转座子在转基因动物中的应用

转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）又称跳跃因子，其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动的ＤＮＡ片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。自１９５１年美国Ｍｃ－Ｃｌｉｎｔｏｃｋ在玉米中首先发现了ＤＮＡ转座子（ＤＮＡｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）以来，转座子已成为各种生物的基因分析的有效工具之一。不仅利用转座子诱变已找到原核生物的单性生殖基因［３］；而且在真核生物中，Ｐ－转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。近来，一些其他的转座子元件，如ｈｅｒｍｅｓ，ｈｏｂｏ，ｍａｒｉｎｅｒ，ｍｉｎｏｓ和ｐｉｇｇｙＢａｃ已成功在Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ、Ａｎａｓｔｒｅｐｈａｓｕｓｐｅｎｓｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｖｉｒｉｌｉｓ、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）以及包括鱼类、禽类在内的多种生物转基因中获得应用，２００５年７月复旦大学的丁昇在《ｃｅｌｌ》杂志上发表关于运用ｐｉｇ－ｇｙＢａｃ转座子作载体成功制作转基因脊椎动物——

—小鼠，更加显示了转座子作为转基因载体的优势与潜力。

１转座子的类型和基本结构

１．１ＤＮＡ转座子ＤＮＡ转座子是以ＤＮＡ－ＤＮＡ方式转座的转座子，可通过ＤＮＡ复制或直接切出两种方式获得可移动片段，重新插入基因组ＤＮＡ中，导致基因的突变或重排。但一般不改变基因组的大小。根据转座的自主性，ＤＮＡ转座子又分为自主转座子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ）和非自主转座子（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ），前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则要在自主转座子存在时才能够实现转座。玉米的Ａｃ／Ｄｓ体系就是典型的一例。活化子Ａｃ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）属于自主转座子，解离子Ｄｓ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）属于非自主转座子，只有在Ａｃ存在时，Ｄｓ才能转座。

１．２反转录转座子反转录转座子不同于转座子，是以ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ的途径来实现转座的，在整合酶的作用下新生成的以ＤＮＡ状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以会影响宿主基因的表达，在生物进化过程中反转录转座子起着不可忽视的作用［４］。

根据是否具有编码反转录酶的能力，反转录转座子可以分为两个家族：自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子O按照序列结构中有无长末端重复序列（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅ－ｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＴＲ）又可分为有ＬＴＲ反转录转座子和无ＬＴＲ反转录转座子。自主性反转录转座子包括内源性反转录病毒（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＥＲＶ）、ＬＴＲ反转录转座子及长散在元件（ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＬＩＮＥｓ）O非自主性反转录转座子包括短散在元件（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＳＩＮＥｓ）及修饰性反转录假基因（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｒｅｔｒｏｐｓｅｕ－ｄｏｇｅｎｅ）。

２转座子的转座机制

转座子都具有编码与转座作用有关的酶——

—转座酶的基因，而末端大多数都是反向重复序列。转座酶既识别转座子的两末端，也能与靶位点序列结合。转座作用的机制是转座子插到新的位点上产生交错切口，所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，然后由ＤＮＡ聚合酶填补缺口，ＤＮＡ连接酶封闭切口，交错末端的产生与填补说明了靶ＤＮＡ在插入位点存在正向重复，两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度，因此，每个转座子所特有的靶重复序列，反映了切割靶ＤＮＡ的酶的几何形状。

３主要运用于动物的几种转座子

３．１Ｐ－转座子Ｐ－转座子最初于果蝇中发现，并研究了其结构与功能，建立了Ｐ－转座子和转座酶辅助系统。该转座子能只在果蝇中作用。但该系统为以后的转基因动物提供了理论和实验基础。Ｐ－转座子长度为２．９ｋｂ，具有３１ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。中间有编码转座酶的可转录单位，以此产生转座子的精确切出和准确插入另一染色体位点（切出—粘贴反应）。Ｐ—转座子的功能还受其他核因子的影响，这些因子可能是不同昆虫中转座子发挥功能与否的条件。３．２Ｍｉｎｏｓ转座子Ｍｉｎｏｓ转座子是从海德尔果蝇Ｄ．ｈｙｄｅｉ中分离得到的，并首先应用与果蝇以外的昆虫转基因。Ｍｉｎｏｓ转座子长度位１．４ｂｐ，具有较长的１００ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。可转录单位为１个内含子。以地中海果蝇白眼基因为报告基因的研究表明，Ｍｉｎｏｓ转座子的转座效率在ＧＯ带１～３％，并能在双翅目核鳞翅目昆虫细胞及按蚊Ａｎｃｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ和大果蝇Ｄ。Ｖｉｒｉｌｉｓ昆虫个体中实现转座。３．３Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子是从马里塔尼亚果蝇Ｄ。Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ中发现的。长度２８ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）和特意性的ＴＡ目标结合位点。Ｍｉｎｏｓ转座子是至尽为止研究最深入的转座子之一。

