杜雾晨--高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用-Word整理

HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。

近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。

本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。

关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。

多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。

蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。

研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。

多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。

化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。

杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。

由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。

因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。

高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。

而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术范围内一有力高效的分离工具[2]。

1 多肽的合成1.1多肽合成的分类多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。

化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。

在合成含有特定顺序的多肽时，由于合成原料中含有官能度大于2 的氨基酸单体，合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了合成目标产物的定向性。

多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。

多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。

逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。

片段组合法[3]主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。

近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。

在多肽片段合成法中，根据多肽片段的化学特定性或化学选择性，多肽片段能够自发进行连接，得到目标多肽。

因为多肽片段含有的氨基酸残基相对较少，所以纯度较高，且易于纯化。

1963 年，美国著名生物化学家Merrifield提出了固相合成法，开展了多肽固相合成，即将氨基酸的C末端( 羧基端) 连接在不溶树脂上，然后在此树脂上依次进行氨基酸的缩合、延长肽链。

固相合成方法可分为叔丁氧羰基( Boc)方法和 9-芴甲基氧羰基( Fmoc) 方法[4]。

人们以多肽的液相和固相合成方法为基础又发展了氨基酸的羧内酸酐( NCA) 法、组合化学法等。

多肽的生物合成方法主要包括发酵法、酶解法，随着生物工程技术的发展，以 DNA 重组技术为主导的基因工程法也被应用于多肽的合成。

1.2 多肽的固相合成Merrifield创建并发展了多肽的固相合成方法之后,多肽研究领域发生了划时代的变化。

固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性,应用这一神奇的方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。

其基本原理如下图所示:图1 多肽的固相合成原理多肽的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端( 氨基端) 进行合成。

多肽固相合成的原理是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸 N 端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。

显然,用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满个条件:一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上,然后从氨基端逐步增长肽链;二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护,反应完成后再将保护基团除去;三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化[4]。

1.2.1 聚合物载体和连接分子考虑到固相合成多肽的特殊性,用于固相合成多肽的载体在合成条件下应是惰性的、不溶性的交联聚合物,并能够对单体中活性基团进行选择性保护和去保护;连接反应物到载体上的方法应便于在合成过程中分析反应过程且最后给出目标物时,可以选择性地从载体上裂解下一部分或全部产物。

载体有两种类型可供选择,一种是微孔溶胀型,另一种是大孔非溶胀型。

非溶胀型树脂反应后易于过滤回收,活性基的可接近性好,对反应物的扩散阻力小,几乎可在任何溶剂中使用;溶胀型树脂机械强度高,不易破坏,功能基化反应速度快,负载容量高,但须在溶胀性能良好的溶剂(如氯仿、二氯甲烷、苯、二氯六环、四氢呋喃等)中使用。

在大多数固相合成多肽中,溶胀型树脂均优于非溶胀型树脂[5]。

图2 固相合成中常用的树脂在固相合成中,连接分子发挥着重要作用，它决定着从固相载体上把产物裂解下来的方法以及产物末端所暴露出来的功能团。

固相合成多肽曾经使用过键合不同连接分子的聚合物,这些连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。

一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定,并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子[6]1.2.2 氨基的保护方法氨基是亲核性很强的基团。

氨基经酰化后,亲核性消失,因此对游离氨基实施酰化是保护氨基的基本方法。

但是,考虑到肽键形成后,应能在温和条件下将保护基除去,因此对氨基保护基有特殊要求。

常用的氨基保护基有9-芴甲氧羰基(Fmoc),叔丁氧羰基(tert- butoxycarbonyl group,简称t-Boc)。

图3 BOC和FMOC1.2.2.1 Boc合成法Boc方法是经典的多肽固相合成法，以Boc（叔丁氧羰基）作为氨基酸α-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc的脱除通常采用三氟乙酸(TFA) 进行。

合成时将已用Boc保护好的N-α-氨基酸共价交联到树脂上，TFA切除Boc保护基，N端用弱碱中和。

肽链的延长通过二环己基碳二亚胺(DCC)活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸(HF) 法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。

