(+)-DMCPA, 收率为72%, 产物 ee 值为 92%. 尽管该路线的收率较高, 但产物的光学纯度偏低, 且所用的手性催化剂昂贵, 反应条件较苛刻, 其中多步反应需在–78 o C 低温下进行. 采用生物催化手性合成技术制备手性药物中间体因具有高选择性、高催化效率和环境友好等优点而日益受到重视[4]. 文献[5,6]利用红球菌产生的腈水解酶不对称水解 2,2-二甲基环丙烷甲腈合成S-(+)-DMCPA, 收率分别为 26% 和 45%, 但产物光学纯度较低, ee 值分别为 90% 和 81.8%. 此外, 该路线所用底物在合成过程中需用到剧毒的氰化物, 这在一定程度上影响到该路线的环境效益. 本文利用脂肪酶催化具有的高立体选择性、高催化活性及反应条件温和等优点, 采用外消旋 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯 (DMCPE) 为底物, 通过优选合适的脂肪酶催化剂, 考察影响酶催化反应的因素, 优化反应条件, 旨在建立脂肪酶 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解制备S-(+)-DMCPA 的新途径. 迄今, 国内外尚未见相关的研究报道.脂肪酶具有较宽泛的底物专一性, 是目前用于手性化合物制备的优良生物催化剂之一. 脂肪酶Novozyme 435 为吸附固定于大孔丙烯酸树脂的南极假丝酵母脂肪酶 B, 具有较宽的 pH 适用范围和较高的热稳定性, 被广泛用于酯类、酸类、醇类和生物柴油等的制备[7~10]; 并且在不对称催化反应中具有较高的立体选择性[11]. 本文将脂肪酶 Novozyme 435 用于催化 DMCPE 的不对称水解 (反应原理如图式 1 所示), 获得了较高收率和高光学活性 (两者均高于文献[5,6]报道值) 的S-(+)-DMCPA, 建立了一种制备西司他丁重要手性中间体S-(+)-DMCPA 的新方法.图式1脂肪酶Novozyme 435 催化 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解Scheme 1. Asymmetric hydrolysis of ethyl-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate (DMCPE) catalyzed by lipase Novozyme 435.1实验部分1.1脂肪酶来源Novozyme 435 来源于南极假丝酵母 (CandidaAntarctica), 吸附固定于大孔丙烯酸树脂, 酶活力 10U/mg, 购自诺维信公司; Lipozyme IM 来源于米黑毛霉 (Mucor miehei), 固定于大孔阴离子交换树脂,酶活力 5.8 U/mg, 购自诺维信公司; Lipase F-AP 15粉末来源于米根霉 (Rhizopus oryzae), 酶活力≥30U/mg, 购自 Sigma 公司; L-1754 粉末来源于皱褶假丝酵母 (Candida rugosa), 酶活力 25 U/mg, 购自Sigma 公司; Lipase PS-D (硅藻土固定化酶) 来源于洋葱假单胞菌 (Pseudomonas cepacia), 酶活力 10.5U/mg, 购自 Amano 公司.1.2脂肪酶催化 DMCPE不对称水解反应称取一定量的脂肪酶置于磷酸缓冲液 (1mol/L) 中, 加入一定量的底物 DMCPE (含量为94.4%, 由浙江海翔药业股份有限公司合成并提供).因不同来源脂肪酶的最适反应条件不同, 反应体系密闭后, 采用供试脂肪酶各自最适反应条件, 置恒温培养振荡器 (上海智诚分析仪器制造有限公司,ZHWY-2012 型) 中, 200 r/min 下进行酶催化DMCPE 不对称水解反应. 由于底物在水中的溶解度较低, 因此在反应体系中加入 Tween-80 (20mg/ml) 作为助溶剂, 增加酶和底物的有效接触.酶催化反应结束后, 反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次, 萃取液经定容后采用气相色谱法测定产物的收率和 ee 值[6]. 气相色谱仪为岛津 GC-2014型, Chirasil-Dex CB 毛细管柱 (25 m × 0.25 mm,Varian, 美国), FID 检测器, 载气为 N2; 进样口和检测器温度均为 250 o C; 柱温起始温度为 80 o C, 保持3 min, 升温速率为 8 o C/min, 终止温度为 180 o C, 保持 5 min; 载气流速 2 ml/min; 分流比 15. 在此条件下, S 型和R 型底物、内标物 (十二烷)、S 型和R 型产物的保留时间分别为 3.69, 3.91, 8.29, 9.38 和 9.73min. 