第七章 植物原生质体培养
植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
植物原生质体培养与体细胞杂交
2-7d 第一次分裂 2w后 低渗透压 约6w后 3w后
多细胞的细胞团
小细胞克隆
直径1mm的小愈伤组织
3 植株再生 将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养。
愈伤组织将通过形态发生的两条途径即器官 发生或胚胎发生形成再生植株。
Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose （夜来香）
成分 数量（mg· L-1） 成分
KNO3 CaCL2· 2H2O H3BO3 Na2MO4· 2H2O NaFe· EDTA 甘露糖 果糖 山梨醇 丙酮酸钠 延胡索酸 生物素 盐酸吡哆醇 抗坏血酸 叶酸 维生素B12 椰子汁 1900 600 3.00 0.25 28 125 125 125 5 10 0.005 1 1 0.2 0.01 10
胞质环流检测法：
以胞质环流作为进行活跃代谢的指标
（二）原生质体培养
原生质体制备 好后，用培养 基将原生质体 调至一定的密 度（最低起始 细胞密度以 上），及时地 进行培养。
1 、培养基 原生质体培养基基本上是参照植物组织或细胞 培养所用的培养基。 茄科植物：MS、NT 十字花科和豆科：B5、KM8P 禾本科：MS、N6 、KM8P
体细胞杂交主要集中以下植物
茄科植物 十字花科 禾本科 豆科
体细胞杂交过程：
原生质体的制备； 原生质体的融合； 杂种细胞的筛选和培养； 杂种植株的再生和鉴定
1、原生质体的制备
2、原生质体的融合： 自发融合：在原生质体分离过程中发生 诱发融合：人为手段诱导原生质体融合的方法
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体的培养与体细胞杂交
。异变因基和体色染、异变征特态形为现表要主。代后给递传地定稳能 �异变因基和体色染及涉因异变传遗�征特异变其失丧而变改的件条境环随它�异变传遗非 为异变性应适 。异变性传遗和异变性应适括包 �异变的泛广着在存中程过养培体离物植 异变传遗�二� 。株植成育发接直后构结体 状胚成形或根定不和芽定不成形可 �中基养培化分到移转织组伤愈的成形养培体质生原 生再株植、3 。致所衡平不的裂分质胞和裂分核是能可这 �象现裂分丝有的常正不生发会中程过养培体质生原 。大很化变率板植体质生原此因 �裂分丝 有胞细行进能都定一不胞细生再但 �提前的裂分丝有则规行进是在存的壁胞细体质生原 裂分胞细、2 。大增积体或芽现出会常 体质生原的全不育发壁胞细而 �裂分丝有胞细的常正行进步一进体质生原的壁胞细整完生再 。成完生再壁胞细天数至天两 �壁胞细生再始开后时小数养培经体质生原 �下况情常正 。件条 决先的裂分胞细是生再的壁胞细而 �力能在潜的裂分和生再有具都体质生原的力活有具 生再壁胞细、1 程过生再体质生原�一� 。程过的株植整完 出化分体状胚过通或织组伤愈过通或后最 �团胞细成形裂分续持胞细生再 �壁胞细复恢快很 �下件条养培的好良和法方养培的当适在体质生原的化纯、离分指是程过生再体质生原 异变传遗与程过生再体质生原、六 。法方种一的养培荡震�后珠糖脂琼成形待�中 液养培入滴滴液的右左 lm5.0 以后然 �匀均合混液体质生原的纯提与液糖脂琼的温适用 养培珠糖脂琼、4 。法 方的面表基养培脂琼体固在布涂 �合混液浮悬体质生原的度浓定一与脂琼的积体等将指是法 养培层双体固-体固�散扩的分成害有和放释步逐的分成养营于利又�长生的体质生原于利 既�合结的养培体固与养培体液是。法养培层双体固-体液为法方养培的面表基养培脂琼体 固在布涂液浮悬体质生原度浓定一将。养培层双体固-体固和养培层双体固-体液为分又 养培层双、3 。法方的 养培止静层浅中皿养培于置 lm4—3 出取�度密胞细定一到整调液养培用体质生原将是 养培层浅体液、2 。察观点定于便 �动游其免避�定固置位体质生原使。法方的板平体固层薄成制内皿养培在�合混基养培脂 琼的℃54 于处的积体等与度密胞细定一照按体质生原的积体定一将指�养培板平叫又 养培层薄体固、1
植物原生质体培养
酶解温度
图示：原生质体分离过程（以叶片为例）
过滤、离心
加果胶酶 和纤维素酶
三、原生质体的纯化
材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤 压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。
此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管 成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必 须除去。
三种方法
离心沉淀法 漂浮法
植物原生质体培养 （补充）
The cultivation of plant protoplast （Complementarity）
李宏富
一、两个概念
再生植株 工程植株
二、原生质体分离
1 材料来源 植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片
中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使 植物遭到致命的破坏。
embryos. i: Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.
