酵母双杂实验步骤
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交实验流程(精)
模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。
主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。
2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。
该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。
相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。
(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。
(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。
(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统也具有一定的局限性。
首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。
酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。
在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。
由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。
双杂交技术实验步骤
双杂交技术实验步骤
双杂交技术是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-核酸相互作用。
下面是双杂交技术的实验步骤：
1. 构建酵母双杂交系统：选择酵母菌株（如Saccharomyces cerevisiae），构建表达载体，将目标基因的编码区域与转录激活因子（如GAL4）的DNA结合，构建双杂交系统。
2. 交叉配对：将两个转录激活因子（如GAL4）的相应DNA结合区域与目标融合基因的编码区域分别克隆到不同的表达载体中，转化至酵母细胞中，利用交叉配对使两个融合蛋白质相互作用。
3. 筛选阳性克隆：利用选择性培养基，在表达载体中加入抗性标记基因，对转化后的酵母细胞进行筛选，筛选出阳性克隆，即能够生长在选择性培养基上的克隆。
4. 验证蛋白质相互作用：通过酵母双杂交系统筛选出的阳性克隆，可以采用进一步的验证实验，如酵母生长抑制实验、酵母
beta-galactosidase报告基因系统等，来确定蛋白质相互作用的可靠性。
5. 验证蛋白质相互作用位点：通过酵母双杂交技术，在确定蛋白质相互作用的基础上，还可以进一步确定相互作用的位点，如利用DNA序列分析、点突变等方法，对融合蛋白质的序列进行改变，观察改变对蛋白质相互作用的影响，从而确定蛋白质相互作用位点。
总之，双杂交技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以帮助
我们研究蛋白质相互作用、细胞信号转导等重要生物学问题。
酵母双杂交实验
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂操作方法
酵母双杂操作方法酵母双杂技术是一种常用的微生物遗传工程技术，可以用来研究酵母菌的基因功能、调控网络以及重组蛋白的表达等。
下面详细介绍酵母双杂技术的操作方法。
酵母双杂技术主要涉及两个步骤：构建双杂株系和进行双杂实验。
首先我们需要构建带有杂合基因的酵母菌株系。
具体操作如下：步骤一：选择载体首先需要选择一个适合的双杂（Y2H）载体。
常用的双杂载体包括pGBT9、pGBKT7和pGADT7等。
这些载体均含有选择标记，可以在适当的培养基上进行筛选。
步骤二：选择靶蛋白然后需要选择一种靶蛋白，通常是研究对象的潜在互作伴侣蛋白。
可以根据已有的研究结果或生物信息学预测找出可能与靶蛋白相互作用的蛋白。
步骤三：克隆靶蛋白和预测交互蛋白将选定的靶蛋白在酵母菌中进行克隆，并将其与可能的交互蛋白共同表达。
通常，可以通过PCR扩增靶蛋白编码序列，并将其克隆入双杂载体中。
同时，需要通过生物信息学预测和实验证实，确定可能的交互蛋白。
步骤四：转化酵母菌接下来，将构建好的双杂载体转化到酵母菌中。
转化可以通过经典的酵母转化方法、电穿孔法或Lithium Acetate法等实现。
步骤五：筛选融合蛋白表达转化完成后，可以根据选择标记分离出正常的酵母菌种子。
接下来，需要在适当的选择培养基上进行筛选，以获取融合蛋白表达的酵母菌株。
步骤六：确认融合蛋白表达通过Western blot、免疫荧光染色或其他特异性检测方法，确认融合蛋白是否成功表达。
这一步骤可以验证酵母菌中靶蛋白和交互蛋白的相互作用是否发生。
通过以上步骤，我们成功构建了带有杂合基因的酵母菌株系。
接下来，就可以进行双杂实验了。
步骤一：设计实验在进行双杂实验之前，需要根据研究问题制定详细的实验方案。
需要确定酵母菌是否能够在所选培养基上正常生长，并根据需要设计不同实验组和对照组。
步骤二：重组蛋白表达在实验开始之前，需要将预测的交互蛋白克隆到适合的双杂载体中。
然后，将两个杂合载体转化到酵母菌中，以实现融合蛋白的表达。
酵母双杂杂交回复验证实验
酵母双杂杂交回复验证实验一、引言酵母双杂杂交回复验证实验是一项常用于研究酵母菌遗传性状的实验方法。
通过将两个不同株系的酵母菌互相杂交，观察其后代的表型，可以确定不同基因型对于特定性状的影响，以及基因之间的相互作用关系。
这项实验提供了一种有效的手段来研究酵母菌的遗传特性，并为从酵母菌到其他生物的研究提供了重要参考。
二、实验设计1. 实验目的确认酵母菌的遗传性状以及基因型之间的相互作用关系。
2. 实验步骤1.选取两个不同基因型的酵母菌株进行杂交。
2.将两个酵母菌株分别培养在适宜的培养基上，以获得足够数量的酵母菌细胞。
3.将两个酵母菌株的细胞混合在一起，使其进行杂交。
4.将混合后的酵母菌细胞培养在选择性培养基上，以筛选出杂交后的酵母菌子代。
5.观察酵母菌子代的表型特征，并将其形态记录下来。
3. 实验材料•两个不同基因型的酵母菌株•培养基及培养仪器•选择性培养基4. 实验结果通过观察酵母菌子代的表型特征，可以得到各个基因型对于特定性状的影响情况。
如果两个酵母菌株的基因型在某一性状上有不同表现，那么杂交后的子代在该性状上可能表现出两种不同的表型。
这种表型的分离现象可以帮助确定酵母菌的遗传性状。
5. 实验分析通过对大量的酵母菌子代进行观察和统计，可以得到不同基因型对于特定性状的影响程度，以及基因之间的相互作用关系。
这些数据可以用来构建酵母菌的遗传模型，推测特定基因在遗传性状中的作用机制。
三、实验应用酵母双杂杂交回复验证实验在酵母研究领域具有广泛的应用价值。
以下是一些应用示例：1. 基因功能研究通过观察不同基因型的酵母菌子代的表型，可以推测特定基因在酵母菌生命周期、代谢途径等方面的作用。
这对于全面理解基因功能具有重要意义。
2. 病原机制研究酵母双杂杂交回复验证实验可以帮助研究人员解析酵母菌导致疾病的机制。