王普等: 脂肪酶选择性催化2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸 653反应液中产物和底物的光学纯度由 ee 值表征, 计算式为: ee p = (C SP–C RP)/( C SP+C RP) × 100% 和 ee s = (C SS–C RS)/( C SS+C RS) × 100%. 其中C SP, C RP, C SS 和C RS 分别为反应结束后S 型产物、R 型产物、S 型底物和R 型底物的摩尔浓度. 酶的立体选择性以E 值表示, 计算式[12]为E = ln[ 1 – X (1+ ee p) ]/ln[ 1 – X (1 – ee p)]. 其中X 为转化率 (X = ee s/(ee s + ee p )). 产物收率计算式为Y = C SP/C0 × 100%. 其中C0 为底物初始摩尔浓度. 实验数据为 3 次重复的平均值.2结果与讨论2.1高选择性和高催化活性脂肪酶的优选采用生物催化实现 DMCPE 外消旋体的不对称水解制备所需光学活性的西司他丁手性中间体, 其关键在于获得具有高立体选择性的生物催化剂. 脂肪酶种类较多, 但并非都适合于催化合成手性S-(+)-DMCPA. 我们选择了 Novozyme 435, Lipase F-AP 15, Lipase PS-D, L-1754 和 Lipozyme IM 等 5 种脂肪酶进行酶催化 DMCPE 不对称水解的对比研究. 由表 1 可知, Lipase F-AP 15, L-1754 和 Lipase PS-D 具有R 型立体选择性, 而 Novozyme 435 和Lipozyme IM 则具有S 型立体选择性, 其中 No-vozyme 435 的立体选择性 (E >100) 和催化活性均较高. 因此, 将其作为 DMCPE 不对称水解合成S-(+)-DMCPA 的优选生物催化剂. 尽管 Novozyme 435 在其最适反应温度 (60 o C) 下的催化活性较高, 转化率为 50.0%, 但立体选择性低于 30 o C 之值. 采用 30 o C 反应时E 值为 277.7, 产物 ee 值为 99.0%, 故选择 30 o C 用于后续研究. 此外, 对 Novozyme 435 而言, 反应体系中加入 Tween-80 后产物 ee 值有所下降, 还需优选其它表面活性剂作为助溶剂, 以增加酶与底物的接触面积, 促进反应的进行.表1 不同脂肪酶催化DMCPE 水解反应的比较Table 1 Comparison of the hydrolysis of DMCPE catalyzed by different lipasesLipase Temperature(o C) ee p (%) ee s (%) Conversion(%) E StereoselectivityLipase F-AP 15 (5.0 g/L, pH 7.2) 40 85.0 98.3 53.6 57.7 RL-1754 (6.0 g/L, pH 7.2) 40 79.0 95.0 54.7 31.2 RLipase PS-D (14.3 g/L, pH 7.0) 50 85.0 97.8 53.5 54.8 R30 65.9 1.9 2.8 5.0 SLipase IM (25.9 g/L, pH 7.0)40 46.7 4.5 8.8 2.9 S30 95.8 23.719.858.8 SNovozyme 435 (15.0 g/L, pH 7.0)6093.288.348.783.6SNovozyme 435 (15.0 g/L, pH 7.0)* 30 99.0 34.0 25.6 277.7 S6095.695.450.0169.3SReaction conditions: 2 ml of phosphate buffer (1.0 mol/L), DMCPE 0.13 mmol, Tween-80 20 mg/ml, 200 r/min, 20 h.*Without the addition of Tween-80 in the reaction system.2.2反应条件对 Novozyme 435催化不对称水解反应的影响2.2.1缓冲液离子强度的影响缓冲液离子强度会改变酶分子所处的微环境, 影响其活性构象, 从而影响酶的立体选择性和催化活性. 另外, 一定浓度的盐和酶分子形成复合物, 有利于维持酶的刚性结构, 保持酶的活性. 为此, 考察了缓冲液离子强度对酶催化活性和立体选择性的影响. 图 1(a) 表明, 产物收率随缓冲液离子强度的增大先逐渐升高而后降低, 当离子强度为 1.0 mol/L 时收率最高 (32.9%), 此时 ee 值为 99.1%. 这表明离子强度较大的无机盐对酶催化活性产生抑制作用. 因此, 选择 1.0 mol/L 的磷酸缓冲液作为酶催化不对称水解反应的介质.2.2.2酶与DMCPE浓度之比的影响由于底物 DMCPE 在水中的溶解度较低, 底物主要吸附于酶固定化载体上进行反应, 底物浓度与酶浓度对产物的收率和光学纯度的影响相互偶联. 