３．４ｈｏｂｏ转座子因为Ｐ转座子只能在果蝇中实现转座，因此寻找其他转座子系统十分必要。Ｈｏｂｏ转座子就是其中

转座子在转基因动物中的应用

刘冬

（山西农业大学研究生学院，太谷０３０８０１）

摘要：转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一，作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆，一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。

关键词：转座子；转基因动物；昆虫；鱼类；哺乳动物

专论与综述

畜牧兽医科技信息２００７．０７

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之一。Ｈｏｂｏ转座子包括Ｈｅｒｍｅｒ（从家蝇Ｍｕｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃ分离）、Ｈｏｍｅｒ（从果实蝇Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａｔｒｙｏｎｉ分离）和ｈｏｐｐｅｒ（从桔小实蝇Ｂ．ｄｏｒｓａｌｉｓ分离）等。其中Ｈｅｒｍｅｒ转座子是目前发现的唯一有效转座子。Ｈｅｒｍｅｒ转座子由２７３９ｂｐ组成，含有１７ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。Ｈｅｒｍｅｒ转座子已通过转座酶辅助质粒和ｈｓｐ７０启动子用于果蝇的高效转座。研究表明该转座子具有较广泛的受体适应性，目前已在埃及伊蚊Ａｅ．ａｅｇｙｔｉ、赤拟果盗Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ、厩鳌蝇Ｓｔｏｍｏｘｙｓｃａｌｃｉｔｒａｎｓ、五代淡色库蚊Ｃｕｌｅｘｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ和地中海果蝇Ｃｅｒａｔｉｔｉｓｃａｐｉｔａｔａ等昆虫的应用。

３．５ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子是来源于鳞翅目昆虫的ＤＮＡ型转座子，最初是在杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）浸染粉纹夜蛾Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ昆虫ＴＮ－３６８细胞株系时，首次分离得到的。

１９９８年Ｃａｒｙ首次发现ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子。后来有人研究表明，它能够在多种昆虫中进行转座，并以多拷贝存在于受体基因组中。到目前为止，他被改造为整合型载体，先后成功地对Ｂｏｍｂｙｘ、ｐｉｎｋｂｏｌｌｗｏｒｍ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍｅｄｉｔｅｒ－ｒａｎｅａｎｆｒｕｉｆｔｌｙ等鳞翅目或非鳞翅目昆虫稳定，高频率的遗传转化。

４利用转座子培育成的转基因动物

４．１转座子元件在亲缘关系较远昆虫中转座转座子能够切出并发生转座的特征为获得转基因动物提供了条件。ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子的准确切出总是伴随着转座，在转座时能够携带外源基因进入受体基因中，并且允许其在新的基因组中表达。携带的基因没有大小限制。目前已成功获得的有转基因地中海果蝇，转基因黑腹果蝇，转基因家蚕。ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子在地中海果蝇、黑腹果蝇、家蚕和等３个亲缘关系较远的昆虫中能作为一个高效、稳健的载体对基因转移，并促进生殖种系的转化，

４．２转座子元件导入斑马鱼多年前，已利用显微注射技术成功制备出转基因斑马鱼，而且转基因实现了种系传递，只是种系传递的效率只有０％～２０％，转基因的表达也不稳定。后来，利用假型反转录病毒作载体大大提高了外源基因的转化效率（可达到１００％）和种系传递的效率，且已用于斑马鱼胚胎发生的相关基因的克隆和突变。近几年的研究发现ｍａｒｉｎｅｒ／Ｔｃ１家族的转座元件也可转化脊椎动物，例如在秀丽线虫中发现的Ｔｃ３转座元件已经成功转化斑马鱼，１９９８年Ｆａｄｏｏｌ等将ｍａｒｉｎｅｒ元件成功地转入了斑马鱼中，并实现了种系传递。

４．３转座子元件导入禽类近年来，禽蛋生物反映器以其自身的优势和不可限量的前景渐渐成为一个新的研究热点，但转基因禽类的制备一直以来都缺少一种有效的、非病毒介导的基因转化系统，这使得这个系统发展非常缓慢。Ｒｏｓｌｉｎ研究所的研发人员报道了利用一种利用ｍａｒｉｎｅｒ转座元件将外源基因高效导入鸡基因组的方法，提高了外源基因在鸡基因组的整合效率，展示了制备转基因禽类的前景。

