枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌分离及筛选鉴定实验方案
氯化钠 ５克
蒸馏水 １００毫０升
氯化钠 ５克
琼脂 １８克
4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min 灭菌
试剂： 40%NAOH(或 KOH)，肌酸。 3、 步骤：
1. 接种与培养 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 30 摄氏度培养 4 天。
2. 结果观察 在培养 4 天后，取培养液（约 2ml）和等量的 40%NAOH 相混合，如少量肌酸 （约 0.5—1mg），充分振荡， 2—5min 后如培养液呈红色，即为 V.P试. 验阳性， 有时须放置更长时间才出现红色反应。
ｐＨ ６．５ 121℃灭菌 20min
2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于
30 培养 3—7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理：
本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸
蒸馏0 克
pH
7.0-7.2
121℃灭菌 20min
淀粉培养基
牛肉膏 ５克
以补充胍基，可加速反应。反应式如下： 2 丙酮酸—— >乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳；
-2H 乙酰甲基甲醇———— >二乙酰；
+KOH
缩合 二乙酰 + NH=C(NH 2)2———— >红色化合物 2、 培养基和试剂 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节 PH 6.5，每管分装
抗生素标记枯草芽孢杆菌实验
利福平标记枯草芽孢杆菌实验1、实验材料1.1试剂利福平溶液：用95%乙醇配制10mg/mL的利福平溶液，配好后经0.22um无菌滤膜除菌。
1.2培养基NA（牛肉膏蛋白胨培养基）培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂18.0g，pH7.0-7.2200μg/mL利福平NA培养基：NA培养基经高温灭菌，冷却至50-55℃时加入利福平（1LNA培养基加入20mL10mg/mL利福平溶液）。
液体培养基为对应固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。
2、抗生素标记试验首先制备利福平浓度为100μg/mLNA平板，检测枯草芽孢杆菌天然抗药性。
根据天然抗药性检测结果，进行抗生素标记实验（杜立新等，2004），取纯化好的枯草芽孢杆菌单菌落接种到含有5ug/mL利福平NA液体培养基中，150r/min，28℃培养，待出现浑浊后稀释菌液，取三个不同浓度的稀释液100μL加到含有相同浓度抗生素的NA细菌平板，涂匀，继代培养一次，待长出单菌落后转入下一高浓度的利福平NA培养基，依次经过利福平5、10、20、40、80、120、160、200ug/mLNA液体培养基诱导，直至筛选出能耐受的最高利福平浓度200ug/mL。
筛选耐药枯草芽孢杆菌能否应用于研究，还必须验证其耐药的稳定性及拮抗性能。
耐药稳定性试验参考吴春胜等（1994）方法。
（1）将筛选的枯草芽孢杆菌在利福平含量依次升高的NA培养基上连续传代6次，观察其是否始终有菌落出现。
（2）将筛选枯草芽孢杆菌接种至不含利福平NA培养基中，连续传代3-5次，然后将其涂布于含200μg/mL利福平的NA培养基上，观察其是否有菌落出现。
（3）将抗药菌株置于4℃的低温中保藏2-3周，然后接种于含200μg/mL利福平的NA液体培养基上进行培养，观察是否出现浑浊，并在含200μg/mL利福平的NA培养基上划线培养，观察其是否有菌落出现。
设计实验分离合鉴别葡萄球菌,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌
设计实验分离合鉴别葡萄球菌,大肠杆菌和枯草芽孢
杆菌
实验目的：设计实验分离、合鉴别葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
实验步骤：
1. 准备培养基和试剂：制备具有区别葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的选择性培养基。
常用的选择性培养基有Mannitol Salt Agar（MSA）和MacConkey Agar（MK）。
2. 预处理样品：将待检样品进行合适的预处理，如食品样品进行均质化，水样本进行过滤等。
3. 涂布法分离：将预处理样品取一定量涂布在MSA和MK上，用锯齿刮子靠边均匀涂布。
4. 培养：将涂布的培养基培养于适宜的温度下，葡萄球菌在37℃培养24-48小时，大肠杆菌在37℃培养24-48小时，枯草芽孢杆菌在55-60℃培养24-48小时。
5. 观察结果：观察培养基上的菌落形态、颜色、透明度等特征，并注意特别有区分的特征，如葡萄球菌在MSA上产酸发酵，大肠杆菌在MK上产气发酵。
6. 进一步鉴定：对观察到的菌落进行进一步鉴定，如进行革兰氏染色、相关生化试验以确定菌株种属。
注意事项：
1. 实验过程需严格遵守无菌操作规范，以避免实验结果受到污染。
2. 实验过程需记载详细实验条件，以备后续数据分析和结果论证。
3. 实验结束后，对实验区域进行彻底清洁和消毒，防止细菌扩散传播。
芽孢杆菌的抑菌实验报告
