第九章++植物原生质体培养
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体培养的技术流程
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植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法原生质体培养办法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。
另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采纳饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。
而在原生质体应用于生物转化中时，常常采纳固定化原生质体培养技术举行固定培养。
一、固体平板培养法原生质体的培养办法和对培养条件的要求常与单细胞培养相像。
故原生质体的培养也可根据单细胞的平板办法举行。
首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管快速等量混匀，并快速转移到培养皿中，旋转培养皿，眨眼便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。
培养基层不宜过厚，普通2～3mm。
培养5～7d原生质体开头分裂，3周左右观看细胞植板率。
待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调整剂的新奇固体培养基中继代培养。
近年来发觉，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。
特殊是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，用法琼脂糖可能会取得比较好的效果。
低熔点琼脂糖可在30℃左右溶化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。
该办法的优点：原生质体分布匀称，有利于分裂；简单获得单细胞株系；可定位观看单个原生质体的生长发育状况。
缺点：原生质体易受热损害；易破裂；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。
二、液体浅层培养法尽管固体培养有上述优点，但无数讨论者还是喜爱用法液体培养基，这是由于，当用法液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的办法把培养基中的渗透压降低；另外，假如原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分别出来。
本办法是用液体培养基举行原生质体培养。
把纯化后的原生质体用液体培养基调节好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。
培养基层厚2～3mm。
培养5～10d细胞开头分裂，此时开头降低培养基中的渗透压。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程
内容:
植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,主要用于快速培养和大量繁殖目的植物的原生质体。
其技术流程主要包括以下几个步骤:
1. 选择培养原料。
选择健康、无病害的植株作为原生质体的供体,常选择嫩茎、嫩叶等组织。
2. 消毒和预处理。
使用烧瓶或培养皿,在无菌操作台进行表面消毒,然后剪切或撕取原生质体,进行预培养。
3. 建立原生质体悬浮培养系统。
将预培养的原生质体转移到含有培养基的烧瓶或培养皿中,保持液面悬浮状态培养。
4. 原生质体增殖。
在光照培养箱中培养,原生质体进行分裂增殖。
适时传代培养。
5. 原生质体发育。
当原生质体增殖到一定数量后,改变培养基成分,促进原生质体发育为细胞组织块体。
6. 组织块体生长。
继续培养,组织块体继续生长,并通过组织分化形成完整植株。
7. 移栽和驯化。
将组织块体或小植株移植到培养基中生根定植,然后
逐渐转移到土壤中,进行环境驯化,最后完全转入盆栽或野外栽培。
通过上述技术流程,可以实现大量快速培养目标植物的原生质体,并最终获得完整的植株,实现规模化种植。
植物原生质体培养
a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates, c freshly isolated protoplasts from suspension culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts, f cell colonies derived from protoplast, g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose, h green shoot formation, Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye. i fertile green plant
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
①材料准备：植物的幼嫩部分——幼叶、根、下 胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。 ②材料预处理：
叶片萎焉处理——日光下2－8小时 叶片预培养——如羽衣甘蓝诱导愈伤组织 培养基 培养7天后 预先质壁分离——糖溶液中质壁分离
③ 酶解 • • • • • 纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶
②酶解法
第九章 新品种培育概述
四、多倍体和单倍体
1.染色体工程：多倍体育种和单倍体育种
人的染色体
• 1.特纳氏综合症（Turner）是常见的女性性染色体异常疾病。 常见的核型是45,X,少数是嵌合体,出生率1/2500～1/5000。 身材矮小，原发性闭经，性幼稚，蹼颈，后发际低，宽乳距, 肘外翻是本病的主要临床特征。 • 2.克氏综合征（Klinefelter Syndrome） 是常见的男性性染 色体异常疾病，典型的核型为47，XXY。表型特征有睾丸发育 不全。身材修长，乃足跟至趾骨间的距离增长所致。男子乳 腺发育、阴毛呈女性型分布，阴茎及睾丸均小。严重者伴有 智力迟钝、隐睾及尿道下裂等。本病发生率较高,在新生活婴 中的发生率是1.4～2.9％，是男性不育症中常见的一种。 • 3.爱德华综合征Edwards：染色体异常为18三体。表型特征有 智力低下、小头、前额窄、枕部突、小颌且张口范围小，腭 弓高窄、低位耳、肾畸形、肌张力增高及手紧握等。
臂部分或全部缺失。表型特征有：婴儿时期哭声似猫叫，因 而得名，可有喉器小和会厌小等喉部发育异常。严重智力低 下，小头、圆形脸、眼距宽、眼裂下斜、耳位低、内眦赘皮， 贯手等多种畸形，约一半患者有先天性心脏病，智力低下， 生活能力差，常早亡。4P-综合征类似5P-综合征，但常常更 为加重，还可呈尿道下裂,腭裂、严重的精神以及运动障碍， 癫痫发作等，属少见病例。 • 6.染色体断裂综合征：可见大量染色体断裂，多由于范可尼 （Fanconi）综合征与Bloom综合征。
植物组织培养与诱变育种相结合的关键问题：
第一,确定适合的诱变剂； 第二,确定适合的诱变材料(或靶细胞或靶组织)。选择诱变 的植物组织培养材料要考虑其分散程度和整齐度,以 及再生能力和再生途径,还要考虑能否获得足够大的
原生质体培养与体细胞杂交
看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
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但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
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原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
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原生质体的获得
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原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