１９９８年，Ｓａｎｇ等用来自果蝇Ｄ．ｍａｕｒｉｔｉａｎａ的自主性ｍａｒｉｎｅｒ元件Ｍｏｓ１成功地对鸡进行了种系转化。他们将构建有Ｍｏｓ１元件的质粒ｐＭｏｓｌ注入鸡受精卵胚盘的细胞中（有的受精卵还同时注入了纯化的转座蛋白酶），对存活１２天的胚胎提取ＤＮＡ，用ＰＣＲ法检测Ｍｏｓ１及载体序列的存在，结果显示含１拷贝Ｍｏｓ１的胚胎占２７％（１２／４４），这与ｍａｒｉｎｅｒ元件对其天然宿主果蝇的转化率相当，比其他基因构件物的随机整合率高２０多倍（用鸡溶菌酶基因的载体转化率还不到１％），且７９％（２３／２９）的Ｍｏｓ１阳性个体都未检测到载体序列。Ｇ１代个体基因组中Ｍｏｓ１元件的阳性率达２９％（２７／９３），是一般基因构建物种系传递效率的１０倍。从Ｇ１代鸡基因组中克隆出单拷贝的Ｍｏｓ１片段，通过分析鉴定证明插入鸡基因组的是完整的Ｍｏｓ１元件，且在插入位点有ｍａｒｉｎｅｒ转座所产生的特征性的ＴＡ重复序列，说明Ｍｏｓ１元件已离开质粒载体与鸡基因组整合。Ｇ２代中ｍａｒｉｎｅｒ元件的阳性率接近５０％，且两拷贝的ｍａｒｉｎｅｒ元件从Ｇ１代稳定地传到Ｇ２代说明ｍａｒｉｎｅｒ元件与基因组整合后是比较稳定的，ｍａｒｉｎｅｒ元件在转入Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ基因组后同样也是稳定的，其转座概率低于０．１１％。而且发现与ｍａｒｉｎｅｒ一同注入的转座酶并未提高转座率，如果用ＴｅｔＲ插入ｍａｒｉｎｅｒ元件阻断转座酶基因的表达，却使转座率明显下降，说明ｍａｒｉｎｅｒ元件的转座主要是转座酶基因表达产物催化的。

Ｎａｒｉｎｅｒ元件对斑马鱼和禽类种系转化的成功将其适用范围扩大到了脊椎动物，同时也为转基因动物的制备提供了新的有效的基因导入方法。

４．４转座子元件导入哺乳动物过去转座子元件只是在较低等的生物中进行转基因动物和插入突变研究，相反，由于缺乏一个有效的转座子系统，转座子在小鼠和其他脊椎动物中的应用受到了限制。上海复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾的ＰＢ（ＰｉｇｇｙＢａｃ）转座子（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）用于小鼠和人类细胞的基因功能研究，他们发现ＰＢ转座因子可在人等哺乳动物的细胞株中高效导入基因并稳定表达，为体细胞遗传学研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统。复旦大学的丁昇［２］于２００５年７月在《ｃｅｌｌ》杂志上发表关于ＰＢ（ＰｉｇｇｙＢａｃ）转座子在哺乳动物细胞和小鼠中高效转座，并成功培育出带有荧光的转基因小鼠。这是在世界上首次创立了一个高效实用的哺乳动物转座因子系统，为大规模研究哺乳动物基因功能提供了崭新途径

在上述转基因动物的基因组中都存在载体ＤＮＡ，在所有插入位点都存在ｐｉｇｇｙＢａｃ末端反向重复系列，该序列与已知的ｐｉｇｇｙＢａｃ目标位点、特征性的ＴＴＡＡ序列相连接，并与ｐｉｇｇｙＢａｃ因子特殊性的转座相符合，表明他们在生殖种系的转化是由ｐｉｇｇｙＢａｃ转座子促成的染色体转座，而非染色体的随机重组引起的，是作为一个孟德尔遗传因子整合上去的，并遵循孟德儿遗传规律被稳定地遗传到下一代。

随着各种转基因技术和手段的日渐成熟，转基因动物相继问世。利用转座子的转座功能建立转基因生殖系是当前动物转基因研究的重要方法，此方法已在果蝇、蚊子等昆虫中广泛应用，近年来也开始研究转座子在其他动物转基因中的作用。转基因工程将成为研究基础生物学科、品种改良和生产特定生物制品的重要手段。（参考文献从略）

专论与综述

畜牧兽医科技信息２００７．０７１９