四、原生质体培养研究进展
膜片钳技术
1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创 建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电 流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的 技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱， 给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
植物原生质体培养的技术流程
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现代植物生理—李合生主编(7)
第七章植物的生长生理一、基本名词解释1、植物的生长：是指由于细胞分裂和伸长引起的植物在体积和质量（干重）上的不可逆增加。
2、植物的发育：在植物生活史中，细胞生长和分化成为执行各种不同功能的组织与器官的过程二、植物细胞的生长和分化：1、细胞是植物体的结构和功能单位。
2、细胞分化特点：植物根和茎的顶端分生组织细胞以及侧生分生组织（形成层）细胞处在不断分裂的过程中。
（1）具有分裂能力的细胞体积小，细胞质浓厚，没有液泡，细胞核大及细胞壁薄（2）从母细胞分裂后形成的子细胞到下次分裂形成两个子细胞所需要的时间称为细胞周期，分裂间期较长。
（3）控制细胞周期的关键酶是蛋白激酶（CDK），其磷酸化或去磷酸化能有效调节细胞周期的过程。
分裂期特点：1）DNA含量发生了很大变化2）呼吸速率的变化（变快）3）植物激素的影响3、细胞的伸长特点：（1）细胞体积显著增加（2）呼吸和代谢十分旺盛4、细胞的分化特点：组织与器官的分化细胞的分化调控：有特异基因表达（激素对基因表达起重要的调控所用）三、种子的萌芽：1、概念：种子萌发是指种子从吸水到胚根（很少情况下是胚芽）突破种皮期间所发生的一系列生理变化过程。
但在农业生产实践中，种子萌发是指从播种到幼苗出土之间所发生的一系列生理变化2、影响种子萌发的因素（1）内部因素：1）种子的生活力：种子的发芽潜力即种子的发芽力2）种子活力：即种子的健壮度，包括发芽潜力，生长潜力和生产潜力检测种子活力的方法：①利用组织还原力②利用原生质的着色能力③利用细胞中的荧光物质3）种子寿命：种子从采收至失去发芽力的时间。
种子寿命即与植物种类有关，也与贮藏条件有关（可分为：短命种子，中命种子，长命种子）4）种子老化（负面）种子成熟后在贮藏过程中活力逐渐降低的过程（2）外界因素1）水分：干燥种子最初依靠吸涨作用进行吸水2）氧气3）温度4）光：光不是所有种子萌发所必须的外界条件，只有少数种子萌发所必须的①需光种子：需要光照才能萌发的种子，如莴苣，烟草②需暗种子：有些种子只能在暗处萌发，光会抑制萌发过程对需光种子而言，白光和波长为660nm的红光都能有效促进萌发的作用，然而红光的效应可被随后的远红光（730nm）所抵消，红光和远红光对种子萌发的逆转作用是通过光敏色素实现的。
园艺植物生物技术课后习题答案
第一章至第五章一、主要名词和概念：一．1. 植物细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传物质，在一定条件下具有发育成为完整植物体的潜在能力。
2. 脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞放在培养基上培养后，细胞重新进去分裂状态，一个成熟细胞转变为分生状态的过程。
3. 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。
4. 器官发生途径：由外植体或愈伤组织诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法5. 体细胞胚胎发生途径：在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程，形成具有双极性的胚状结构而发育成再生植株的途径。
6. 外植体：由活体植物体上切去下来的，用于组织培养的各种接种材料。
包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。
7.褐化现象：指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面想培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
8. 看护培养：利用活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的培养方法。
9. 分批培养；把细胞分散在一定容积的培养基中培养，当培养物增值到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。
10. 连续培养：利用特质的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。
11. 体细胞杂交：使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
12. 雄核发育：在适宜的离体培养条件下，花粉（小孢子）的发育可偏离活体时的正常发育转向孢子体发育，经胚状体途径或器官发生途径形成完整植株。
13. 雌核发育：以未受精子房或胚珠为外植体诱导单倍体的方法。
14. 非整倍体：生物体的核内染色体数不是染色体基数整数倍，而发生个别染色体数目增减的生物体。
15. 代换系：生物体的染色体被异源种属染色体所代换的品系。
16. 易位系：某染色体的一个区段移接在非同源的另一个染色体上，具有发生染色体易位的品种。
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法原生质体培养办法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。
另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采纳饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。
而在原生质体应用于生物转化中时，常常采纳固定化原生质体培养技术举行固定培养。
一、固体平板培养法原生质体的培养办法和对培养条件的要求常与单细胞培养相像。
故原生质体的培养也可根据单细胞的平板办法举行。
首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管快速等量混匀，并快速转移到培养皿中，旋转培养皿，眨眼便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。
培养基层不宜过厚，普通2～3mm。
培养5～7d原生质体开头分裂，3周左右观看细胞植板率。
待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调整剂的新奇固体培养基中继代培养。
近年来发觉，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。
特殊是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，用法琼脂糖可能会取得比较好的效果。
低熔点琼脂糖可在30℃左右溶化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。
该办法的优点：原生质体分布匀称，有利于分裂；简单获得单细胞株系；可定位观看单个原生质体的生长发育状况。
缺点：原生质体易受热损害；易破裂；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。