为此, 考察了酶与底物浓度之比对不对称水解反应的影响, 结果如图 1(b) 所示. 随着酶与底物浓度比值的增大, 产物收率不断升高, ee 值基本不变(99.0%~99.2%). 单位酶浓度的收率随酶与底物浓度之比呈现先升高后下降的变化趋势 (见图 2). 综合考虑产物收率、 ee 值和酶的利用效率, 选择酶与底物摩尔浓度之比为 0.25, 即酶浓度 16 g/L、底物浓度 65 mmol/L 为佳.654 催化学报 Chin . J . Catal ., 2010, 31: 651–6551.41.51.61.71.81.92.02.1Enzyme/DMCPE (g/mmol)U n i t y i e l d (%)图 2 酶与 DMCPE 浓度比对单位酶产物收率的影响Fig. 2. Effect of ratio of lipase to DMCPE concentration on the uintyield of enzyme. Reaction conditions: 10 ml of 1.0 mol/L phosphate buffer, pH 7.0, 30 o C, 200 r/min, 40 h.2.2.3 缓冲液 pH 值的影响缓冲液 pH 值影响酶的解离状态, 进而影响酶的催化活性和立体选择性. Novozyme 435 是一种刚性很强的蛋白, 在 pH 值 3.5~9.5 内均较稳定[13]. 考察了 Novozyme 435 在 pH 值 6.0~8.0 内对 DMCPE 不对称水解反应的影响 (见图 1(c)). 结果表明, 产物收率随 pH 值增大而升高. 当 pH = 8.0 时, 收率最高 (达 39.1%); 但相应的 ee 值有所降低 (96.0%). 显然, 弱碱性环境有利于加快反应, 但同时酶的立体选择性降低. 缓冲液 pH = 7.2 为宜, 此时产物收率为 35.6%, ee 值为 99.1%. 2.2.4 反应温度的影响反应温度对产物收率和 ee 值的影响见图 1(d).由图可知, 当反应温度低于 35 o C 时, 产物收率随温度的升高而迅速升高, 35 o C 时产物收率达 44.9%; 继续升高温度, 产物收率略有提高. 实验结果表明, Novozyme 435 在 35~60 o C 内对 DMCPE 的不对称水解均表现出较高的催化活性.温度对 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解反应的立体选择性有一定影响, 表现为产物 ee 值随温度升高而有所下降, 当反应温度为 30 o C 时, 酶的立体选择性最高, ee 值为 99.2%. 这与文献[14]报道的 Novozyme 435 催化外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯水解制备对映体纯 D-对羟基苯甘氨酸, 以及文献[15]报道的固定化脂肪酶 CALB 催化外消旋 1-甲氧基-2-丙基酯生成手性仲醇的结果一致. Sakai [16]认为, 降低温度可提高酶的立体选择性, 并给出符合 Eyring 公式的 E 值与温度的线性关系式: ln E = ΔΔS +/R − ΔΔH +/(RT ). Dabkowska 等[17]认为, 温度对酶催化反应立体选择性的影响与底物两种对映体的能量势垒有关, 两种对映体能量势垒差别越大, 则温度的影响越大. 尽管在 35~60 o C 内的产物收率高于 30 o C 之值, 但产物 ee 值有所降低. 综合考虑产物的收率和 ee 值, 酶催化反应温度以 30 o C 为好. 2.2.5 反应时间的影响图 1(e) 为 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解反应的时间曲线. 酶催化水解反应在 24~72 h 内, 产物 ee 值维持在 99.1% 左右, 反应 80 h 时 ee 值下降至 94.8%. 产物收率随反应时间的延长而提20253035404550Ionic strength (mol/L)Y i e l d (%)Enzyme/DMCPE (g/mmol)0.160.240.320.40pH Temperature (o C)Reaction time (h)020*********e e (%)图 1 反应条件对产物 ee 值和收率的影响Fig. 