漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展

第8卷第2期2000年　6月 纤维素科学与技术Journal of Cellulose Science and T echnology V ol.8　N o.2Jun.　2000综述评论漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展Ξ李光日　余惠生3　付时雨　秦文娟(中国科学院广州化学研究所纤维素化学开放研究实验室　广州　510650)文　摘:综述了漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展。

漆酶的催化反应发生在铜离子形成的活性中心,但其氧化能力与氨基酸配体有密切的关系。

漆酶可应用于带有羟基或氨基的芳香族单体的聚合反应,偶氮染料的合成及降解,稠环芳烃的降解去毒等。

同时在纸浆的洁净漂白,化学分析中痕量物质的检测,食品的保鲜及改良和环保等方面有重要应用。

关键词:漆酶,催化活性中心结构中图法分类号:Q550　前　言漆酶是一类含铜的多酚氧化酶(P—diphenol:oxidoreductase,EC1.10.3.2)。

早在1883年,Y oshida从漆树的分泌物中发现了一种蛋白质,它可使油漆迅速固化[1]。

1894年Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶[2]。

随后人们发现这种酶不仅存在于漆树的分泌物中[3～5],而且存在于多种植物[6～8]、昆虫[9,10]和高等真菌中[11～15]。

近年来,漆酶在痕量物质的分析、染料合成与降解、食品性质的改良、环保和皮革工业等领域显示了较高的应用价值。

尤其重要的是漆酶在氧化还原介体的协助下具有降解木素的能力[16],可以用于纸浆中残余木素的脱除,有利于发展全无氯的纸浆漂白技术。

与传统的氯漂工艺相比,利用漆酶来脱除纸浆中的残余木素,不会产生有毒性的氯酚类化合物,对减少环境污染有着重要的意义。

因此漆酶作为一种具有很大的潜在应用价值的酶越来越受到人们的关注。

关于漆酶产生方面的研究大多数是以白腐菌为研究对象,只有少数是以细菌[17]为研究对象。

王佳玲等人对产漆酶白腐菌菌种,培养方式及产漆酶效果的影响因素等方面做过较为系统的总结[18]。

本文将分以下三个方面对近年来有关漆酶的一些研究结果进行扼要的综述。

1　漆酶的催化活性中心结构漆酶一般以单蛋白体的形式存在,其分子量范围一般是从52K Da到110K Da,也有些漆酶分子的分子量大于110K Da。

不同来源的漆酶其分子被不同程度地糖基化,碳水化合物含量占10%～45%(质量分数),一般情况下真菌漆酶的碳水化合物含量要低于植物漆酶的碳水化合物含量[19]。

含有糖基的蛋白不易结晶,为了研究漆酶蛋白多肽的收稿日期:2000-01-06国家自然科学基金和广东省科学基金资助课题3通讯联系人结晶结构,Ducros Valerie 等人首先将Coprinus cinereus 产生的漆酶利用酶法去除了糖基,然后以聚乙二醇为沉淀剂,利用悬滴法把它制作成小片晶体。

经过X —射线衍射分析,发现它们属于空间群P212121,单位晶胞参数为a =4.54nm ,b =8.57nm ,c =14.31nm [20]。

漆酶是一种铜蛋白,每个漆酶蛋白分子中含有四个铜离子[19]。

漆酶分子中的铜离子在催化氧化反应过程中起决定作用。

根据磁学和光谱学性质将漆酶分子中的四个铜离子分为三类:Ⅰ型一个,Ⅱ型一个,及Ⅲ型两个。

Ⅰ型铜离子是单电子受体,呈顺磁性。

若用电子顺磁共振(EPR )谱检测漆酶中的Ⅰ型铜离子,可以检测到很低的超精细分裂常数(＿Az {),依不同来源的漆酶其{Az {值的范围是40～95×10-4cm -1。

