第七章 植物原生质体培养

3. 体细胞杂交（somatic hybridization）： 由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原 生质体可以相互靠近，发生融合。2种不 同植物体细胞发生融合的过程，称为体细 胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞， 再通过植株再生就可能创造出新的植物个 体。
Tomato-potato hybrid
CPW=Cell-Protoplast Wash Medium
KH2PO4 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KI
27.2 mg/L 101.0 mg/L 148.0 mg/L 246.0 mg/L 0.16 mg/L
Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L
为了保持释放出来的原生质体的活力和膜 稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境 中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间 粘连；
原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
2. 固体培养 （平板培养）
含原生质体的固体培养基
35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体 溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂 糖凝固后，就成一薄层。
进行平板培养时，要注意混合时培养基的温 度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培 养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。 特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质 体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物 比较麻烦。
含原生质体的琼脂糖珠
液体培养基
（2）琼脂糖珠培养：用移液管吸取含原生质体的 琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝 固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。 也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用 刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。
改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可 以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。
2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质 粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外 源DNA，并整合到染色体上，从而实现 对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株 再生就可得到转基因植物。
GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响
GFP=绿色荧光蛋 白
PEG介导的甜橙原生质体转GFP
Sothern百度文库交分析 PCR分析
用X射线、γ射线、碘乙酸、碘乙酰胺处理一 个原生质体，使其核失活；用罗丹明（R-6-G， 一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化 过程）使另外一个原生质体的细胞质失活。
在培养过程中， 原生质体分裂开
始以后，培养基中的甘露醇或山梨 醇的浓度要逐渐降低，否则会影响 细胞的继续生长、分裂。待原生质 体形成的细胞团（愈伤组织）达到 1mm时，应将细胞团转移到新鲜的 培养基上继续培养。所形成的愈伤 组织就可以按照普通的愈伤组织进 行培养和植株再生。
三、影响原生质体培养效果的因素
苜蓿原生质 体分裂
苜蓿原生质体形成细 胞团 6 weeks
8 weeks
苜蓿原生质体 再生植株
转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株
夜来香原生质体植株再生
1天
7天
5天 10天
4周
5周
7周
单倍体烟草原生质体 培养与植株再生
杨树原生质体培养植株再生
7000,000cells/g fresh leaves 25000cells/ml; NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+ 0.05 TDZ M . PE: 34.7% at day 14
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
3. 液体—固体结合培养
含原生质体的液体培养基
固体培养基
（1）液体浅层—固体平板培养双层培养法： 培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再 将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表 面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释 放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加 入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物 质，促进原生质体的生长和分裂。
有些植物的原生质体可以自发融合， 但大多数植物的原生质体需要在诱导剂 的诱导下才能发生。诱导原生质体的方 法有化学法和物理法2种。
（一）化学诱导法
化学诱导法是利用一些化学物质，如 NPEaNGO）3、、高聚钙乙高二p醇H（等p。olyethylene glycol,
原理：消除原生质体表面的电荷，促进原 生质体彼此靠近、接触，并能促进接触 处的细胞膜发生融解，从而实现原生质 体融合的。
第二节 原生质体的分离
要进行原生质体培养和操作，就必需 有大量高质量的原生质体。分离原生质 体主要采用酶解法。
酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原 生质体。酶解法分离原生质体的效率高， 用少量的材料就可以得到大量完整的原 生质体，已成为分离原生质体的最主要 方法。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
(２) 高钙高pH法 高钙高pH法的诱导剂为： 0.05 M 甘氨酸-NaOH缓冲液
1.1% CaCl2·6H2O 9 % 甘露醇
pH 10.4 （过滤消毒，随用随配）
主要步骤：
（1）在离心管中分别将2种植物的原生质体密度调 至5-8×105 个/ml，然后等体积混合。
（2）向原生质体混合液中加入等体积的诱导融合剂， 轻轻摇匀后，放置10 min。高钙高pH法诱导融合 时要保温（30-37℃）。
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
（3）离心（100×g，10min），弃去上清液，用培 养基悬浮原生质体。
（４）重复（３）２－４次，最后用培养基调至适 当的密度。
（５）培养（液体浅层培养、平板培养等）
对称体细胞杂交: 2个原生质体的细胞质和细胞核完全融合形成
一个杂种细胞。
不对称杂交：
一个原生质体的细胞质完全丢失，另外一个原 生质体的细胞核完全丢失，再融合形成一个杂 种细胞。
2. 培养基