二、液体浅层培养法尽管固体培养有上述优点，但无数讨论者还是喜爱用法液体培养基，这是由于，当用法液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的办法把培养基中的渗透压降低；另外，假如原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分别出来。
本办法是用液体培养基举行原生质体培养。
把纯化后的原生质体用液体培养基调节好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。
培养基层厚2～3mm。
培养5～10d细胞开头分裂，此时开头降低培养基中的渗透压。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
protoplasts from the cut enzymes on the metabolism
ends of the cell.
of the protoplasts are eliminated.
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分
一、发展简史及其意义
1、发展史
❖ 1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；
❖ 1960年：英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌 纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼 根细胞原生质体；
❖ 1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；
❖ 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟 草叶肉原生质体，两步法和一步法。
二、原生质体分离
（一） 分离方法
机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
陈传红 制作 2007 / 5
1、机械分离（Machanical isolation）
高度液泡化的细胞
• Cut plasmolyzed tissue • In practice this technique is
and subsequent
difficult and the yield of
deplasmolysis results in expansion and release of the
viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
植物原生质体培养
植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。
二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞，具有全能性。
原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。
三、材料、试剂与主要仪器1．仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL)，光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。
2．试剂（1）原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L，pH 5.8,灭菌。
（2）酚红（0.1%）：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
3．材料制备好的菠菜原生质体。
四、实验步骤1．原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中，500rpm 下离心10min，原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带，用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。
2．原生质体清洗用原生质体洗涤液（CPW液）重新悬浮原生质体沉淀，1000rpm下离心5min，使原生质体沉淀在试管底，重复清洗一次。
之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。
3．活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形，在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流运动。
可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上，加一滴0.1%的酚红染液，凡有活力的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。
4．密度调整用血球计数板于显微镜下计数，用液体培养基调整使原生质体浓度至105～106个/mL。
5．分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中，每皿4mL，于28℃下培养，第1d是暗培养，第2～3d光照度为300Lx，以后移至光照度1500～2000Lx 条件下培养。
实验七 植物原生质体的分离和培养
实验七植物原生质体的分离和培养一、实验目的：了解植物原生质体分离的基本原理及其过程二、实验原理：植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是基于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，获得原生质体。
其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。
原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组成，以及原生质体收集方法有关。
酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。
游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。
三、实验用品1、器材：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅。
2、实验材料：菠菜叶片3、试剂：（1）、酶解液成分如下：纤维素酶(cellulase，Onozuka )2%；果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。
原生质体的分离和培养
时间 30min-------20h
4.木、草本植物使用时间不同
5.时间 4~24h 1g材料+10ml
二 原生质的培养
1.过程:原生质---细胞再生---细胞分裂--细胞团芽和根
2.培养方法
细胞植板法 半固体培养基 琼脂糖
优点:位置固定,方便观察 琼脂上细胞不易分裂 可降低渗透压
多用液体培养基: 可更换培养基 可降低细胞密度
----胚状体---植物
方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm×100mm的小 管中;
(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成 质量分数为0.01%,混匀;
(3).置于室温下5min后
用荧光显微镜观察
有活力: 荧光 无活力:无荧光
2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂
用荧光显微镜观察 培养基
有细胞壁 绿色荧光
无细胞壁:红色
将纯化后收集的原生质加入0.1%--0.05%的荧光增
白剂,染色5~10min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去
多余染料,如此重复3次.
