免疫试验设计

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

免疫学实验设计

题目:StreamlineDireetHST分离卵黄抗体班级:2011级临床医学本科(12)班姓名:

StreamlineDireetHST分离卵黄抗体班级:2011级临床医学本科(12)班

作者及学号:

一、实验背景

1、卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin,lgY),目前研究较多的是鸡卵黄抗体。母鸡接受免疫后,在卵黄成熟期,血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中形成IgY。IgY是一种7S免疫球蛋白,分子量180kD,由两条重链(分子量22~30kD)组成,等电点接近5.2。IgY的结构虽与IgG相似,但其Fc段氨基酸组成与IgG相差很大,不结合类风湿因子,不与蛋白A、G以及哺乳动物Fc受体和补体结合。在免疫检测中,可代替哺乳动物来源的抗体,提高监测的特异性及敏感性。已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用,与其他用于被动治疗的免疫球蛋白相比,IgY具有价廉易得、稳定性好、可口服等优点,在疾病的免疫检测和防治方面具有良好的前景。

IgY具有以下优点:

(1)由于鸡与哺乳动物的种系关系较远,可产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体(在哺乳动物体内难以产生),用于免疫学测定“同时IgY不与类风湿因子

(RF)及哺乳动物补体结合,减少了免疫检测的干扰,提高准确性”。

(2)经特定抗原免疫后,母鸡产生对抗原的持久性应答,可不断获得特异性的多克隆抗体,其均来源于同一个体,抗体均一性好。

(3)卵黄中的IgY含量明显高于鸡血清中lgG的含量,约为巧一25mg/mL卵黄在相同的免疫时间内,由一只鸡所生鸡蛋中提取的抗体量是由一只兔的血清制备的120倍。

(4)IgY还可抵抗幼龄动物的胃酸屏障作用,并可抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。

鸡蛋提供了廉价易得的IgY来源,从一枚鸡蛋中可获得100~250 mg IgY。如何将大量的卵黄抗体提取出来,是决定IgY能否被广泛应用的一个重要前提。鸡卵黄中含水48%、蛋白质17.8%、脂肪30.5%,其中几乎所有的脂肪都与蛋白

质结合形成脂蛋白,IgY是水溶性的蛋白。从卵黄中获得卵黄抗体的过程包括IgY 分离、提取和纯化高含量的脂肪及脂蛋白。

2、StreamlineDireetHST是一种新型吸附剂,主要为阳离子离子交换吸附,同时伴有疏水作用,可以用来处理高粘度的料液。

已有实验成功实现了StreamlineDireetHST对模型蛋白的静态吸附。以牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白为模型蛋白,考察了pH和盐浓度对streamlineDireetHsT吸附蛋白质的影响。结果表明,streamlineDireetHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化,存在最适pH使得吸附容量最大,蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时,吸附过程由静电相互作用主导,吸附等温线符合Langmuir吸附方程;当存在静电排斥作用时,吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

StreamlineDirectHST吸附剂的吸附容量大,可以在很高的料液流速下高效吸附蛋白质。料液的盐浓度对于吸附没有大的影响,对于高粘度料液不需稀释可以直接进样,所以料液可以省去很多处理步骤,节约成本,可以采用提高离子强度或是改变pH来洗脱蛋白质。

既然IgY是一种蛋白质,因此,可以设计一个StreamlineDireetHST分离卵黄抗体IgY。

二、实验原理

阳离子交换型混合模式吸附剂streamlineDirectHST对蛋白质的吸附受pH和盐浓度的共同影响。streamlineDirectHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化,存在最适pH使得吸附容量最大,蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时,吸附等温线符合Langmuir吸附方程;当存在静电排斥作用时,吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

卵黄抗体在pH4一9之间性质较稳定,所以本实验采用pH4一9的缓冲液进行层析分离。

三、实验目的

1、了解streamlineDirectHST分离蛋白的原理。

2、探索streamlineDirectHST对卵黄抗体分离的可行性。

四、材料与方法

1、试剂与仪器

试剂:StreamlineDireetHST吸附剂,磷酸氢钠和磷酸二氢钠。

仪器:AKTA explorer 100层析系统,Ultrospec 3300 pro 分光光度计,台式PH/ISH测试仪。

2、方法

(1)卵黄水溶性组分(WSF)的提取

采用水稀释法除去卵黄中的大部分脂类。具体方法如下:取购自农贸市场的新鲜鸡蛋一只,打一小孔将蛋清倒出,将孔扩大并用蒸馏水冲洗卵黄1一2次。将卵黄倒至滤纸上吸干水分,刺破卵黄膜,使卵黄流出。将收集到的卵黄用蒸馏水稀释六倍,并用0.1M的HCI溶液调节pH至5.2,放入4摄氏度冰箱静置过夜。将卵黄溶液800Orpm离心30分钟,上清液中含有卵黄水溶性组分(包括卵黄抗体),沉淀弃去。

(2)StreamlineDireetHST分离IgY

取预处理好的卵黄稀释液的上清液,用0.2um滤膜过滤,作为进样样品,每次进样量为2ml。层析柱(内径1cm)中填充5ml Streamline Direct HST。使用AKTA explorer 100蛋白质分离纯化系统进行层析分离实验,改变平衡液与洗脱液的pH 和盐浓度进行层析分离,收集各流出组分,并作lgy电泳分析。

(3)SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳分离

配制30%凝胶贮液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、1%TEMED、10%AP、电极缓冲液与2x非还原态染色液。

制板:采用8%的分离胶和3%的浓缩胶。取待电泳的样品,与等体积的2x非还原态染色液混合。上样前沸水浴中3一5分钟。层析料液样品上样量为5ul,穿透液与洗脱液样品上样量为15ul。

五、实验预期结果与讨论

1、实验结果

StreamlineDireetHST成功分离了卵黄抗体

2、讨论

streamlineDireetHsT是阳离子交换型混合模式吸附剂,而卵黄抗体在pH5.0左右呈中性,净电荷为零。理论上分析,选择上样平衡液pH应该小于7.0,使

相关文档
最新文档