硫酸铵和氯化钠混合盐析米曲霉蛋白酶的研究
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收稿日期： ,$$F5$F5," 作者简介： 王燕 （ "-F"5 ） ， 女， 硕士， 讲师， 研究方向： 生物技术。 基金项目： 乐山师范学院科研项目 （ G$/$#, ） 。
期为下一步的研究奠定良好基础。
:! 材料与方法
$ !"#
!"!# 实验材料
米曲霉 （ !"#$%&’(()" *%+,-$） 沪酿 !"#$ % 购于中国 工业微生物菌种保藏管理中心； 酪蛋白、 酪氨酸 % 生 化试剂； 氯化钠、 硫酸铵、 盐酸、 氢氧化钠、 碳酸钠 % 分析纯； &’()*+ 酚试剂。
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$# 结果与分析
$-,% 三种不同溶液盐析后对酶活力的影响 $-,-,% 不同浓度硫酸铵盐析后对酶活力的影响 % 结 果如图 , 所示。由图 , 可看出， 经硫酸铵盐析后对酶 活力的影响曲线呈抛物线， 即刚开始随着硫酸铵浓 度的升高酶活力不断上升， 当硫酸铵浓度为 ,-8$1’( : 2 时， 酶活力达到最高值， 之后随着硫酸铵浓度再升高 酶活力逐渐下降。这可能是由于当硫酸铵浓度低于 ,-8$1’( : 2 时， 与蛋白酶相互作用的离子浓度低， 而不能 达到很好的盐析效果； 当硫酸铵浓度高于 ,-8$1’( : 2， 则盐浓度过高而抑制了酶活力， 以致所测酶活力逐渐 下降。因此， 通过图 , 可知， 经 ,-8$1’( : 2 硫酸铵溶液 盐析后的米曲霉蛋白酶酶活力最高， 为 0$-?,$C : 12。
# 提取时间、 提取温度、 硫酸铵浓度、 氯化钠浓度四个因素做 +（ 正交实验， 并且在已有成果基础上改变了正交实验提 - & ）
取时间的水平值， 最后经方差分析得到四个因素对酶活力都有显著影响， 米曲霉的最佳提取条件组合为： 在 #$0 下抽 提 !$*12 后用 $’,*34 ) + 的氯化钠和 $’$&*34 ) + 硫酸铵混合盐析。以该条件组合做验证实验得到的酶活力为 "#$’$""( ) *+。 关键词： 米曲霉， 蛋白酶， 盐析溶液
Байду номын сангаас
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表 ,% 因素水平表 因素 A （ 34# ） $ 56# 水平 @ 3=>( 浓度 > 提取时间 B 提取温度 浓度 （ 1’( : 2） （ 1)*） （. ） （ 1’( : 2） , "-$ "-", #" !" $ "-! "-"$ 0" #" ! "-# "-"! 9" 8"
!"$# 实验方法
硫酸铵和氯化钠 混合盐析米曲霉蛋白酶的研究
王! 燕 （ 乐山师范学院化学与生命科学学院， 四川乐山 !"#$$# ）
摘% 要： 硫酸铵和氯化钠是目前两种常用的蛋白酶盐析溶液， 实验尝试以其混合液作为米曲霉蛋白酶盐析溶液， 与单 硫 酸铵 溶 液盐 析得 到 的酶 活 力最 高 种盐析溶液提取效果进行比较， 混合液盐析得到的酶活力最高 "&&’""!( ) *+， !,’-",( ) *+， 氯化钠溶液盐析得到酶活力最高 !.’/,,( ) *+， 即混合液盐析效果明显优于单种溶液。另外， 进一步选取
图 ,% 硫酸铵盐析后对米曲霉酶活力的影响
$-,-$% 不同浓度氯化钠盐析后对酶活力的影响 % 结 果如图 $ 所示。由图 $ 可看出， 经氯化钠盐析后对酶 活力的影响曲线呈抛物线， 即刚开始随着氯化钠浓 度的升高酶活力不断上升， 当氯化钠浓度为 "-!1’( : 2 时， 酶活力达到最高值， 之后随着氯化钠浓度再升高 酶活力逐渐下降。这可能是由于当硫酸铵浓度低于 "-!1’( : 2 时， 与蛋白酶相互作用的离子浓度低， 而不能 达到很好的盐析效果； 当氯化钠浓度高于 "-!1’( : 2， 则 盐浓度过高而抑制了酶活力， 以致所测酶活力逐渐下 降。因此， 通过图 $ 可知， 经 "-!1’( : 2 氯化钠溶液盐 析后的米曲霉蛋白酶酶活力最高， 为 08-7$$C : 12。