一、实验目的本研究旨在探究芽孢杆菌的抑菌性能，通过体外实验方法，评估其对特定细菌和真菌的抑菌效果，为芽孢杆菌在生物防治、食品保鲜等领域的应用提供科学依据。
二、实验材料1. 实验菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、沙堡培养基。
3. 实验仪器：恒温培养箱、电子天平、移液器、牛津杯、无菌水、无菌滤纸等。
三、实验方法1. 菌悬液的制备：将实验菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基中，37℃恒温培养24小时，然后用无菌水稀释至适宜浓度。
2. 抑菌实验：- 将牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基分别铺成平板。
- 在平板中央放置牛津杯，并加入适量实验菌株菌悬液。
- 将平板置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。
- 观察并记录抑菌圈的大小。
四、实验结果1. 枯草芽孢杆菌对细菌的抑菌效果：- 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为15mm和12mm。
- 对枯草芽孢杆菌自身菌株无抑菌作用。
2. 枯草芽孢杆菌对真菌的抑菌效果：- 对白色念珠菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为10mm。
- 对枯草芽孢杆菌自身菌株无抑菌作用。
五、讨论与分析1. 抑菌效果分析：- 本实验结果表明，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有一定的抑菌效果，说明其具有一定的生物防治潜力。
- 抑菌效果与菌株的种类和浓度有关，本实验中枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好，可能与菌株本身的抑菌物质和代谢产物有关。
2. 实验局限性：- 本实验仅针对部分细菌和真菌进行了抑菌实验，未涉及更多菌株，实验结果可能存在局限性。
- 实验条件可能影响抑菌效果，如温度、pH值等。
六、结论本实验结果表明，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有一定的抑菌效果，为芽孢杆菌在生物防治、食品保鲜等领域的应用提供了理论依据。
枯草芽孢杆菌分离及筛选鉴定实验方案
附表：培养基的配方
肉汤琼脂培养基
牛肉膏 ５克
蛋白胨 １０克
ｐＨ ６．５ 121℃灭菌 20min
四、淀粉水解 1、原理：
许多芽孢杆菌产生淀粉酶， 能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 2、 培养基及试剂： 培 养 基 ： 在 肉 汤 琼 脂 中 添 加 0.2% 的 可 溶 性 淀 粉 ， 分 装 于 三 角 瓶 。
0.1MPa(15lbf/in2)20min 灭菌备用。
2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于
30 培养 3—7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理：
本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸
可溶性淀粉 ２克
琼脂 １５－克２０
蒸馏水 １００毫０升
ＨＨＪＳ－ＺＬ
枯草芽孢杆菌的鉴定实验
1. 形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等） ⑴单个菌体的形态 ⑵群体形态的观察
2. 革兰氏染色 3. 芽孢染色 4. 菌体大小测量 5．枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定：
一 过氧化氢酶测定 1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧 2、试剂： 3—10%过氧化氢 培养基：肉汤琼脂培养基 3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上， 30 培养 1—2 天。取一干净载玻片，在
枯草芽孢杆菌试验
4 初筛 观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌 种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30度 的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再进行分离纯化。 （若果不能用肉眼更好的观察，可以对其进行革兰氏染色 ，在显微镜下观察，与标准菌种比
1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数 2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观 察鉴定结果。
3.2 溶液或试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 可溶性淀粉 琼 脂 碘 碘原液 碘化钾 可溶性淀粉 磷酸 氢二钠 柠檬酸 氯化钴 重酪酸钾 0.01NHCL 3.3 仪器或设备 平板培养皿 试管 三角瓶 烧杯 称 量纸 高压蒸汽灭菌锅 干燥箱 无 菌吸管 无菌培养皿 酒精灯 接种 钩 滴管