1. Effects of reaction conditions on ee and yield of S -(+)-DMCPA. Reaction conditions: (a) 10 ml of pH 7.0 phosphate buffer, 150 mg of No-vozyme 435, DMCPE 0.65 mmol, 30 o C, 200 r/min, 40 h; (b) 10 ml of 1.0 mol/L phosphate buffer, pH 7.0, 30 o C, 200 r/min, 40 h; (c) 10 ml of 1.0mol/L phosphate buffer, Novozyme 435 160 mg, DMCPE 0.65 mmol, 30 o C, 200 r/min, 40 h; (d) 10 ml of 1.0 mol/L phosphate buffer, pH 7.2, No-vozyme 435 160 mg, DMCPE 0.65 mmol, 200 r/min, 40 h; (e) 10 ml of 1.0 mol/L phosphate buffer, pH 7.2, Novozyme 435 160 mg, DMCPE 0.65 mmol, 30 o C, 200 r/min. 王普等: 脂肪酶选择性催化 2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯合成 S -(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸 655高, 72 h 时产物收率为 45.8%, 略高于 64 h 时的 45.6%. 从经济角度考虑, 最佳反应时间为 64 h, 此时产物收率和 ee 值均比较理想. 2.3 脂肪酶 Novozyme 435 的重复使用在上述优化的反应条件下考察了脂肪酶 No-vozyme 435 的重复使用. 考虑到固定化酶载体上会吸附有底物和产物, 待水解反应结束后, 将乙酸乙酯加入到未经分离酶的反应液中一并进行萃取, 之后, 分离乙酸乙酯层用于分析检测或产物提取, 同时过滤萃余相回收酶. 固定化酶经过滤后, 用缓冲液洗涤数次, 然后重新用于催化 DMCPE 的不对称水解反应. 图 3 结果表明, 脂肪酶 Novozyme 435 重复使用性能较好, 使用 3 次后的产物收率仍可达初始值的 70.3%, ee 值为 97.8%. 重复使用 4 次后, 产物收率为初始值的 56.5%, ee 值为 96.9%. 重复使用过程中酶的活性逐渐下降, 主要是由于 Novozyme 435 为南极假丝酵母脂肪酶 B 经吸附制得的固定化酶[18], 在反应振荡过程中可能出现酶分子脱落, 从而造成酶回收量的减少, 影响了酶的重复使用效果. 后续研究考虑采用交联剂对 Novozyme 435 进行交联固定以进一步提高酶的稳定性.e e o r y i e l d (%)123456020406080100 ee yieldCycle图 3 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解的重复使用Fig. 3. Repeated hydrolysis of DMCPE catalyzed by Novozyme 435. Reaction conditions: 10 ml of 1.0 mol/L phosphate buffer, pH 7.2, Novozyme 435 160 mg, DMCPE 0.65 mmol, 30 o C, 200 r/min, 64 h.3 结论采用脂肪酶 Novozyme 435 催化 DMCPE 不对称水解反应是一种环境友好的制备高光学活性西司他丁关键手性中间体 S -(+)-DMCPA 的新方法. 通过酶催化反应条件的优化, 产物的收率和 ee 值均优于文献[5,6]采用红球菌产生的腈水解酶催化 2,2-二甲基环丙烷甲腈制备 S -(+)-DMCPA 的结果. 脂肪酶 Novozyme 435 对 DMCPE 具有较高的立体选择性、催化活性和稳定性, 是一种性能优良的生物催化剂, 并且可重复使用, 具有很好的工业化应用前景. 由于 Novozyme 435 价格偏高, 如何提高酶的重复使用次数以降低催化剂成本还需进一步研究. 将底物中未反应的对映体进行消旋化处理也可进一步提高底物的利用率. 此外, 通过菌种筛选和定向进化获得具有更高酶活力的优良微生物菌种, 有望进一步提高该生物催化制备路线的经济性.参考文献1 Drusano G L. J Antimicrob Chemoth , 1986, 18(Suppl E):79 2 石晓华, 周舞阗, 陈新志. 高校化学工程学报 (Shi X H, Zhou W T, Chen X Zh. J Chem Eng Chin Univ ), 2005, 19: 3843 Wang Q W, Yang F K, Du H, Hossain M M, Bennett D, Grubisha D S. Tetrahedron : Asymmetry , 1998, 9: 39714 许建和, 谢谚, 赵丽丽, 刘旭勤. 生物加工过程 (Xu J H, Xie Y, Zhao L L, Liu X Q. Chin J Bioprocess Eng ), 2007, 5: 15 Wang M X, Feng G Q. 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生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展