期为下一步的研究奠定良好基础。
:! 材料与方法
$ !"#
!"!# 实验材料
米曲霉 （ !"#$%&’(()" *%+,-$） 沪酿 !"#$ % 购于中国 工业微生物菌种保藏管理中心； 酪蛋白、 酪氨酸 % 生 化试剂； 氯化钠、 硫酸铵、 盐酸、 氢氧化钠、 碳酸钠 % 分析纯； &’()*+ 酚试剂。
# <%++%( %33%/+ 3(.) +"% )#&%, $.21+#.*’ =* ;（ /.*$#,%(#*5 +"% 30/+.($ - & ）.(+".5.*02 %&’%(#)%*+ -0$ )0,% 0$ -%22 ，
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$# 结果与分析
$-,% 三种不同溶液盐析后对酶活力的影响 $-,-,% 不同浓度硫酸铵盐析后对酶活力的影响 % 结 果如图 , 所示。由图 , 可看出， 经硫酸铵盐析后对酶 活力的影响曲线呈抛物线， 即刚开始随着硫酸铵浓 度的升高酶活力不断上升， 当硫酸铵浓度为 ,-8$1’( : 2 时， 酶活力达到最高值， 之后随着硫酸铵浓度再升高 酶活力逐渐下降。这可能是由于当硫酸铵浓度低于 ,-8$1’( : 2 时， 与蛋白酶相互作用的离子浓度低， 而不能 达到很好的盐析效果； 当硫酸铵浓度高于 ,-8$1’( : 2， 则盐浓度过高而抑制了酶活力， 以致所测酶活力逐渐 下降。因此， 通过图 , 可知， 经 ,-8$1’( : 2 硫酸铵溶液 盐析后的米曲霉蛋白酶酶活力最高， 为 0$-?,$C : 12。
# 提取时间、 提取温度、 硫酸铵浓度、 氯化钠浓度四个因素做 +（ 正交实验， 并且在已有成果基础上改变了正交实验提 - & ）
取时间的水平值， 最后经方差分析得到四个因素对酶活力都有显著影响， 米曲霉的最佳提取条件组合为： 在 #$0 下抽 提 !$*12 后用 $’,*34 ) + 的氯化钠和 $’$&*34 ) + 硫酸铵混合盐析。以该条件组合做验证实验得到的酶活力为 "#$’$""( ) *+。 关键词： 米曲霉， 蛋白酶， 盐析溶液
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,-$-,% 酶活力测定% 采用 &’()*+ 酚法。 ,-$-$% 三种不同盐的比较实验 ,-$-$-,% 硫酸铵盐析对酶活力的影响实验 % 往发酵 好的培养物中加入一定量的蒸馏水， 用研钵进行研 磨后， #". 抽提 ,/ ， # 层纱布过滤， 得上清液即为粗 酶液。 取 0 份 ,"12 粗 酶 液， 边搅拌边缓慢加入 （ 34# ） 使其浓度分别为 " 、 "-70 、 ,-8$ 、 $-$9 、 !-"# 、 $ 56# ， !-9"1’( : 2， 于 #. 冰 箱 中 静 置 过 夜， 0"""; : 1)* 冷 冻 离心 $"1)* 。所得沉淀溶于 ,""12 <47-$ 的磷酸缓 冲液中， 然后测定酶活力。 ,-$-$-$% 氯化钠盐析对酶活力的影响实验 % 往发酵 好的培养物中加入一定量的蒸馏水， 用研钵进行研 磨后， #". 抽提 ,/ ， # 层纱布过滤， 得上清液即为粗 酶液。 取 0 份 ,"12 粗 酶 液， 边搅拌边缓慢加入 3=>(， 使其浓度分别为 " 、 "-, 、 "-$ 、 "-! 、 "-# 、 "-81’( : 2， 于 #. 冰箱中静置过夜， 0"""; : 1)* 冷冻离心 $"1)* 。 所得沉淀溶 于 ,""12 <47-$ 的 磷 酸 缓 冲 液 中， 然后 测定酶活力。 ,-$-$-!% 氯化钠与硫酸铵混合盐析对酶活力的影响 实验% 往发酵好的培养物中加入一定量的蒸馏水， 用研钵进行研磨后， #". 