1.营养成分 无机盐 有机物
激素
条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间,除去细胞后收集的培养基.
Ph值 5.6~5.8
2.原生质体的培养方法
2.酶解:
苄烷铵0.1%+酒精10%-- 5min 01
1.表面消毒:
60%~70%酒精消毒30s--- 0.1%HgCl2- 无菌水冲洗 3~5次 02 撕去叶片下表皮(向下)--- 漂浮于酶液中----------------纤维素酶:消化细胞壁纤维素
酶的选择: 静止 轻摇 易获得 酶处理简便
酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)---分离番茄根尖 细胞原生质体
原生质体培养
方法：
1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使 叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真 空渗入相结合。
3、酶处理
分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素 酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质 降解，前者是消化细胞壁纤维素。
对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能
Hemicellulase 63178,USA
酶处理效果
酶解时间
酶浓度
酶解温度
酶浓度
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离 原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而 悬浮细胞则用酶量较大。
酶解时间\酶解温度
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶 尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离 原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶 解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游 离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以 一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活 性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在 40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一 般都在25℃左右进行酶解。
1沉降法镍丝网滤出液置于离心管离心23分钟原生质体沉于离心管底部残液碎屑悬浮于上清液弃去上清液再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中反复3次常用的清洗培养基cpw盐溶液成mgl转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准一般500800rm的转速下离心35min
1、Protoplast A cell from which the entire cell wall has been removed Isolated protoplasts have been described as "naked" cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.
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原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
2. 固体培养 （平板培养）
含原生质体的固体培养基
35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体 溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂 糖凝固后，就成一薄层。
进行平板培养时，要注意混合时培养基的温 度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培 养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。 特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质 体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物 比较麻烦。
CPW=Cell-Protoplast Wash Medium
KH2PO4 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KI
27.2 mg/L 101.0 mg/L 148.0 mg/L 246.0 mg/L 0.16 mg/L
Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L
为了保持释放出来的原生质体的活力和膜 稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境 中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节
叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或 悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶 植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等） 也可用完全展开的叶片作材料。
二、 酶解处理
1. 酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成 分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的， 所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤 维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶 解液时可以用原生质体培养基作溶解剂， 也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
用X射线、γ射线、碘乙酸、碘乙酰胺处理一 个原生质体，使其核失活；用罗丹明（R-6-G， 一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化 过程）使另外一个原生质体的细胞质失活。
第七章 植物原生质体培养与 体细胞杂交
Plant Protoplast Culture and Somatic Hybridization
第一节 原生质体的用途
• 植物原生质体 (protoplast)是 没有细胞壁的 裸露细胞，它 在一些研究方 面具有独特的 优势。
1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、 细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程 与机理等问题的良好实验体系。
在培养过程中， 原生质体分裂开
始以后，培养基中的甘露醇或山梨 醇的浓度要逐渐降低，否则会影响 细胞的继续生长、分裂。待原生质 体形成的细胞团（愈伤组织）达到 1mm时，应将细胞团转移到新鲜的 培养基上继续培养。所形成的愈伤 组织就可以按照普通的愈伤组织进 行培养和植株再生。
三、影响原生质体培养效果的因素
2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质 粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外 源DNA，并整合到染色体上，从而实现 对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株 再生就可得到转基因植物。
GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响
GFP=绿色荧光蛋 白
PEG介导的甜橙原生质体转GFP
Sothern杂交分析 PCR分析
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
原生质体活力（%）=发荧光的原生质 体数/原生质体总数×100
FDA
FDA
酶水解
荧光素
紫外光
荧光素
荧光素双醋酸酯
细胞核
完整、有活力 的原生质体
第三节 原生质体培养
原生质体制 备好后，用 培养基将原 生质体调至 一定的密度 （最低起始 细胞密度以 上），及时 地进行培养。
在适宜的培养条件下，原生质体数 小时后开始形成新的细胞壁，在显微 镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为 方形、多边形等。约24-36h后，原生 质体开始发生第一次分裂；以后随着 细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。
2. 培养基
（1） 基本培养基：不同植物原生质体要求 有不同的基本培养基。使用什么基本培养 基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的 培养基。一般认为，原生质体培养基种的 大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元 素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性， 因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。
（2） 有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培 养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分， 如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛 血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰 胺有利于原生质体的分裂。
含原生质体的琼脂糖珠
液体培养基
（2）琼脂糖珠培养：用移液管吸取含原生质体的 琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝 固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。 也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用 刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。
改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可 以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。
第三节 体细胞杂交(somatic hybridization)
由于没有细胞壁的限制，原生质体可以彼此靠 近，通过膜的融合而融为一体。如果两个相同 的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍。
Protoplast fusion
如果两个不同植物的原生质体融合，则 就可以形成一个新的杂种细胞，此杂种细 胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。 两个不同植物体细胞发生融合的过程，称 为体细胞杂交。
第二节 原生质体的分离
要进行原生质体培养和操作，就必需 有大量高质量的原生质体。分离原生质 体主要采用酶解法。
酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原 生质体。酶解法分离原生质体的效率高， 用少量的材料就可以得到大量完整的原 生质体，已成为分离原生质体的最主要 方法。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
有些植物的原生质体可以自发融合， 但大多数植物的原生质体需要在诱导剂 的诱导下才能发生。诱导原生质体的方 法有化学法和物理法2种。
（一）化学诱导法
化学诱导法是利用一些化学物质，如 NPEaNGO）3、、高聚钙乙高二p醇H（等p。olyethylene glycol,
原理：消除原生质体表面的电荷，促进原 生质体彼此靠近、接触，并能促进接触 处的细胞膜发生融解，从而实现原生质 体融合的。
苜蓿原生质 体分裂
苜蓿原生质体形成细 胞团 6 weeks
8 weeks
苜蓿原生质体 再生植株
转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株
夜来香原生质体植株再生
1天
7天
5天பைடு நூலகம்10天
4周
5周
7周
单倍体烟草原生质体 培养与植株再生
杨树原生质体培养植株再生
7000,000cells/g fresh leaves 25000cells/ml; NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+ 0.05 TDZ M . PE: 34.7% at day 14
3. 液体—固体结合培养
含原生质体的液体培养基
固体培养基
（1）液体浅层—固体平板培养双层培养法： 培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再 将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表 面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释 放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加 入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物 质，促进原生质体的生长和分裂。
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。
(1) 聚乙二醇法（PEG） 聚乙二醇（PEG）是高分子的有机化
合物。用于诱导原生质体融合PEG的分子 量为6000。
PEG 诱 导 融 合 剂 一 般 用 0.01mol·L-1 CaCl2·2H2O溶液配制，PEG浓度为30%50%，蔗糖浓度为4%，可以用高温高压 法灭菌，可以在4℃下保存。
（3） 激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂 素和生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强， 所以培养基中大都要加2,4-D。
（4） 条件化培养基：使用条件化培养基可以大 大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
（5）培养基中的渗透压：原生质体无细胞 壁，所以培养基中必须使用渗透压调节 剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生 质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高 往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。 因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不 能太高，并且在后来的培养过程中要逐 渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于 细胞的持续分裂和生长。
期盼的马铃薯与番茄杂种植株
体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔 离的限制，为创造种间杂种、属间杂种， 甚至科间杂种创造了条件。
体细胞杂交包括4个过程： 原生质体的分离； 原生质体的融合； 杂种细胞的选择和植株再生； 杂种植株的鉴定。
一、原生质体的分离
二、原生质体的融合