酵母双杂实验步骤

2.1.1酵母双杂交

2.1.1.1Gateway入门克隆

设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：

att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL

pDONR221 (150 ng/μL)1μL

TE buffer, pH 8.0 补足8μL

将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：

(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P

入门载体；

(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可

以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对

于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；

(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物

最好不要超过250ng。

2.1.1.2诱饵载体构建

重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：

入门载体(50-150 ng)1-7μL

pDEST32 (150 ng/μL)1μL

TE buffer, pH 8.0 补足8μL

将上述混合物加入离心管中，加入2μL LR反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50μg/mL Gen抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度。

LR反应注意事项：对于LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。

2.1.1.3转化酵母细胞

转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：

(1)将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30℃培养2天；

(2)挑取酵母菌单克隆至10mL YPAD液体培养基中，30℃，230rpm过夜培养；

(3)将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左

右，30℃，230rpm继续培养2-4h；

(4)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入40mL 1×TE（pH7.5）

重悬；

(5)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1×LiAc/0.5×TE重

悬；

(6)室温静置孵育10min；

(7)立即用于下游的酵母小量转化实验。

酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：

(1)向每个1.5mL离心管中加入1μg质粒、100μg变性鲑鱼精DNA以及100μL

酵母感受态细胞；

(2)加入700μL的1×LiAc/40% PEG-3350/1×TE并上下颠倒混匀，30℃孵育

30min；

(3)加入88μL的DMSO，混匀，然后42℃热击7min；

(4)在微量离心机中瞬时离心10s，弃去上清；

(5)加入1mL1×TE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；

(6)加入50-100μL1×TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30℃培养2

天。

表3-2 酵母转化组合

Table3-2 Sets of plasmids used in yeast transformation assay

LEU2 Plasmid TRP1 Plasmid Purpose

1 none none Negative transformation control

2 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-wt Strong positive interaction control

3 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-m1 Weak positive interaction control

4 pEXP™32/Krev1pEXP™22/RalGDS-m2 Negative interaction control

5 pDEST™32pDEST™22Negative self-activation control

6 Bait plasmid pDEST™22Test of self-activation

2.1.1.4自激活检测

转化完成后，可以进行诱饵载体的自激活检测，同时确定文库筛选时的3AT 浓度，具体步骤如下：

(1)从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST™22载体的单

克隆，在一个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1

到5的2个单克隆作为对照，30℃培养18h；

(2)将SC-Leu-Trp作为样板影印至包含不同3AT浓度（0 mM, 10 mM, 25 mM,

50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速进行影印清

洁2-3次，30℃培养24h；

(3)24h后，再次进行影印清洁2-3次，然后继续放于30℃培养约2天（40-44h）

后，进行观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞生

长的最低3AT浓度即为筛库时所用的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，

则表明诱饵载体本身存在自激活作用，筛库不能进行，若低于100mM，

则筛库可以进行。

2.1.1.5文库筛选

进行文库筛选之前，需将重组诱饵载体按照3.2.4.3中的转化方法转入MaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。然后进行文库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：

(1)接种含有诱饵载体的酵母菌于20 mL SC-Leu培养基中，30℃过夜培养；

(2)翌日早上，将培养液加入300 mL SC-Leu液体培养基中至浓度为2×106

cells/mL (OD600=~0.10)，30℃继续培养直至培养液浓度达到2×107

cells/mL (OD600 =~0.50)；

(3)室温1000-1500×g离心5分钟收集菌体，30 mL无菌水重悬后转移至50 mL

离心管中；

(4)1000-1500×g 室温离心5分钟，弃上清，加入1.5 mL 1×TE/1×LiAc重悬；

(5)立即将感受态细胞用于转化。