生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展胡琦蔚;张俊伟;王远山【摘要】酮基布洛芬是一种重要的消炎镇痛药,广泛应用于风湿、类风湿性关节炎、脊髓炎和痛风等疾病的治疗,成为处方量最大的药物之一.市售的酮基布洛芬以外消旋体为主,(S)-酮基布洛芬为其活性对映体,(R)-酮基布洛芬的存在会加重肝脏的代谢负担.目前手性酮基布洛芬主要通过化学合成法生产,与传统的化学法相比,生物催化法具有反应条件温和、对环境友好等优点,成为近年来研究的热点.生物催化法主要利用脂肪酶、酯酶和腈水合酶/酰胺酶双酶体系等催化制备手性酮基布洛芬.同时对生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展进行了综述.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2017(046)003【总页数】5页(P153-157)【关键词】生物催化;酮基布洛芬;脂肪酶;酯酶【作者】胡琦蔚;张俊伟;王远山【作者单位】浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州310014;杭州安诺过滤器材有限公司,浙江杭州311404;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】Q814酮基布洛芬(ketoprofen，3-苯甲酰基-α-甲基苯乙酸)是一种2-芳基丙酸类强效非甾体抗炎药.最早由法国化学家Rhone Poulenc于1967年合成，并于1973年引入法国和美国作为抗炎药使用[1]，对风湿、类风湿性关节炎、脊髓炎和痛风等疾病有良好的效果，且消炎作用强于布洛芬，不良反应轻于布洛芬.在同等剂量下，其消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是消炎痛的4倍、阿司匹林的100倍.由于酮基布洛芬具备药效高、半衰期较短、代谢简单和不良反应少而轻等优点，已广泛应用于治疗各种类型的疼痛、炎症症状、感冒及手术后的消炎止痛.由于风湿、类风湿和痛风等是我国多发性疾病，近年来酮基布洛芬等非甾体抗炎药发展迅速，市场需求量巨大.而酮基布洛芬具有“R”和“S”两种对映体，并有着明显不同的药理活性，(S)-(+)-酮基布洛芬(S-ketoprofen)是(R,S)-酮基布洛芬的活性对映体，其消炎镇痛等作用是外消旋体的两倍[2]，而(R)-酮基布洛芬抗炎镇痛作用极弱，常作牙膏添加剂以预防和治疗由牙周炎导致的骨质疏松[3]，也可用于缓解触觉性异常疼痛.目前，市售的以外消旋体为主，疗效较(S)-(+)-酮基布洛芬弱且肝脏代谢负担大.因此，开发低成本的单一对映体的(S)-(+)-酮基洛芬制备工艺具有重要意义.1.1 结晶法1.1.1 非对映体结晶法非对映体结晶法是利用拆分剂(如光学纯的酸)拆分外消旋体得到非对映体盐，再通过选择性结晶从而得到光学纯的对映体.Yoneyoshi等[4]将外消旋酮洛芬和酮洛芬胺加热溶解在甲醇中，冷却后静置过夜得到结晶，过滤后用1%的盐酸将结晶溶解，用甲苯萃取两次后减压蒸馏得到(S)-(+)-酮基布洛芬，产率为43%，e.e.值为79.1%.Lukas等[5]则用异丙醇溶解外消旋酮洛芬，加入苯乙胺作为手性试剂，搅拌后冷却结晶，用0 ℃的异丙醇洗涤结晶两次得到(S)-(+)-酮基布洛芬，产率为40%，文中未提及产物的e.e.值.1.1.2 优先结晶法优先结晶是在饱和或过饱和的外消旋体溶液中加入其中一种对映异构体的晶体作为晶种，造成不对称环境，诱导结晶按非平衡的过程进行，从而达到拆分的效果.Van Eikeren等[6]通过加热搅拌使外消旋的酮洛芬溶解在乙腈-水混合物中，以(1R,2S)-cis-1-aminoindan-2-ol作为拆分剂，加入(S)-ketoprofen-(1R,2S)-cis-1-aminoindan-2-ol作为晶种，得到的结晶用乙腈洗涤两次后真空干燥，最终获得66.4 g (S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值达到97.2%.Manimaran等[7]用甲醇稀释外消旋酮洛芬的乙酸乙酯溶液，冷却后加入(S)-ketoprofen-cinchonidine晶体，得到的结晶在真空条件下过滤，并用乙酸乙酯和乙醚洗涤三次，真空干燥后得到成品，(S)-(+)-酮基布洛芬的产率为31%，e.e.值为97%.由于利用结晶法制备(S)-(+)-酮基布洛芬的过程中均涉及重结晶这一步骤，耗时且增加了成本、降低了产率.