1 制备土壤稀释液 选好采样点 ，去土表面5cm，去5-15cm处， 用无菌器具规范采样几十克。记录采样时间 ，地点环境等，以备考证。 采样后应尽快分离 。使土样与水分充分混合 ，将细胞分散，放入99ml无菌水三角瓶中， 80度水浴处理1小时候取出。 用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加 入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后 从该试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水 试管中，以此类推。制成五分不同稀释度的 土壤溶液。
2 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 3 、4 、5、三个稀释度，然后分别由3、4、5三管土壤稀释液中各 吸取0.2ml，小心的滴在对应的平板培养基表面中央位置。 用无菌涂布器涂布，均匀分布，在室温下静置5—10分钟，使 菌液浸入培养基。 3培养 将淀粉培养基平板倒置于30摄氏度的培养箱中培养 1-3 d
微生物设计性实验 第六组
3.1 选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选， 所以应选淀粉培养基。
配方： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 可溶性淀粉 琼脂 蒸馏水 调整PH值至 7.2 1.0g 2.0g 1.0g 2.0g 4.0g 200ml
枯草芽孢杆菌实验报告
枯草芽孢杆菌实验报告枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，具有很高的生物活性，对有机物质的分解和土壤健康有重要的作用。
本次实验旨在研究枯草芽孢杆菌的生长和代谢特性，通过定量测定菌落数量和产生抗生素的能力来评估其生物活性和潜在应用价值。
实验步骤：1.枯草芽孢杆菌的培养：取一瓶含有枯草芽孢杆菌的培养基，用无菌环针在琼脂培养基上划线，然后在37°C恒温培养箱中培养24小时。
2. 菌落计数：取一定量的培养基溶液，制备一系列稀释液。
然后，取1ml稀释液分别均匀涂布于琼脂培养基板上。
将琼脂培养基板置于37°C恒温培养箱中培养24小时。
3.菌落计数：取出培养好的琼脂培养基板，利用计数板或显微镜计数室计数菌落的数量。
将每个培养基板上菌落数量相近的三个培养基板进行组合平均，得到最终的菌落数量。
4.抗生素生产测定：取一定量的培养基，加入适当的抗生素敏感菌株。
利用纸片扩散法将培养基涂布于含有抗生素敏感菌株的琼脂培养基板上。
5.抗生素生产测定：将琼脂培养基板置于37°C恒温培养箱中培养24小时。
观察抗生素的形成情况，记录菌落周围的抑制圈直径。
实验结果：1. 菌落计数：测定了不同稀释液下的菌落数量。
结果表明，枯草芽孢杆菌在培养基中的生长有一定的限度。
菌落数量在1:10^-6的稀释液中最多，大约为10^6 cfu/ml。
2. 抗生素生产测定：枯草芽孢杆菌在琼脂培养基中显示出抗生素的生产能力。
抑制圈的直径与抗生素的浓度和种类有关。
枯草芽孢杆菌产生的抑制圈直径在15mm到25mm之间。
实验讨论：1.菌落计数的结果表明，枯草芽孢杆菌在一定程度上受到培养基成分和营养状况的影响，适宜的培养基组分可以促进菌落的生长和繁殖。
2.抗生素生产测定结果表明，枯草芽孢杆菌具有抗生素的生产潜力。
抗生素的生产能力可能与其竞争环境中的营养选择有关。
3.枯草芽孢杆菌的抗生素生产能力对于农业和医学领域具有重要意义。
进一步研究其抗生素成分和抗生素的生产调控机制，可以为抗生素的发现和利用提供新思路。
枯草芽孢杆菌实验报告
枯草芽孢杆菌实验报告枯草芽孢杆菌实验报告引言：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的细菌，广泛存在于土壤和水体中。
它以其多样化的生理特性和广泛的应用领域而受到科学家们的广泛关注。
本实验旨在研究枯草芽孢杆菌的生长特性、产孢能力以及对环境的适应能力。
材料与方法：1. 枯草芽孢杆菌培养基的制备：将蛋白胨、氯化钠和葡萄糖溶解于蒸馏水中，加热至溶解，然后用菌液过滤器过滤，得到无菌的培养基。
2. 枯草芽孢杆菌的培养：将枯草芽孢杆菌接种于培养基中，放入恒温培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养。
3. 枯草芽孢杆菌的生长曲线测定：每隔一定时间，取一定量的菌液进行测定，记录其光密度值，绘制生长曲线图。
4. 枯草芽孢杆菌的产孢能力测定：将培养基中的菌液经离心分离，取上清液，利用显微镜观察孢子的形态和数量。
结果与讨论：1. 枯草芽孢杆菌的生长特性：通过测定菌液的光密度值，我们可以观察到枯草芽孢杆菌的生长曲线。
在实验中，菌液的光密度值随时间的增加而增加，呈现出指数增长的趋势。
这说明枯草芽孢杆菌具有较快的生长速度和较高的繁殖能力。
此外，我们还观察到在培养基中，枯草芽孢杆菌呈现出白色或灰色的菌落，这与其常见的形态特征相符。
2. 枯草芽孢杆菌的产孢能力：通过观察上清液中的孢子形态和数量，我们可以评估枯草芽孢杆菌的产孢能力。
实验结果显示，枯草芽孢杆菌能够产生大量的椭圆形或椭圆球形的孢子，并且孢子的数量随着培养时间的延长而增加。
这表明枯草芽孢杆菌具有较强的产孢能力，这对于其在环境中的存活和传播具有重要意义。
3. 枯草芽孢杆菌的环境适应能力：枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤和水体中的细菌，具有较强的环境适应能力。
在实验中，我们将枯草芽孢杆菌培养于不同的温度和pH值条件下，并观察其生长情况。
结果显示，枯草芽孢杆菌在较宽范围的温度和pH值条件下均能够生长，但在极端的环境条件下，如过高或过低的温度、极酸性或极碱性的pH值，其生长速度和繁殖能力会受到一定的限制。