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原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
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原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。
植物的原生质体培养PPT课件
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
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3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
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原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
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2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
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二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
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2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
第九章原生质体培养
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解 壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐 溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作 渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使 RNA酶不活化，并使离子稳定。
四.植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生 质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材 料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括：暗处理、预培养、低温处 理等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游 离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞， 找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细 胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol／L甘 露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中 只加0.4~0.45mol／L的甘露醇，两者差别较 大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表 皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表 皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉 轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将 材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不 均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将 原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行 酶解。
2.酶溶液的pH值 酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影 响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH 值为5．0时， 原生质体产生得很快，但损坏较严 重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时， 最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理 同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始 pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增 加，损伤的原生质体也少得多。
④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个 小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补， 不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激 活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用 一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的 不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分 化条件等。
植物原生质体培养
植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。
二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞，具有全能性。
原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。
三、材料、试剂与主要仪器1．仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL)，光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。
2．试剂（1）原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L，pH 5.8,灭菌。
（2）酚红（0.1%）：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
3．材料制备好的菠菜原生质体。
四、实验步骤1．原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中，500rpm 下离心10min，原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带，用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。
2．原生质体清洗用原生质体洗涤液（CPW液）重新悬浮原生质体沉淀，1000rpm下离心5min，使原生质体沉淀在试管底，重复清洗一次。
之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。
3．活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形，在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流运动。
可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上，加一滴0.1%的酚红染液，凡有活力的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。
4．密度调整用血球计数板于显微镜下计数，用液体培养基调整使原生质体浓度至105～106个/mL。