在C N -和N -3的存在下这个铜离子的EPR 谱没有明显的变化,因此可以断定这个铜离子深埋在漆酶分子的内部。

Ⅰ型铜离子呈蓝色,在λ614nm 处有特征的吸收峰。

Ⅱ型铜离子也是单电子受体,呈顺磁性,不显蓝色,亦没有特征的吸收光谱。

漆酶分子中的Ⅱ型铜离子是可以被替换的,它的去除对于Ⅰ型铜离子的吸收光谱有微弱的影响。

一般情况下Ⅱ型铜离子的{Az {>140×10-4cm -1。

Ⅲ型铜离子是偶合的离子对,是抗磁性的,因此甚至在室温下也检测不出其EPR 谱。

Ⅲ型铜离子在λ330nm 处有宽的吸收峰[19]。

表1 一些不同来源漆酶的氧化还原电势及部分氨基酸顺序漆酶部分氨基酸顺序E 0(V )S tL506　H C H I A W H V S G G L 5170.51MtL502　H C H I A W H V S G G L 5130.47Rs L459　H C H I D W H L E A G L 4700.71T v L452　H C H I D F H L E A G F 4630.78Pv L451　H C H I D F H L E A G F 4620.79zAO 506　H C H I E P H L H M G M5170.34　3　#　3 # # 3与III 型铜离子配位;#与I 型铜离子配位铜离子虽然是漆酶催化反应的活性中心,但其催化性能还受周围氨基酸配体的影响,因氨基酸配体的不同,漆酶的氧化能力是不同的。

表1是一些不同来源漆酶的部分氨基酸顺序及氧化还原电势值。

Xu Feng 等人利用此表分析了氨基酸配体对漆酶氧化还原电势值的影响。

从表中可以看出三个高E 0漆酶(T v L ,Rs L 和Pv L )具有亮氨酸—谷氨酸—丙氨酸三肽,两个低E 0漆酶(MtL 和StL )具有颉氨酸—丝氨酸—甘氨酸三肽,这些相当于zAO 中的513LH M 515。

这三个氨基酸是Ⅰ型铜离子囊形空穴的组成部分,也是束缚底物的活性空穴的组成部分。

与zAO 的氨基酸顺序类比,LE A ΠVSG 片段应与Ⅰ型铜离子和束缚底物的位置相接近。

LE A 片段的存在似乎与高的E 0值相关联,VSG 片段则似乎与低的E 0值相关联。

其次,与F 在T v L 和Pv L 中出现不同,L 在Rs L 中的位置相当于Ⅰ型铜离子轴向配体(zAO 中的M 517)。

另两个低E 0漆酶(MtL 和StL )中也可以发现到L ,这说明F 在这个位置上并不是高E 0的先决条件[21]。

这些分析至少在一定程度上可以说明氨基酸配体对漆酶的性质有重要的影响。

34第2期 李光日等:漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展 2　漆酶作为催化剂可催化的化学反应不同来源的漆酶催化氧化反应的能力是不相同的,其原因是漆酶和底物之间的氧化还原电势差的不同[19]。

能被漆酶催化氧化的不同类型的底物主要有酚类及其衍生物,芳胺及其衍生物,羧酸及其衍生物,甾体激素和生物色素,金属有机化合物及其它非酚类底物[如1,2,4,5—四甲氧基苯,1—苯基—2—(3,4—二甲氧基苯基)乙二醇,苯环上连有羟基,烷氧基,氨基的吲哚衍生物],这方面已有综述[22]。

下面将介绍近年出现的漆酶催化的新反应。

2.1　合成高分子化合物漆酶可以催化丁香酸的聚合,生成聚(2,6—二甲氧基—1,4—羟亚苯基)[23],漆酶也可以催化2,6—二甲基苯酚的聚合反应,生成聚(2,6—二甲基—1,4—羟亚苯基)[24]。

