双缩脲总蛋白试剂
双缩脲总蛋白试剂
简介：
双缩脲是一种用于分析蛋白质的方法，双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，铜离子与肽键形成有色螯合的铜复合物，呈紫色。所产生的颜色密度与参与反应肽键数成比例。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长。双缩脲法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂影响，另外，对于血清总蛋白的双缩脲分析，胆红素、脂类、血红蛋白、葡聚糖具有一定干扰作用。Leagene 双缩脲总蛋白试剂由硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠等组成，在浓度范围内有较好的线性关系，是对蛋白质的精确定量分析试剂。
组成：
自备材料：
1、 酶标仪或分光光度计
2、 96孔板或离心管
操作步骤(仅供参考)：
1、 取蛋白标准配制液或稀释液加入到蛋白标准(BSA)中，充分溶解后配制成160mg/ml 的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。
例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖中。一般也可以用0.9%NaCl 或PBS 作为溶解BSA 稀释液。
2、 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl 加到96孔板的标准品孔，加稀释液补足。
3、 加适当体积待测蛋白样本到96孔板的样品孔中。如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液不同，应在待测蛋白样本孔中加入20μl 稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液相同，无需在待测蛋白样本孔中加入l 稀释液。
4、 各孔加入双缩脲总蛋白试剂。
5、 测定吸光值。
6、 根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
注意事项： 编号 名称 PT0003 PT0003 Storage 双缩脲总蛋白试剂 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份
1、待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待
测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
2、待测蛋白和蛋白标准加入双缩脲试剂后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置，颜
色会随着时间的延长不断加深。显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
3、测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因
是样品中含有铜离子螯合剂。
4、建议每次测定时都做标准曲线。因为颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应
的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
5、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的最小检
测体积。应按比例适当加大双缩脲试剂的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
6、检测中发现所有孔都呈暗紫色，可能原因是样品含有还原剂，应适当透析或稀释样品。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号名称
DC0032 Masson三色染色液
PE0081Tris-HCl缓冲液(1.5mol/L,pH8.8)
PE0092Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5×)
PE0103Acr-Bis(30%,29:1)
PS0009Western及IP细胞裂解液
PT0001BCA蛋白定量试剂盒
PT0013考马斯亮蓝快速染色液
TC1243 甘油三脂(TG)检测试剂盒(GPO-PAP单试剂比色法)
常用试剂的配制.
常用试剂的配制 1．无Ca2+、Mg2+Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO 3 0.175g Na 2HPO 4 ·12H 2 O 0.076g KH 2PO 4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中, 最后补加双蒸水至500ml, 以5.6%NaHCO 3调整 pH 值至7.4，4℃冰箱保存备用。 2．甲基红试剂 （1）成份 甲基红 0.1g 蒸馏水 200ml 95％乙醇 300ml （2）用途：测定甲基红反应。 3．Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO 4·7H 2 O 2g MgCl 2·6H 2 O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl 2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 原液乙： Na 2NPO 4 ·12H 2 O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 使用时甲,乙原液按下列比例配成Hanks 液使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，8磅20min灭菌，放4℃冰箱保存，使用前用NaHCO 3 调整PH值。 4．0.4%酚红溶液 称取0.4g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.lmol/LNaOH并不断研磨，直到所有的颗粒