另外，结晶中所用到的基质昂贵且不稳定，难以循环利用[8]，制备过程中对温度和压力的要求也较高，尤其是结晶时，往往需要低温保证结晶的顺利进行，由于这些缺陷的存在，结晶法并未被广泛应用于工业生产中. 1.2 不对称合成法1.2.1 Sharpless环氧化法Hamon等[9]通过6步反应，由烯丙醇通过Sharpless环氧化制备得到(2S,3S)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最终得到(S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值达到98%.Sharpless环氧化法制备(S)-(+)-酮基布洛芬的途径为[9]1.2.2 α-芳基丙烯酸氢化法具有前手性的不饱和羧酸经手性BLNAP-Ru的二羧酸酯络合物氢化后可得到光学活性的饱和羧酸，该方法可用于(S)-(+)-酮基布洛芬的制备.Laue等[10]以(S)-(+)-RuBLNAP(OAc)2为催化剂在高压下氢化，最终得到的产物e.e.值达到80%.利用手性络合物制备(S)-(+)-酮基布洛芬的途径[10]为目前，市售(S)-(+)-酮基布洛芬主要通过传统的化学法生产，这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物.另外，手性催化剂的制备过程较为困难，有时其本身的制备反应也需要昂贵催化剂的参与.酶法制备(S)-(+)-酮基布洛芬属于动力学拆分的范畴，由于其具有反应条件温和、较好的底物特异性和对映体选择性以及对环境友好等优点[11-13]，受到了广泛的重视.生物催化法常以外消旋酮基布洛芬或其衍生物为底物，通过酶拆分得到(S)-(+)-酮基布洛芬.2.1 酯酶和脂肪酶酯酶和脂肪酶是(S)-(+)-酮基布洛芬制备中最为常用的酶.根据催化原理的不同，可以大致分为对映体选择性酯化和对映体选择性水解两类[14].2.1.1 对映体选择性酯化在对映体选择性酯化制备(S)-(+)-酮基布洛芬的过程中，通常以外消旋的酮洛芬和醇类作为底物，在具有选择性的酯酶或脂肪酶的催化下，优先将(R)-(-)-酮基布洛芬酯化为(R)-酮基布洛芬酯，而保留(S)-(+)-酮基布洛芬，再通过中和或加入饱和NaHCO3将剩余的酮洛芬与酮洛芬酯分离，以获得较纯的(S)-(+)-酮基布洛芬.通过对映体选择性酯化法制备(S)-(+)-酮基布洛芬的途径为Park等[15]利用Candida antarctica脂肪酶Novozym 435酯化外消旋的酮洛芬，发现以甲醇作为烷基供体时转化率和对映体选择性均较佳，转化9 h后，转化率达到59%，e.e.值为75%，E为6.Ong等[16]利用南极假丝酵母脂肪酶(C. antarctica lipase B，CALB，Novozym 525)拆分外消旋酮洛芬，比较了游离酶和固定化酶的催化特性，发现固定化酶在催化效率、热稳定性和重复利用等方面均要高于游离酶.以丁醇为烷基供体，在最佳条件下利用固定化酶反应24 h后，(R)-酮基布洛芬的转化率达到73%，剩余底物中(S)-(+)-酮基布洛芬的对映体过量值为87.8%.Candida cylindrecca所产脂肪酶(CCL)是用于选择性水解外消旋酮基布洛芬酯衍生物最有效的酶之一，以该酶为催化剂的报道较多，但其拆分反应需要大量手性环糊精参与.也有学者利用其他来源的酶进行对映体选择性酯化反应，如Li等[17]利用来源于Burkholderia cepacia的固定化脂肪酶G63，在37 ℃下反应22.5 h后得到(S)-(+)-酮基布洛芬，E为10.01.2.1.2 对映体选择性水解对映体选择性水解以外消旋的酮洛芬酯为底物，通过脂肪酶或酯酶优先水解其中一种对映体生成(S)-(+)-酮洛芬和醇.Kim等[18]从Archaeoglobus fulgidus DSM 4304基因组中克隆出一个耐高温的酯酶，结合易错PCR和定点饱和突变对该酶进行改造，得到一个双突变体V13G/L200R，在70 ℃下反应1 h，可以将5 mmol/L外消旋的酮基布洛芬乙酯转化为(S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值为(89.2±0.2)%，E为19.5±0.5.Kim等[19]从Candida rugosa中得到的脂肪酶可以将100 mmol/L酮洛芬乙酯转化为(S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值达99%，转化率为49%，但所需时间为3 d.Zhang等[20]利用固定化Trichosporon laibacchii酵母脂肪酶在含有Tween-80的水相中水解(R,S)-酮洛芬乙酯，45 ℃下反应33 h，转化率达到46.3%，产物的光学纯度达到94.4%.其余利用脂肪酶或酯酶制备(S)-(+)-酮基布洛芬的例子如表1所示.