5．分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中，每皿4mL，于28℃下培养，第1d是暗培养，第2～3d光照度为300Lx，以后移至光照度1500～2000Lx 条件下培养。
实验九植物原生质体的分离和培养
实验九植物原生质体的分离和培养实验目的掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。
实验原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。
实验用品一、材料1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。
2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。
二、器材超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。
三、试剂1.70％酒精。
2.0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen80。
3.灭菌蒸馏水。
4.0.16mo／L和0.20mo／LCaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5.20％和12％蔗糖溶液，pHPH5.8~6.2。
6.酶液A纤维素酶(cellulae，OnozukaR-102％果胶酶(13ectinae，Serva)1%(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。
)甘露醇0.6mol／LCaCl2·2H2O0.05mol／LMES0.1％pH5．8～6．27．酶液B纤维素酶(OnozukaR-10)2％离析酶(MacerozymeR-10)1％半纤维素酶(hemicellulae，Sigma)0.2％甘露醇0.4mol／LCaCl2·2H200.1％MESPH5.8～6.2表22-1DPD培养基成分NH4N03KN03MgSO4·7H20CaCl2·2H2OKH2P04FeSO4·7H20Na2-EDTAMnSO4·H2ONa2MoO4·2H2OH3BO3ZnSO4·7H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2 O9．C81V培养基(表22-2)表22-2C81V培养基成分NH4N03柠檬酸铵尿素MgSO4·7H20CaCl2·2H2OKH2P04NaHCO3FeSO4·7H20Na2-EDTAMnSO4·H2OKICoCl2·6H2OZnSO4·7H2OCuSO4·5H2OH3BO3Na2MoO4·2 H2O含量（mg/L）100010010025040010015027.837.3100.750.02520.02530.25成分烟酸盐酸吡哆锌盐酸硫胺素肌醇叶酸水解酪蛋白甘氨酸谷氨酰胺色氨酸胱氨酸蛋氨酸胆碱葡萄糖玉米素萘乙酸pH含量（mg/L）111020015001010010105100.38mol／L0.10.25.8含量（mg/L）27014803405708027.837.350.1220.0150.01成分KI烟酸盐酸吡哆锌盐酸硫胺素肌醇叶酸甘氨酸生物素蔗糖甘露醇2，4一D激动素pH含量（mg/L）0.2540.741000.41.40.0420000.3mol ／L10.55.88．DPD培养基(表22-1)10.0.1％酚藏花红(配在0.4mol／L甘露醇中)。
第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体： 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研 究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法1 植物原生质体培养的简史植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。
原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。
其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。
早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。
直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。
M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。
悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。
同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。
2 原生质体培养方法2. 1 液体培养法2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture)这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。
这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。
用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。
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（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。
（二）培养细胞
由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养细 胞的生长速率和生长时期。 频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以处 于对数生长早期的细胞为好。即： 频繁继代（每2~3天继代1次）的悬浮培养物以及 处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。 利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细胞 壁的再生和细胞的分裂和分化。
和破碎的原生质体。
（二）接口法
1、方法：
先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（21%），再小 心的加入过滤处理的酶-原生质体混合液，以合适的速度离心， 原生质体将聚集于两液面之间。小心取出原生质体转入另一 离心管，用清洗介质清洗、离心，重复3次。最后以适当的密 度悬浮于液体培养基中。
2、优劣 该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但 采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。 用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度， 使原生质体漂浮于单一界面，且不影响原生质体的稳定性和 活力。
1、叶片 叶片来源丰富，供应及时，有明显的叶绿体存 在时也便于在细胞融合中识别。 2、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料 3、愈伤组织或悬浮培养细胞。
（二）分离原生质体的方法
1、机械分离法 2、酶法分离
酶法分离是利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类 降解细胞壁成分，获得原生质体的方法。
（1）分离原生质体的酶类 （2）酶解分离原生质体的方法 （3）酶解分离原生质体应注意的问题 根据植物材料种类选择所用酶的种类、处理浓 度、和处理时间。 酶解分离时应提供适宜的渗透压保护，以防原 生质体破裂。
不同植物适宜于分离原生质体的材料
不同科属的植物其材料特性存在差异，适宜于游离原生 质体的供体材料也异。
（1）茄科
一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片。 （2）十字花科
种子萌发4-5天的无菌苗的下胚轴为材料，具有原生质体 得率高、活力强、再生频率高等优点。
（3）豆科
以未成熟种子的子叶为材料。
原生质体培养一般采用液体培养