在兰格缪尔槽中漆酶可以催化4—四十烷氧基苯酚和六十烷基苯胺为单体的聚合反应,来合成二维电光高分子网络。

反应所利用的酶—水溶液—缓冲体系比起传统的大量利用有机溶剂的高分子聚合体系,可以大大减少环境污染[25]。

2.2　含氨基芳香环染料的合成和降解漆酶催化3—甲基—2—苯并噻唑啉腙和3—二甲基氨基苯甲酸之间的反应,生成兰色吲达胺染料[26]。

漆酶可以催化三唑类化合物与氢醌反应,高效率地合成3-取代的1,2,4—三唑并[4,3—b ][4,1,2]苯并噻二嗪—8—酮[27]。

其化学方程式如下:Chivukula 等人发现Pyricularia oryzae 漆酶可以催化氧化甲基、甲氧基、氯和硝基取代的4—(4′—磺酸基苯偶氮)苯酚等酚偶氮染料。

漆酶催化氧化4—(4′—磺酸基苯偶氮)苯酚的2,6—二甲基衍生物为4—磺酸苯基过氧化氢(SPH )和2,6—二甲基—1,4—苯醌。

2—甲基和2—甲氧基取代的染料氧化成为SPH 和2—甲基苯醌或2—甲氧基苯醌。

2,6—二甲氧基取代的染料被漆酶催化氧化产生六种产物。

其中的三种被确定为SPH ,4—羟基苯磺酸和2,6—二甲氧基苯醌。

这个反应说明漆酶对偶氮染料有去毒作用[28]。

2.3　降解稠环芳香化合物漆酶也可以催化稠环芳烃类化合物的氧化。

Trametes ver sicolor 产生的粗的漆酶制备物可以催化氧化蒽和致癌物苯并芘。

蒽被氧化的主要产物为蒽醌,苯并芘被氧化的产物有几种[29]。

在1—羟基苯并三唑和不饱和类脂类的存在下真菌漆酶能有效地催化44 纤维素科学与技术 第8卷氧化菲。

经过182h 的反应以后,起初反应的菲的72%被降解,主要反应产物为菲—9,10—醌和2,2′—联苯甲酸[30]。

这些研究显示白腐菌氧化有毒有机污染物多环芳烃时漆酶起着重要作用。

漆酶也可以在ABTS 的协助下将取代苯甲醇定量地转化为取代苯甲醛[31],在温和的条件下催化去除甲硫氨酸或色氨酸的苯酰肼保护基团[32],催化4—羟基扁桃酸和2—(4—羟苯基)甘氨酸的脱羧作用,使它们转化为同一产物4—羟基苯甲醛(H BA ),不继续转化为其它物质[33],漆酶亦可以催化四氯愈创木酚和四氯儿茶酚的脱氯反应[34]。

3　漆酶在应用领域的研究3.1　漆酶应用于纸浆洁净漂白传统的氯气漂白纸浆的工艺,因产生有毒的氯酚类化合物而带来严重的环境污染,所以成为逐渐被淘汰的工艺。

近年来出现的氧,臭氧和过氧化氢漂白工艺,虽然比起传统氯漂工艺减少了给环境带来的污染,但得到的纸浆的粘度,抗张强度等指标不太令人满意,且成本也比较高。

因此很多学者把目光投向纸浆的生物漂白上,因为利用酶法对纸浆进行漂白,不会产生有毒物质给环境带来污染,并且不会损伤纸浆中的纤维素和半纤维素组分,可提高纸浆质量。

自从Bourbonnais 和Paice 发现漆酶—ABTS[2,2′-azinobis -(3-ethylbenzthiazoline -6-sulfonate )]系统有氧化非酚型木素结构单元的能力[16]以来,吸引许多科学家研究利用漆酶—介体系统漂白纸浆,这些工作主要从漆酶的氧化性能,介体的选择及其作用机理等方面进行。

从目前报道结果来看,来自白腐菌的漆酶效果最佳,主要的有效介体有ABTS ,H BT ,NH A 和紫尿酸等,Call 等人在这方面做过系统总结[35]。

广州化学所利用选育出的白腐菌Panus conchatus 在39℃下发酵稻草得到的漆酶,以ABTS 为氧化还原介体,通过L (酶处理阶段)—Q (螯合阶段)—P (过氧化氢漂白阶段)过程处理芦苇硫酸盐纸浆,将其卡伯值从原来的17.4降低到4.4[36]。