在Boc合成法中，为了便于下一步的合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等[7]。

1.2.2.2 Fmoc合成法Carpino和Han以Boc合成法为基础发展起来一种多肽固相合成的新方法—Fmoc 合成法。

Fmoc合成法以Fmoc（9-芴甲氧羰基）作为氨基酸α-氨基的保护基。

其优势为在酸性条件下是稳定的，不受TFA 等试剂的响，应用温和的碱处理可脱保护，所以侧链可用易于酸脱除的Boc保护基进行保护［8］。

肽段的最后切除可采用TFA\二氯甲烷(DCM) 从树脂上定量完成，避免了采用强酸［9］。

同时，与Boc法相比，Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc基团本身具有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行［10］。

Fmoc 法在多肽固相合成领域应用越来越广泛。

1.2.3 接肽反应方法目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋、反应试剂危险以及制备比较复杂，因此适合于固相上的接肽反应的方法较少,如缩合剂法、混合酸酐法和原位法等。

1.2.3.1原位法(DCC法)直接加二环己基碳二亚胺(DCC)和保护氨基酸到树脂中进行反应的方法称为原位法（DCC法）。

该法操作简便,反应速度快,产率高。

但其主要缺点是,在反应中生成的副产物(DCU)在接肽溶剂(DCM)中的溶解度很小,要将其洗涤除去需花费大量的溶剂和时间,甚至虽经多次洗涤,仍会有少量吸附在树脂内部的空隙中而影响以后的反应。

而且,活化和缩合在一起进行,前述副产物若不能预先除去,就会有连接在肽上的危险［11］。

1.2.3.2 对称酸酐法对称酸酐法是一种非常好的接肽方法,操作简单,产物纯度很好,尤其适合小分子肽的合成［12］其优点还有:接肽反应后的产物中不存在用DCC法时所产生的、溶解度较小的DCU 副产物;活性很高,接肽反应的速度很快,大多数保护氨基酸酐的接肽反应时间只需15～30s即可达到99%,少数空间阻碍较大的保护氨基酸酐的接肽反应也只要3～8min即可达到99%,因此,如果用对称酸酐进行固相接肽反应,当反应物浓度为0.1mol L时,一般在10min内即已测不到游离的氨基;缩合的产率很高,每次接肽的产率可达99.6%～99.8%［12］。

对称酸酐可以被合成,并以结晶的形式存在,有利于保存。

只是由于制备一分子的对称酸酐需要两分子的保护氨基酸,因此对称酸酐法的一个主要缺点是保护氨基酸的用量大,比较浪费。

另一个需要注意的问题是保持树脂的溶胀性非常重要[13]。

1.2.3.3 缩合剂法在DCC缩合反应中,加入某些添加剂不仅可减少副反应,而且可提高产率。

常用的添加剂有N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu),1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和3-羟基-4-氧-3, 4-二氢-1, 2, 3-苯并三氮嗪(HOObt)[14]。

DCC-HOBt作用机制如图所示：图4 DCC-HOBt缩合反应原理1.2.4 脱去保护基和树脂合成肽的最终脱保护基和从树脂上裂解不仅决定合成的成败,而且也决定了侧链保护基的选择等固相合成多肽的计划的确立,因此是肽合成中极重要的环节。

Na/液氨法是较早使用的方法,但因为强碱性反应会引起某些副反应,已不太常用。

目前最常用的脱保护基系统是三氟乙酸(TFA),HF[15],有机磺酸(TFMSA,MSA)和含硅试剂(TMSBr、TM-SOT f)。

TFA(三氟乙酸)法可以脱除一些不耐酸的保护基,如Boc、t-Bu、金刚烷氧羰基(Adoc)、Trt等。

本法比较温和,副反应少,越来越多地应用于固相合成法中[15]。

TFA法脱除保护基及裂解树脂上肽链的操作比较简单,只要在样品中加入适量三氟乙酸振摇或搅拌至完全溶解,反应时间随具体情况而定[4]。