1、有些物种的原生质体不能在固体培养基上分 裂。 2、采用液体培养有利于调整培养基成分。 3、采用液体培养可将经过几天高密度培养之后
的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。
（一）液体浅层培养
1、方法 把原生质体以一定的密度（约2×105个/mL）悬浮在液体 浅层培养基中（浅层的厚度以1mm为宜），用石蜡膜封住平 皿后，放在适宜条件下培养。 2、优劣
（二）渗透压
原生质体再生细胞壁之前，必须在培养过程中 提供适宜的渗透压保护。 1、在原生质体培养中，一般常用的渗压剂有甘露醇、 山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等。 2、在原生质体培养中不宜使用电解质渗压剂。 3、原生质体再生细胞壁后应使培养基的渗透压逐步 降低。
（三）植物激素
1、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要 求存在较大的差异。 2、生长素中常用的是2,4-D、NAA，在细胞分裂素
1、酶种类、处理浓度、处理时间
（1）对于胚性愈伤组织、悬浮培养细胞
常用活性较强的酶的组合，如Cellulase RS、Pectolyase
Y-23、Rhozyme HP150，并且酶处理浓度应高些，用量应大 些。 （2）对于叶片、子叶、下胚轴等材料 常用Cellulase R-10 、Macerozyme R-10、Hemicellulase
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离 （一）分离原生质体的材料来源 （二）分离方法
1．机械分离法
2．酶法分离
（三）技术程序
二、原生质体的纯化
（一）分离原生质体的材料来源
游离原生质体时，植物叶片、花瓣、果实组织、子叶、 下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等都可作为材料 来源，但常用于分离原生质体的材料为：
1、方法 取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至45℃的含琼脂或 琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀 分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器内。
2、优劣
有利于原生质体均匀分布； 便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、 分裂等行为； 也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。
第三节 原生质体的培养
一、影响原生质体培养的因素
（一）基本培养基
（二）渗透压 （三）植物激素 （四）氮源 （五）复杂有机物 二、培养方法 三、培养密度
四、培养条件
（一）基本培养基
1、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且 培养基的基础成分多采用B5或MS培养基的配方。如 KM8P和K8P培养基： 以B5培养基为基础 NT培养基： 以MS培养基为基础 2、不同植物常采用的培养基 禾本科植物： MS、N6、KM； 十字花科和豆科： B5、KM8P、K8P、KM； 茄科： MS、NT、K3
①两步分离法 这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使 植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤
后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。
②一步分离法
即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，
对材料进行一次性处理，处理温度25~30℃，处理的
时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2～24h。
（三）游离原生质体的技术程序
（4）禾本科 用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体建立胚性愈伤组 织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体。
二、预处理
1、依据材料特性进行表面灭菌 2、促使酶液渗入组织细胞内的措施 （1）撕去叶片的下表皮，将无表皮的一面向下 漂浮在酶溶液中。 （2）将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片，投 入到酶溶液中。 （3）真空渗入促使酶液渗透。 （4）酶处理期间进行搅拌或振荡。
（2）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结合 使用。 （3）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要 求较高的生长素/分裂素配比才能进行分裂； 由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体， 常需要较高的分裂素/生长素配比才能进行脱分化。
（四）氮源
许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质 体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。 NH4+浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养 基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体 有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中 NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂 都有利。 还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产生毒 害作用，因此使用时应特别注意其用量。
中最常用的是BAP、KT、2-IP。
3、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、
愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗），
需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调
整。
（1）在原生质体培养中，加入2,4-D对于原生质
体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈伤
组织是很有效的，如禾谷类植物。
（1）分离原生质体的酶类
酶的类型
纤维素酶
作用
常用种类
半纤维素酶
果胶酶
降解细胞壁中纤维素成分， Onozuka R-10 游离原生质体。 Phozyme HP-150 降解细胞壁中的半纤维素 成分。 降解相邻细胞间的果胶质， Macerozyme R-10 使细胞游离。
（2）酶解分离原生质体的方法
第二节 影响原生质体产量 和活力的因素
一、材料来源 （一）植物叶片 （二）培养细胞 二、预处理 三、酶处理 四、渗透压
（一）植物叶片
当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环 境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。 １、植株年龄 对一年生草本：生长40-60天的幼叶； 对多年生木本：幼龄且充分展开的叶片。 ２、母株生长环境 母株生长在低光强（10001x）、短日照、温度 20℃~25℃、相对湿度60％～80％的条件下，以及较 高的氮肥供应。 ３、采用离体苗叶片
优点是：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基 与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止 了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新 鲜培养基。
缺点是：原生质体分布不均，易造成局部密度过高或 原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育； 难以实施定点观察和跟踪观察。