通过分析酵母菌的基因型与特定疾病的发生关系，可以发现关键基因及其表达调控途径，为疾病治疗和预防提供新思路。
酵母双杂实验步骤
2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的实验方法，用于研究基因之间的相互作用以及确定基因功能。
这种方法可以帮助科学家更好地理解生物学系统的复杂性，并为疾病的研究提供重要线索。
下面将介绍酵母双杂交的步骤及其意义。
进行酵母双杂交实验需要准备两个重要的构建：酵母表达载体和融合蛋白质的基因。
酵母表达载体通常包含启动子、选择标记基因和复制起点等元件，可以在酵母细胞中稳定表达外源基因。
而融合蛋白质的基因则是由研究人员设计合成，其中包含感兴趣的基因片段与激活结构域的融合。
将融合蛋白质的基因克隆到酵母表达载体中，构建成表达载体。
然后将这些表达载体分别转化到两株不同的酵母菌株中，形成两个亲本菌株。
接着，将这两个亲本菌株进行交配，使它们在同一酵母细胞内共存。
接下来，通过培养这个双杂交菌株，观察融合蛋白质是否发生相互作用。
如果两个融合蛋白质相互结合，可能会激活报告基因的表达，从而产生可检测的信号。
通过检测这些信号，可以初步判断这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
为了验证这种相互作用的真实性，通常需要进行一系列的对照实验和进一步的验证。
例如，可以利用突变体蛋白质来确认相互作用位点，也可以通过共沉淀实验证明这种相互作用在细胞内是否真实发生。
酵母双杂交实验是一种简单而有效的方法，可以帮助科学家快速筛选出潜在的蛋白质相互作用，并为后续的深入研究提供基础。
通过这种方法，研究人员可以更好地理解生物学系统的复杂性，揭示基因之间的相互关系，为疾病的研究和治疗提供新的思路。
总的来说，酵母双杂交是一种重要的实验方法，对于生物学研究具有重要意义。
通过这种方法，科学家们可以揭示基因之间的相互作用，探索生物学系统的奥秘，为人类健康和疾病治疗提供新的思路和方法。
希望未来能有更多的科研工作者投入到这一领域，共同推动生命科学的发展和进步。
酵母双杂交原理及步骤
酵母双杂交原理及步骤以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。
酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。
酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。
这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交实验的步骤如下：1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。
DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。
2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。
酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。
3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。
只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。
4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。
常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。
酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。
然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。
酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。
在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
TAKARA酵母双杂交实验步骤
酵母双杂交实验方法一）酵母感受态细胞的制备1. 于YPDA平板上划线培养酵母Y2H Gold菌株，30℃培养约3d；2. 挑取单菌落（2-3mm）接种于YPDA液体培养基中，30℃、250rpm摇培8-12h；3. 接种0.5μL至5mL YPDA液体培养基中（1:1W的接种比例），30℃、250rpm 摇培至OD600 = 0.15~0.3（16-20h）；4. 700g离心5min，弃上清后用10mL YPDA（2倍体积）重悬；5. 30℃、230rpm摇培至OD600 = 0.4~0.5（3-5h）；6. 将10mL菌液分装成2管5mL，700g离心5min，用3mL ddH2O重悬（0.6倍体积）；7. 700g离心5min，用150μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.05倍体积）；8. 转移至1.5mL离心管后，高速离心15s；9. 用60μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.02倍体积）。
二）酵母感受态转化方法1. 感受态细胞转化体系：感受态细胞50μLYeastmaker Carrier DNA（10ng/μL）5μL质粒DNA 100ng**共转化时，prey的质粒DNA量两倍于bait于50μL酵母感受态细胞中依次加入5μL Carrier DNA、100ng 质粒DNA，共转化时，猎物蛋白（未知蛋白）质粒DNA量为诱饵蛋白的2倍。
2. 混匀后加入500μL PEG/LiAc，30℃孵育30min，每10min轻微混匀；3. 加入20μL DMSO，42℃水浴15min，每5min轻微混匀；4. 10000rpm离心15s，用1mL YPD Plus重悬；5. 10000rpm离心15s，用1mL 0.9% NaCl重悬；6. 涂布于二缺培养基，30℃培养。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
下面将介绍酵母双杂交的步骤。
第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。
一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。
第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。
一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。
DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。
第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。
初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。