利用T. laibacchii脂肪酶水解(R,S)-酮洛芬乙酯生成(S)-(+)-酮基布洛芬[20]的途径为(R)-(-)-酮基布洛芬制备的相关研究较少.Gérard等[27]得到一个来源于酵母Yarrowia lipolytia的脂肪酶Lip2p，该酶可催化酮洛芬乙酯生成酮基布洛芬，但其对映体选择性不佳，对其进行定点饱和突变后获得一突变体V232F，可选择性催化底物生成(R)-(-)-酮基布洛芬，E≥300.Hu等[28]利用来源于Aspergillus terreus的脂肪酶催化酮洛芬乙烯酯，得到(R)-(-)-酮基布洛芬，转化率为(16.0±1.3)%，E为11.4，e.e.值为(82±2.7)%，后对其进行固定化，最大转化率、E和e.e.值分别提高到了45.9%，128.8和(96±0.1)%.2.2 腈水合酶/酰胺酶双酶体系目前也有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道.Layh等[29]以酮洛芬腈为唯一氮原筛选得到的Rhodococcus equi K2a能将酮洛芬腈及酮洛芬酰胺转化为(S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值均为99%，转化率分别为27%和25%；Heinemann等[30]筛选得到的Agrobacterium sp. LK中含有的腈水合酶/酰胺酶双酶体系能够催化2-(3-苯甲酰苯基)丙腈转化成酮基布洛芬，e.e.值为91%；Salvo等[31]利用Agrobacterium radiobacter 30″60 (NCIMB 41108)静息细胞水解酮洛芬腈，(S)-(+)-酮基布洛芬的产率为45%，光学纯度为96%.利用腈水合酶/酰胺酶双酶体系制备(S)-(+)-酮基布洛芬[30]的途径为2.3 腈水解酶目前尚无利用腈水解酶制备(S)-(+)-酮基布洛芬的报道，但本课题组通过基因挖掘从NCBI数据库中挖掘得到一个腈水解酶Nit1，可选择性水解(R,S)-2-(3-苯甲酰苯基)丙腈生成(S)-(+)-酮基布洛芬，e.e.值为14.2%.对其进行分子改造后获得一个突变体W56G，该突变体的对映体选择性有了明显的提升.利用腈水解酶制备(S)-(+)-酮基布洛芬的途径为生物催化法具有条件温和，化学选择性、区域选择性及对映体选择性高等特点，且其对环境友好、耗能低，符合绿色发展的理念，建立酶法制备(S)-(+)-酮基布洛芬的新工艺，具有重要的意义.尽管在生物催化法制备(S)-(+)-酮基布洛芬方面进行了大量的研究，但由于酶拆分法存在着反应时间长、稳定性差等缺陷，该法还没有得到产业化应用.目前，已有较多通过对酶进行改造、固定化等手段从而改善了酶催化特性的例子，一定程度上突破了上述的限制，基因工程及酶工程的发展将极大推动生物催化制备(S)-(+)-酮基布洛芬技术的发展.【相关文献】[1] 石开云, 余清宝, 邹晓川. 酮洛芬合成方法研究进展[J]. 精细化工, 2015, 32(8):841-848.[2] HUTT A J, CALDWELL J. The importance of stereochemistry in the clinical pharmacokinetics of the 2-arylpropionic acid non-steroidal anti-inflammatory drugs[J]. 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脂肪酶的结构特性

Lip 1的Lid

CRL的Lid兩種結構~open為紫色 closed 為藍色

有於Lid domain有hydrophobic moment 而又以LIP4最高，所以Lid在LIP的 interfacial activation過程扮演重要角色所以置換不同的Lid會呈現不同的物理性質，如蛋白質的表面的淨電荷和疏水性從模擬結構中可以看到活化能高低以及鄰近區的靜電力作用力，會決定該LIP的活化速率
Lid (green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元体(purple)
(A)
(B)
(A)Closed (inactive) form，黑色部分為胺基酸的位置62 ~ 92所形成的頂蓋(Lid domain)。 (B)Open (active) form，黑色部分為胺基酸的位置62 ~ 92所形成的頂蓋(Lid domain)。
Candida rugosa lipase的表現及特性分析 PDB ID:1CRL
林柏宏 11月26日
Introduction

Candida rugosa所產生的五種菌体外脂
肪酶(LIP-1~LIP-5)，皆為534個胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質特異性，由此可知CRL的序列與結構及基質特異性的相關性可能是非常嚴謹的。
脂肪酶的生化特性