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、实验器材准备1.带有盖子的培养皿2.加满蒸馏水的试管3.注射器及针头4.培养基、琼脂、葡萄糖、干燥棉签5.无菌铲子6.无菌尖嘴瓶7.显微镜、移液器、平板振荡器等二、样品的采集和处理1.选择代表性的土壤样品，并在24小时内用无菌探针采集5个不同位置的样品。
2.将每个样品混合均匀，取适量的土壤放入无菌容器准备使用。
三、菌液的制备1.取一个含有褐青素盐琼脂（PDA）培养基的无菌尖嘴瓶，将葡萄糖加入培养基中，按照比例加入适量的样品。
2.将培养基瓶密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，杀死培养基中的已有细菌。
3.灭菌后将培养基倒入带有高度透明度的培养皿中，使其凝固。
四、制备样品的稀释液1.用蒸馏水装满试管。
2.将试管密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，避免试管中的无菌水受到外界污染。
五、稀释菌液1.使用无菌针头在凝固的培养皿上划线。
2.采用无菌技术，将针头刺入活菌样品中，然后点在琼脂上。
3.在培养皿上划线的其他位置也同样操作。
4.将培养皿倒置在25°C温度下放置24-48小时，直到菌落生长到适当大小。
六、菌液的计数1.使用无菌铲子在菌落上刮取一小段。
2.将刮取物重新悬浮在无菌试管中。
3.按照适当的比例将菌液和蒸馏水混合，制备一系列的稀释液。
4.取稀释液的适量放在培养皿中，使其均匀覆盖整个琼脂表面。
5.将培养皿密封并放置在25°C下培养3-5天。
6.在培养皿上观察并计数活菌数量。
七、结果的统计和计算1.统计每个培养皿上的活菌数目，计算平均值。
2.根据样品的稀释倍数、培养皿中的活菌数目和悬液中的总体积，计算出每克样品中活菌的数量。
八、数据记录和分析1.将实验过程中的数据记录清晰，并进行相关的数据分析和比较。
2.结果的可靠性可以通过加入对照组进行验证，确保实验结果的准确性。
九、实验安全注意事项1.在实验过程中要严格遵守无菌操作的原则，避免外界污染。
2.注意实验室卫生，保持实验环境整洁。
枯草芽孢杆菌硝酸盐还原试验
枯草芽孢杆菌硝酸盐还原能力测试
说起这枯草芽孢杆菌，那可是微生物界里头的一把好手，特别是在硝酸盐还原这事儿上，那是相当巴适。
咱们今天要摆的，就是关于它硝酸盐还原能力的测试。
要说这测试，那可不是随便搞哈，得讲规矩。
首先呢，得有个合适的培养基，要新鲜得很，不能是陈年老货。
培养基里头的东西，那都是有讲究的，得按说明书来，不能乱搞一气。
然后呢，还得有个恒温的地方，温度得刚刚好，高了低了都不行。
准备好了这些，那就开始动手。
把这枯草芽孢杆菌接种到培养基里头，放那恒温箱里头，让它好好长。
长个几天几夜，拿出来一看，嘿，那培养基的颜色都变了，这就是硝酸盐被还原的证据。
要说这枯草芽孢杆菌，那还原硝酸盐的能力可不是吹的。
你看那培养基，从原来的颜色变得跟啥似的，那就是它干的活儿。
这能力，在微生物里头，那可是数一数二的。
当然了，测试归测试，咱也得讲科学。
这测试结果，那得用显微镜、PCR这些高科技手段来验证，不能光凭眼睛看。
这枯草芽孢杆菌，它里头有些啥基因，有啥特性，那都得搞得清清楚楚，明明白白的。
总的来说，这枯草芽孢杆菌硝酸盐还原能力的测试，那可是个技术活儿，得讲规矩、讲科学。
只有这样，咱才能准确地知道它到底有多厉害，才能在食品、药品这些对微生物要求高的行业里头，保证产品的质量和安全。
所以说，这测试，那可是相当重要，马虎不得。
枯草芽孢杆菌实验报告
参加待测酶液1.00mL，立即摇匀并用秒表计时，准确反响5min。
立即用结晶枯燥的吸管吸取上述反响液1.00mL至预先盛有0.50mL 0.1mol/L HCl溶液和5.00mL碘液使用液的10mL具塞比色管中，摇匀。
以0.50mL 0.1mol/LHCl溶液5.00mL碘液使用液和1.00mL磷酸缓冲溶液的混合溶液做空白，于660nm波长下，用1cm比色皿迅速测定其吸光度，根据吸光度查附录“吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表〞，求得测试溶液的浓度C 。
4.结果分析
4.1平板涂布别离
经48h培养后，结果见表4-1
4.2平板划线别离
挑选10-5梯度的菌落进展平板划线别离，经48h培养后，每平板最大菌落结果见表4-2
表4-2 平板划线菌落状况
1号
2号
3号
4号
大小／cm
形态
0.5
外表光滑，
0.7
有褶皱呈
0.8
乳白色或
0.4
淡黄色圆形
经分析，由于菌体为野生菌而各自的生长能力不同，从而导致菌落大小不同。
4.3初筛
培养24h后，结果见表4-3
2.2 实验试剂
碘液储藏液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，参加11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用〔每月配制一次〕。
碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，准确参加2.00mL碘液储藏液，用水定容，贮于棕色瓶中备用〔每天配制一次〕。
20g/L可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于250mL烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下参加约80mL沸水，继续加热煮沸至透明〔20min〕，冷却后用水定容至100mL〔此溶液需当天配制，存放冰箱备用〕