（1） 基本培养基：不同植物原生质体要求 有不同的基本培养基。使用什么基本培养 基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的 培养基。一般认为，原生质体培养基种的 大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元 素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性， 因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。
（2） 有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培 养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分， 如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛 血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰 胺有利于原生质体的分裂。
最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。
(1) 聚乙二醇法（PEG） 聚乙二醇（PEG）是高分子的有机化
合物。用于诱导原生质体融合PEG的分子 量为6000。
PEG 诱 导 融 合 剂 一 般 用 0.01mol·L-1 CaCl2·2H2O溶液配制，PEG浓度为30%50%，蔗糖浓度为4%，可以用高温高压 法灭菌，可以在4℃下保存。
第七章 植物原生质体培养与 体细胞杂交
Plant Protoplast Culture and Somatic Hybridization
第一节 原生质体的用途
• 植物原生质体 (protoplast)是 没有细胞壁的 裸露细胞，它 在一些研究方 面具有独特的 优势。
1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、 细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程 与机理等问题的良好实验体系。
第三节 体细胞杂交(somatic hybridization)
由于没有细胞壁的限制，原生质体可以彼此靠 近，通过膜的融合而融为一体。如果两个相同 的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍。
Protoplast fusion
如果两个不同植物的原生质体融合，则 就可以形成一个新的杂种细胞，此杂种细 胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。 两个不同植物体细胞发生融合的过程，称 为体细胞杂交。
原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来 衡量。
1. 植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原 生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、 同一植物不同的品种，其遗传组成存在差异， 原生质体的培养效果也就必然有差异。如 Yamada曾用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组 织，再建立悬浮细胞培养，以悬浮细胞分离原 生质体，结果只有1个品种的原生质体再生了植 株。一般来说，容易培养的植物、外植体，其 原生质体也容易培养，反之，亦然。草本比木 本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
原生质体活力（%）=发荧光的原生质 体数/原生质体总数×100
FDA
FDA
酶水解
荧光素
紫外光
荧光素
荧光素双醋酸酯
细胞核
完整、有活力 的原生质体
第三节 原生质体培养
原生质体制 备好后，用 培养基将原 生质体调至 一定的密度 （最低起始 细胞密度以 上），及时 地进行培养。
在适宜的培养条件下，原生质体数 小时后开始形成新的细胞壁，在显微 镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为 方形、多边形等。约24-36h后，原生 质体开始发生第一次分裂；以后随着 细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。
剂。
常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和 山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体 用什么浓度，可根据材料的水势来确定。
酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进 行灭菌，并且随配随用。
2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放 出原生质体的过程。
叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心 后再酶解。
期盼的马铃薯与番茄杂种植株
体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔 离的限制，为创造种间杂种、属间杂种， 甚至科间杂种创造了条件。
体细胞杂交包括4个过程： 原生质体的分离； 原生质体的融合； 杂种细胞的选择和植株再生； 杂种植株的鉴定。
一、原生质体的分离
二、原生质体的融合
原生质体融合的过程完全是一个机械过 程，所有植物的原生质体都可以发生融 合。
（3） 激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂 素和生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强， 所以培养基中大都要加2,4-D。
（4） 条件化培养基：使用条件化培养基可以大 大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
（5）培养基中的渗透压：原生质体无细胞 壁，所以培养基中必须使用渗透压调节 剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生 质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高 往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。 因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不 能太高，并且在后来的培养过程中要逐 渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于 细胞的持续分裂和生长。
叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或 悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶 植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等） 也可用完全展开的叶片作材料。
二、 酶解处理
1. 酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成 分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的， 所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤 维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶 解液时可以用原生质体培养基作溶解剂， 也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。