确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。
第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。
β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。
Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。
酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。
该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。
核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。
具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。
- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。
2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。
这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。
- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。
3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。
- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。
- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。
常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。
通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70 C 中，引物和质粒 DNA 储存在-20 C 中） 概念：1. 次序转化：指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是 DNA-BD/bait plasmid ）,在选择培 养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA 也就是节约质粒 DNA2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin （卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin （ 氨苄西林）酵母氮源（YNB ：; -leu DO suppleme nt 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖20g （ 即2%）5） SD/-trp （1000 ml ）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖20g （即2%）注意：YNB 有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是 含硫酸铵的。
（买 来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度 ％的 YNB 中再加入％的硫酸铵，即最终在1000 ml 溶液中加入总量为的YNB 与硫酸铵。
各种SD 培养基：1） SD/-ade （腺嘌呤）/-leu （亮氨酸）/-trp缺”）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.60g 葡萄糖20g（即2%）2） SD/-leu/-trp/-his （1000 ml ）酵母氮源（YNB ：;-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.62g ; 葡萄糖20g.（ 即2%） 3） SD/-leu/-trp （1000 ml ） （“二缺”）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.64g 葡萄糖20g（ 即2%）（色氨酸）/-his（组氨酸）（1000 ml ）（"四（购买来就配好的）； （购买来就配好的）（购买来就配好的）实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4 C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55 C以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
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2.1.1酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μLpDONR221 (150 ng/μL)1μLTE buffer, pH 8.0 补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P入门载体；(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
2.1.1.2诱饵载体构建重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：入门载体(50-150 ng)1-7μLpDEST32 (150 ng/μL)1μLTE buffer, pH 8.0 补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μL LR反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50μg/mL Gen抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度。
LR反应注意事项：对于LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。
2.1.1.3转化酵母细胞转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：(1)将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30℃培养2天；(2)挑取酵母菌单克隆至10mL YPAD液体培养基中，30℃，230rpm过夜培养；(3)将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左右，30℃，230rpm继续培养2-4h；(4)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入40mL 1×TE（pH7.5）重悬；(5)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1×LiAc/0.5×TE重悬；(6)室温静置孵育10min；(7)立即用于下游的酵母小量转化实验。
酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：(1)向每个1.5mL离心管中加入1μg质粒、100μg变性鲑鱼精DNA以及100μL酵母感受态细胞；(2)加入700μL的1×LiAc/40% PEG-3350/1×TE并上下颠倒混匀，30℃孵育30min；(3)加入88μL的DMSO，混匀，然后42℃热击7min；(4)在微量离心机中瞬时离心10s，弃去上清；(5)加入1mL1×TE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；(6)加入50-100μL1×TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30℃培养2天。
表3-2 酵母转化组合Table3-2 Sets of plasmids used in yeast transformation assayLEU2 Plasmid TRP1 Plasmid Purpose1 none none Negative transformation control2 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-wt Strong positive interaction control3 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-m1 Weak positive interaction control4 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-m2 Negative interaction control5 pDEST™32pDEST™22Negative self-activation control6 Bait plasmid pDEST™22Test of self-activation2.1.1.4自激活检测转化完成后，可以进行诱饵载体的自激活检测，同时确定文库筛选时的3AT 浓度，具体步骤如下：(1)从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST™22载体的单克隆，在一个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1到5的2个单克隆作为对照，30℃培养18h；(2)将SC-Leu-Trp作为样板影印至包含不同3AT浓度（0 mM, 10 mM, 25 mM,50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速进行影印清洁2-3次，30℃培养24h；(3)24h后，再次进行影印清洁2-3次，然后继续放于30℃培养约2天（40-44h）后，进行观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞生长的最低3AT浓度即为筛库时所用的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，则表明诱饵载体本身存在自激活作用，筛库不能进行，若低于100mM，则筛库可以进行。
2.1.1.5文库筛选进行文库筛选之前，需将重组诱饵载体按照3.2.4.3中的转化方法转入MaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。
然后进行文库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：(1)接种含有诱饵载体的酵母菌于20 mL SC-Leu培养基中，30℃过夜培养；(2)翌日早上，将培养液加入300 mL SC-Leu液体培养基中至浓度为2×106cells/mL (OD600=~0.10)，30℃继续培养直至培养液浓度达到2×107cells/mL (OD600 =~0.50)；(3)室温1000-1500×g离心5分钟收集菌体，30 mL无菌水重悬后转移至50 mL离心管中；(4)1000-1500×g 室温离心5分钟，弃上清，加入1.5 mL 1×TE/1×LiAc重悬；(5)立即将感受态细胞用于转化。
将文库转化入酵母感受态细胞的步骤如下：(1)加1 μg文库DNA和50 μg高质量鲑鱼精DNA至每个1.5 mL离心管中，共加30个管，每个管里加入50 μL重悬的酵母感受态细胞。
注意：文库DNA和鲑鱼精DNA的总体积不能超过20 μL，最好不超过10 μL；(2)加300 μL除菌的40% PEG-3350/1×LiAc/1×TE 至每个离心管中，翻转离心管充分混合，30℃孵育30min；(3)加DMSO到10% (~40 μL每管)，然后翻转混匀，42℃热击10min；(4)从一个转化管中取出100 μL转化液，用灭菌生理盐水按照1:100和1:1000进行稀释，每个稀释倍数涂100 μL至10-cm的SC-Leu-Trp板子上；(5)将30个管中的转化产物分别涂到30个15-cm含有合适的3AT的SC-Leu-Trp-His平板上，30℃培养3天；(6)计算10-cm SC-Leu-Trp板子上的克隆数，最好平板上长有20到300个克隆，通过下面的公式计算转化效率：每个转化反应的克隆数=单个平板上的克隆数×稀释倍数×转化总体积/单个平板上涂的菌液体积；(7)对每个SC-Leu-Trp-His+3AT平板进行影印清洁；(8)30℃继续培养2-3天后，初步筛选出阳性的His+克隆。
2.1.1.6报告基因检测将SC-Leu-Trp-His+3AT平板上长出来的His+克隆子以及3.2.4.3中的转化组合2-6重培养的新鲜菌落，用无菌水稀释到同一浓度（一个直径1mm菌落加入30μL 无菌水中，用血球计数板将所有稀释液调整至同一浓度）。
检测HIS3基因和URA3基因表达情况时，将每个菌落稀释液吸取3μL点至SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA（0.2%）平板上，30℃培养3-5天。
检测lac Z 基因表达情况时，吸取3μL每个菌落的稀释液点至YPAD（覆盖NC膜）平板上，30℃培养2天，准备进行X-gal实验。
X-gal实验的步骤如下：(1)称取10mg X-gal溶解在100μL DMF中，溶解后加入10mL的Z buffer中，同时加入60μL β-巯基乙醇，混匀备用；(2)将两张直径125-mm的Whatman541滤纸叠放在直径15-cm的培养皿中，用约8mL的上述X-gal溶液完全浸润，并将气泡移除；(3)用镊子将YPAD平板表面的带有菌落的NC膜轻轻取出，完全浸润在液氮中20-30s，然后将冻过的NC膜轻轻放在上述准备好的滤纸上面，移除气泡，然后轻轻将培养皿中多余的液体倒出；(4)盖上培养皿的盖子，放置于37℃孵育，孵育时将培养皿倾斜一个很小的角度，从而避免X-gal在滤纸上过多的累积影响实验结果；(5)24h内观察蓝色显现情况。