枯草芽孢杆菌检验方法
枯草芽孢杆菌检验方法《枯草芽孢杆菌检验方法》一、检材收集1.选择霉变的植物组织作为菌源材料，如黄瓜等。
2.采集材料时尽量避免接触空气，少用铁器具，铝器具或木器具等，以防空气中杂菌接触样品。
3.采集材料后立即放入专用密封瓶中，加上10%硫酸铵或20%氯仿液，放入冰箱保存，温度不高于4℃，尽快进行检测，如果检测延期，应将样品冷冻保存。
二、实验注意事项1.穿实验衣时应注意洗手卫生，并用盐酸消毒手部。
2.在操作时必须保持仪器和设备的清洁，并用10%碘酒消毒。
3.在检验中，培养基内的枯草芽孢杆菌不可使用针刺，不可改变培养基中的条件，以便得到较好的定性结果。
4.实验时应注意消毒锥移动，尽量不要对培养基摇晃，以保证实验精准稳定。
5.操作时要保持实验环境的卫生，不允许有杂质进入。
6.在实验中，猪血液培养基、血琼脂培养基、深海水培养基等培养基必须在冰箱内保存，不能被高温污染。
三、实验步骤1.将收集的植物组织放入培养基中，用锥子搅拌，形成悬浮液。
2.将悬浮液过滤后，再按照特定比例加入新鲜糖水液，搅拌均匀。
3.将糖水液的混合物放入玻璃或塑料容器中，逐层培养，注意每层加入新鲜液体，使浓度在每一层保持均衡。
4.将每一层培养液涂布在培养皿中，放入恒温液槽或普通恒温箱中培养，其培养温度为30~37℃，培养时间为24~48h。
5.以血琼脂培养基进行培养，培养结束后根据各菌株的生长情况，判断枯草芽孢杆菌的存在情况。
四、结果判断1.枯草芽孢杆菌的培养结果以清楚的白色斑点或网状斑点作为判断标准，该斑点可发生在培养皿中每一层的表面上，或在培养皿中的深处。
2.如果在检测中发现枯草芽孢杆菌的表面，在下一轮检测时，可以使用更强的抗药材料，以防止对抗药性的增强，或者使用酸性培养基，以防止空气中的杂菌侵入。
3.如果在检验中发现枯草芽孢杆菌的表面，但未形成斑点，可说明该菌原未繁殖，应充分考虑菌株是否抗药性增强及其侵染原因等等。
4.如果在检验中没有发现枯草芽孢杆菌，可能是检材中没有枯草芽孢杆菌，也可能是过量空气、不合适培养条件等原因导致。
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。
以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。
将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。
2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。
3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。
4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。
5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。
同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。
2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。
b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。
c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。
d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。
e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
5-芽孢杆菌检测试验方法
芽孢杆菌检测试验方法所用的分析天平，移液管，滴定管，容量瓶等玻璃器皿按有关检定规定定期校正。
所用的水，在未注明其他要求量，均指蒸馏水或去离子水，所用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯(A.R)4.1 感官指标：4.1.1 感官特性：从抽取的样品中，取适量倒在白纸或玻璃板上，在光线充足的条件下，观察颜色和状态，并品尝滋味，闻其气味。
4.1.2 过筛率：随机抽取500 g样品，取40目和20目的筛子，将样品取出100g 称重，过筛，再次称重，计算过筛率。
过筛后的总质量过筛率=-----------------×100%过筛前的总质量4.2菌种鉴别4.2.1菌落形态：培养24小时，暗白色或浅黄色圆形菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。
4.2.2 镜检菌体形态：0.5-0.6*2.5-3.5微米，杆状，中生芽孢、即使孢囊膨大、也不显著。
4.2.3 革兰氏染色：革兰氏阳性菌。
4.3 芽孢杆菌活菌总数4.3.1仪器、设备、试剂和培养基a.分析天平，感量为0.01g；b.恒温水浴锅；c.震荡器；d.高分辨力相差显微镜；e.湿热灭菌锅；f.超净工作台；g.研钵；h.血球计数板，XB-K-25；i.血球计数板专用盖玻片，20mm×20mm；j.加样枪；k.各类玻璃器皿。
9ml0.85%的无菌生理盐水试管，80ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，30ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，空的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠），空的20ml的刻度试管，1ml吸管，培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。