A、催化之反應 1. 酯解反應(Ester Hydrolysis) 2. 酯化反應(Ester Synthesis) 3. 內酯化作用(Intererterification) B、水解催化的特異性 1. 非特異性脂肪酶(non-specific lipase) 2. 1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specific lipase) 3. 2-特異性脂肪酶(2-specific lipase) 4. 醯基特異性脂肪酶(Acyl group specific lipase reaction) C、催化機制 1. 醯化反應(acylation) 2. 去醯化反應(deacylation)

布洛芬_右旋布洛芬及其衍生物的合成进展

姜标等报道了上述反应的前体化合物 2-芳基乳酸酯的制备方法[11]。反应式如下：
O COOR
AlCl3
OH COOR - H2O
H2 COOR
Cat
1)NaOH COOR
2)H+
COOH
重点研究了芳香烃包括异丁苯与丙酮酸甲酯或乙酯在 Lewis 酸催化下缩合生成 2-芳基乳酸酯的条件，包括催化剂种类、用量、反应溶剂、反应温度等，但反应要求低温如-30 ℃，并且收率中等。 1.6 环氧丙烷重排法
CO H2O ROH Cat
COOH +
COOH
1.4 卤代烃羰基化法卤代烃羰基化法以 1-对异丁基苯基-1-氯乙烷
为原料，经与 CO 在催化剂和碱性条件下羰基化生成产物，反应式如下：
CH3CHO HCl ZnCl2 Cl CO H2O, OH- H+
Cat COOH
该方法在上世纪 80 年代即有报道，催化剂一般为钴或钯的化合物，溶剂为醇类。但有如下缺点：碱性条件下得到的一般为布洛芬盐，需要增加酸化一步才能得到布洛芬；卤代烃羰基化往往产生双羰基化副产物，即 4-异丁基苯基丙酮酸；具有良好选择性的反应参数的变化范围很窄。 Elango 报道了以钯为催化剂的酸性水溶液中的羰基化反应，同时还报道了异丁苯与乙醛和氯化氢进行氯乙基化反应生成 1-对异丁基苯基-1-氯乙烷的详细操作[9]。
综合分析以上不同的工艺路线，笔者认为仍以经典的 1,2-转位重排法比较适合国内生产。醇羰基化法和烯烃羰基化法技术难度高，催化剂价昂；卤代烃羰基化法选择性低，催化剂价高，氯乙基化时易发生多烷基化和双芳基化，杂质多；烯烃加氢法虽有可分别制备消旋布洛芬和右旋布洛芬的优点，但 2(4-异丁基苯基) 丙烯酸需由异丁苯经 2 步反应制得，与丙酮酸酯缩合一步收率低，丙酮酸酯价格高，加氢催化剂昂贵；环氧丙烷重排法有 4 步反应，二甲硫醚污染大，工业化前景不乐观。

水-有机溶剂混合体系脂包衣酶制备S-(+)-布洛芬

水-有机溶剂混合体系脂包衣酶制备S-(+)-布洛芬杨根生;吴伟军;欧志敏;姚善泾【期刊名称】《化学工程》【年(卷),期】2010(038)001【摘要】用二-十二烷基-N-D-葡萄糖酸-L-谷氨酸酯对来源于Candida cylindrucea的脂肪酶包衣后应用于水-有机溶剂体系中催化选择性水解布洛芬甲酯制备S-(+)-布洛芬.考察了体系的有机溶剂种类和体积分数、温度、pH值等因素对转化率和对映选择性的影响.结果表明,在布洛芬甲酯为100 mmol,脂包衣脂肪酶250 mg/mL,pH值为 7.5,温度为40 ℃,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)体积分数在20%时,15 h后催化的转化率可达48.3%,对映选择率达465.动力学研究表明脂包衣脂肪酶在水-DMF混合体系中其酶促反应符合米氏方程,其米氏常数K_m是水相中没有包衣酶的1/2,最大反应速度v_(max)是它的1.4倍.【总页数】5页(P94-98)【作者】杨根生;吴伟军;欧志敏;姚善泾【作者单位】浙江大学,化学和生物工程系,浙江,杭州,310027;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江大学,化学和生物工程系,浙江,杭州,310027【正文语种】中文【中图分类】TQ426.97;Y【相关文献】1.水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸 [J], 徐礼生;高贵珍;曹稳根;赵亮;张兴桃;焦庆才;陈军;宋曼2.多元络合物显色反应中的有机溶剂化效应——铁(Ⅲ)-铬天青S-溴化十六烷基三甲铵-含氧有机溶剂体系 [J], 慈云祥3.水-有机溶剂混合介质中氧化NTS酸制备DNS酸 [J], 周海滨;李斐;陈宏博4.水-有机溶剂混溶体系中催化抗体催化拆分布洛芳脂 [J], 杨根生;应黎;欧志敏;姚善泾5.水/有机溶剂双相酶偶联体系不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 [J], 陈星星;穆晓清;徐岩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。