几乎完全解，加入0.lmol/LNaOHl0ml，然后倒入容量瓶中，并加蒸馏水至l00ml,棕色瓶保存备用。 5．pH7.2 Tris-NH 4 CI溶液(红细胞崩解液） Tris (三羟甲基氨基甲烷) 1.03g NH 4 Cl（氯化氨) 3.735g 加双蒸水至500ml，用浓HCl调pH=7.2，10磅15min灭菌后放4℃保存。 6．0.05moI/L pH8.6 巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 加蒸馏水 200ml 加热溶解 巴比妥纳 10.3g 叠氮纳 0.2g 加蒸馏水溶解 , 并补加到 1000ml 。 7．磷酸盐缓冲液(PB) A 液：为 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液 ,NaH 2PO 4 ·H 2 O 27.6g, 溶于蒸馏水中, 最 后补加蒸馏水至 1000ml 。 B 液：为 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液 ,Na 2HPO 4 .7H 2 O 3.6g（或 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g, 或Na 2HPO 4 · 2H 2 O 35.6g ）, 加蒸馏水溶解，最后加水至 1000ml。若再加 蒸馏水至200ml则成为0.1mol/LPB。 8．0.1mol/LPH8.4 硼酸缓冲液（BBS） 硼酸钠（Na 2B 4 O 7 .10H 2 O） 0.46g 硼酸（H 2BO 3 ） 0.51g 加蒸馏水至100ml 溶解。9．PH7.4 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法一： 0.2mol/L Na 2HPO 4 （ Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g加蒸馏水至1000ml） 0.2mol/L NaH 2PO 4 （NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 35.6g加蒸馏水至1000ml） 取0.2mol/L Na 2HPO 4 81.0ml 加0.2mol/L NaH 2 PO 4 19ml,再加1900mlH 2 O和 17gNaCl即为PH7.4 0.01mol/L PBS。 PH7.4 0.01mol/L PBS再加入0.05%Tween-20即为ELISA试验的洗涤液。 配制方法二： 甲液（0.1mol/LKH 2PO 4 溶液）：KH 2 PO 4 13.608g，加蒸馏水至1000ml。 乙液（0.1mol/L Na 2HPO 4 溶液）：Na 2 HPO 4 35.814g，加蒸馏水至1000ml。 取甲液19ml，乙液81ml NaCl8.5g、Tween-20 0.5ml混合后加蒸馏水至1000ml即可。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量 实验二十蛋白质含量测定-—双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO－NＨ-CO—NH２）与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基（-CＯ—ＮH2），或与此相似的基团［如—CＨ2—ＮH２，—CＳ—ＮH2,—Ｃ（ＮH）NＨ2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(-ＣO—NＨ—）,可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为１～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Trｉｓ缓冲液和某些氨基酸等。...文档交流仅供参考... 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。...文档交流仅供参考... 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1．双缩脲试剂: 取CuSO４·5H20（c。P。)1.5g和酒石酸钾钠(c．P.）６．0g以少量蒸馏水溶解,再加２.5m ｏl/Ｌ NaOH溶液300ml,KI １。0ｇ，然后加水至10００mｌ.棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀
出现,即不能使用。...文档交流仅供参考... 2。标准蛋白质溶液: 用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA）或标准酪蛋白,配制成１0g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1ｇ/Ｌ的A280为０。66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H２O 或0.９%NaCl配制，酪蛋白用0。05mol/L NａOH配制. ...文档交流仅供参考... ［器材］ 1．试管:15×15０ｍｍ试管7只; 2．１ml，5ml移液管; 3.坐标纸； ４．７2１分光光度计。 四、实验操作 取试管７支,编号，按下表操作： 试剂(m ｌ）\管号空白 管 １２34５测定 管 蛋白 标准 液(1 ０g/ Ｌ) —0。10．２0．30.40.5–
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2) ，或与此相似的基团［如—CH2-NH2 ，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —),可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1?10mg蛋白质。干扰这一测定 的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1 ?双缩脲试剂：取CuSO4 ?5H20.)和酒石酸钾钠.)以少量蒸馏水溶解，再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1g/L 的A280 为来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或%NaCl配制，酪蛋白用L NaOH配 制。 ［器材］ 1. 试管：15X 150mm试管7只； 2. 1ml，5ml 移液管； 3. 坐标纸；
实验室常用生化试剂配方
实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30
注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；
蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