上述物品，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。
在超净工作台上将灭好菌的营养琼脂倒平皿，每个大约20ml，放在紫外灯下吹风1小时，然后放在工作台面过夜，第二天备用。
4.3.2 预处理：准确称取样品 1.00克，将其全部转入一只已消毒的直径约10厘米的研钵中，从上述30ml 0.85%的无菌生理盐水三角瓶中取出约5ml水加入研钵，研磨10分钟，然后使用无菌生理盐水将其全部转移到空的20ml的刻度试管中，定溶至20ml，用振荡器震荡2分钟，将其全部震荡均匀。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
文件名称枯草芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号编制人编制日期年月日颁发部门审核人审核日期年月日印制份数批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
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枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案
一、材料准备
（1）实验仪器
培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪
（2）实验试剂
NA培养基：
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水
枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105
（3）培养基配方
牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。
二、实验步骤
（1）制备菌液
称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；
用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;
（2）进行涂板
向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；
待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；
每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；
将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。
（3）菌落计数
以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：
当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；
若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；
若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；
若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。
（4）结果统计与计算
有效活菌总数按式（1）计算；
A=B×C /D (1)
式中：
A——有效活菌总数，cfu/g ；
B——菌落活菌数；
C——稀释倍数；
D——涂板吸取菌液量
枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。
【作用机理】
1．枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
2．枯草芽孢杆菌迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长。
3．刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。
4．枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。
5．能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。
水产养殖
枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的抑制作用，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。
分泌大量几丁质酶的功能，几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质；分解池中残饵、粪便、有机物等,具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用；
枯草芽孢杆菌能够改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分；
枯草芽孢杆菌可以减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益，生物环保，刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力；减少对虾病害发生，明显提高对虾产量，从而提高经济效益，净化水质，无污染，无残留。