抽提 ,/ ， # 层纱布过滤， 得 上清液即为粗酶液。取 0 份 ,"12 粗酶液， 边搅拌边 使其浓度分别为 " 、 "-, 、 "-$ 、 "-! 、 "-# 、 缓慢加入 3=>(， "-81’( : 2， 再分别缓慢加入 （ 34# ） 使浓度为 $ 56# ， "-"" 、 "-", 、 "-"$ 、 "-"! 、 "-"# 、 "-"81’( : 2， 于 #. 冰 箱 中 静置过夜， 0"""; : 1)* 冷冻离心 $"1)* 。所得沉淀溶 于 ,""12 <47-$ 的磷酸缓冲液中， 然后测定酶活力。 ,-$-!% 提取时间对酶活力的影响实验 % 往发酵好的 培养物中加入一定量的蒸馏水， 用研钵进行研磨后， #". 分别抽提 $" 、 !" 、 #" 、 8" 、 0" 、 7" 、 9"1)* ， # 层纱布 过滤， 得上清液即为粗酶液。取经不同时间抽提 的 粗 酶 液 各 ,"12，都 边 搅 拌 边 缓 慢 加 入 3=>(、 使 3=>( 浓度为 "-$1’( : 2（ 、 34# ） （ 34# ） $ 56# ， $ 56# 浓度 为 "-"$1’( : 2， 于 #. 冰箱中静置过夜， 0"""; : 1)* 冷冻 离心 $"1)* 。所得沉淀溶于 ,""12 <47-$ 的磷酸缓 冲液中， 然后测定酶活力。 ,-$-#% 提取温度对酶活力的影响实验 % 往发酵好的 培养物中加入一定量的蒸馏水， 用研钵进行研磨后， $" 、 !" 、 #" 、 8" 、 0". 下抽提 ,/ ， # 层纱布过 分别于 ," 、 滤， 得上清液即为粗酶液。取经不同温度抽提的 粗 酶 液 各 ,"12，都 边 搅 拌 边 缓 慢 加 入 3=>( 和 使 3=>( 浓度为 "-$1’( : 2、 （ 34# ） （ 34# ） $ 56# ， $ 56# 浓 度为 "-"$1’( : 2， 于 #. 冰 箱 中 静 置 过 夜， 0"""; : 1)* 冷冻离心 $"1)* 。所得沉淀溶于 ,""12 <47-$ 的磷 酸缓冲液中， 然后测定酶活力。 ,-$-8% 正交实验 % 按 2（ !# ） 正交表进行正交实验， ? 因素水平见表 , 。
表 ,% 因素水平表 因素 A （ 34# ） $ 56# 水平 @ 3=>( 浓度 > 提取时间 B 提取温度 浓度 （ 1’( : 2） （ 1)*） （. ） （ 1’( : 2） , "-$ "-", #" !" $ "-! "-"$ 0" #" ! "-# "-"! 9" 8"
!"$# 实验方法
硫酸铵和氯化钠 混合盐析米曲霉蛋白酶的研究
王! 燕 （ 乐山师范学院化学与生命科学学院， 四川乐山 !"#$$# ）
摘% 要： 硫酸铵和氯化钠是目前两种常用的蛋白酶盐析溶液， 实验尝试以其混合液作为米曲霉蛋白酶盐析溶液， 与单 硫 酸铵 溶 液盐 析得 到 的酶 活 力最 高 种盐析溶液提取效果进行比较， 混合液盐析得到的酶活力最高 "&&’""!( ) *+， !,’-",( ) *+， 氯化钠溶液盐析得到酶活力最高 !.’/,,( ) *+， 即混合液盐析效果明显优于单种溶液。另外， 进一步选取
图 ,% 硫酸铵盐析后对米曲霉酶活力的影响
$-,-$% 不同浓度氯化钠盐析后对酶活力的影响 % 结 果如图 $ 所示。由图 $ 可看出， 经氯化钠盐析后对酶 活力的影响曲线呈抛物线， 即刚开始随着氯化钠浓 度的升高酶活力不断上升， 当氯化钠浓度为 "-!1’( : 2 时， 酶活力达到最高值， 之后随着氯化钠浓度再升高 酶活力逐渐下降。这可能是由于当硫酸铵浓度低于 "-!1’( : 2 时， 与蛋白酶相互作用的离子浓度低， 而不能 达到很好的盐析效果； 当氯化钠浓度高于 "-!1’( : 2， 则 盐浓度过高而抑制了酶活力， 以致所测酶活力逐渐下 降。因此， 通过图 $ 可知， 经 "-!1’( : 2 氯化钠溶液盐 析后的米曲霉蛋白酶酶活力最高， 为 08-7$$C : 12。