生物化学实验报告 姓名: 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目得 1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作; 1.２。掌握双缩脲试剂得配制; 1。3。熟悉血清总蛋白得临床意义; 1。4。了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。 二、实验原理 2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、
2。2。蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu ２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。 三、材料与方法: 3、１、实验材料: 3。１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。 3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒 ;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。 3。2、实验步骤 — 双缩脲试剂4。0 4。０4。0
测定次数 1 2 3 平均吸光度 m,以空白管调零,测S与U管吸得光度; d。测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。 依据公式算出结果: 四、结果与讨论: 4.1。实验现象: ①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、 ②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。(如图一) 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S0、18５0。１8４0。1８5 0。1847 U 0、１5２0.１51 0.15２ 0。1517 管号
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期 1、实验目的 1、1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1、2、掌握双缩脲试剂的配制； 1、3、熟悉血清总蛋白的临床意义； 1、4、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2、1、两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2、2、蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法：
3、1、实验材料： 3、1、1、实验试剂：①小牛血清；② 6、0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0、9%NaCl；⑥蒸馏水。 3、1、2、实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平； ⑧水浴锅。 3、2、实验步骤取3支试管，做好标记，按下表操作： 加入物（ml） B（空白） S（标准） U（待测）小牛血清（1:10） 0、5蛋白质标准液（1:10）0、9%Nacl 0、5双缩脲试剂 4、0 4、0 4、0a、各管混匀，观察各试管颜色；b、将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色；c、将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度；d、测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。 依据公式算出结果： 四、结果与讨论： 4、1、实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0、9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0、
双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书 微量法
双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC3185 规格:100T/96S 产品简介: 样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。 强碱性溶液中，双缩脲与CuSO 形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋 4 白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。 自备仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。 标准品：液体1mL×1支，5mg/mL，-20℃保存。 样品中可溶性蛋白质提取: 1.液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。 2.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释） 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入
1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 测定步骤: 1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。 2.空白管：取0.5mLEP管，加入40μL蒸馏水，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A1空白管。 3.标准管：取0.5mLEP管，加入40μL标准液，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A2标准管。 4.测定管：取0.5mLEP管，加入40μL待测液，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A3测定管。 样品中蛋白质浓度计算： 1、按液体体积计算： 蛋白质（mg/mL）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管) =5÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管) 2、按样本鲜重计算： 蛋白质（mg/g鲜重）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)×V样总÷W =5÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)÷W 3、按细胞数量计算： 蛋白质（mg/104cell）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)×V样总÷500 =0.01÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)
常用试剂配制及显色方法
https://www.360docs.net/doc/0e17677763.html, 常用试剂配制及显色方法 （一）通用显色剂 1．重铬酸钾——硫酸 一般有机物均能显色，不同化合物显示不同颜色。 喷洒剂：5克重铬酸钾溶于100ml，40%硫酸中。喷洒后加热至150o C斑点出现。2．碘：检查一般有机物 （1）碘蒸汽：在一个密闭玻璃皿先放入碘片，使缸内空气被碘蒸气饱和将薄层或纸层放入缸内数分钟即显色，有时在缸内放一盛水的小杯，增加缸内的湿度，可提高 显色的灵敏度。 （2）0.5%碘的氯仿溶液，取出挥发散过量的碘再喷1%淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。3．碘——碘化钾溶液：很我有机物虽黄色（配法见后）。 4．5%——磷钼酸乙醇溶液：喷后120o C烤，还原性物质显兰色，再用氨气熏，则背景变为无色。 5．20%磷酸乙醇溶液：喷后120o C，还原性物质显兰色。 6．碱性高锰酸钾试剂：还原性物质在淡红背景上显黄色。溶液I:1%高锰酸钾溶液。 溶液II：5%碳酸钠溶液。 溶液I和溶液II等量混合使用。 7．中性0.05%高锰酸钾溶液：易还原性物质在淡红背景上显黄色。 8．硝酸银——氢氧化铵（Tollen’s--zoffaronl）试剂，喷后105o C烤5~10分钟，还原性物质显黑色。 溶液I：0.1N硝酸银溶液。溶液II：氢氧化铵溶液。 临用前溶液I和溶液II以1：5混合。注意：放久则形成爆炸性的叠氦化银。 9．硝酸银——高锰酸钾试剂：还原性物质在兰绿色背景上立即显黄色。 溶液I：0.1N硝酸银溶液：2N氢氧化铵溶液：2N氢氧化钠（1：1：2）。临用前配制。 溶液II：高锰酸钾0.5g，碳酸钠1g，加水成100ml溶液,临用前溶液I和溶液II等量混合。 10．四唑试剂：还原性物质，在室温或微加热时显紫色。 溶液I：0.5%四唑兰甲醇溶液。溶液II：6N氢氧化钠溶液。临用前溶液I和溶液II等量混合。 11．铁氰化钾：三氯化铁试剂：还原性物质显兰色，再喷射2N/L盐酸溶液，则兰色加深。 溶液I：1%铁氰化钾溶液。溶液II：2%三氯化铁溶液。临用前溶液I和溶液II
(完整版)斐林试剂和双缩脲试剂区别
斐林试剂和双缩脲试剂区别 1、试剂的浓度和配制方法不同 斐林试剂：甲液： 0.1g/mL 的NaOH 溶液；乙液：0.05g/mL 的4CuSO 溶液。使用前临时配制，在2mL 的甲液中滴入4滴～5滴乙液，振荡使混合均匀后即可。 双缩脲试剂：A 液：0.1g/mL 的NaOH 溶液；B 液：0.01g/mL 的4CuSO 溶液。 分别配制好A 液和B 液即可。 2、试剂的作用和鉴定原理不同 斐林试剂： 作用：可鉴定可溶性还原糖。 原理：甲液和乙液混合后产生 2)OH (Cu 沉淀，2)OH (Cu 与含醛基（—CHO ）的可溶性还原糖，在加热条件下反应，将 2)OH (Cu 还原为砖红色的O Cu 2沉淀。双缩脲试剂： 作用：可鉴定蛋白质溶液。 原理：在碱性溶液（NaOH ）中，双缩脲（22CONH NH NCO H ）能与2Cu 反应，形成紫色络合物。由于蛋白质分子中含有许多与双缩脲结构相似的肽键（— CO —NH —）， 因此，蛋白质都可以与双缩脲试剂发生反应而使溶液呈现紫色。3、试剂的使用方法不同 斐林试剂：使用时现配现用，要水浴加热。如果斐林试剂放置一段时间， 因2)OH (Cu 沉淀在溶液底部而无法使用。使用时，甲液和乙液不可分别加入到待测液中，否则，待测液（苹果组织样液）中的有机酸会中和NaOH ，使产生的2)OH (Cu 不足而影响鉴定。 双缩脲试剂：使用时，双缩脲试剂A 液和双缩脲试剂 B 液要分别先后加入到待测液中，不需要加热。双缩脲试剂A 液和双缩脲试剂 B 液不可以混合后再加入待测液。如先混合，则会产生2)OH (Cu 沉淀而无2Cu 产生。加入的双缩脲试剂 B 液（4CuSO ）也不能过量，
分子实验常用试剂配制(精)
氨苄青霉素 ﹡组分浓度 100mg/ml 氨苄青霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 5g Ampicillin置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。卡那霉素 (可配 25mL ﹡组分浓度 50mg/ml卡那霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 2.5g 卡那霉素置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。RNase A ﹡组分浓度 10mg/ml RNase A ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.取 0.5g RNase A置于 50ml 塑料离心管中。
2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 100℃煮沸 15min, 缓慢冷却至室温,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。IPTG ﹡组分浓度 24mg/ml IPTG ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1.2g IPTG置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3.用0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 X-Gal ﹡组分浓度 20mg/ml X-Gal ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1g X-Gal置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40mlDMF (二甲基甲酰胺 ,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3.小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 DTT ﹡组分浓度 1M DTT ﹡配制量 10ml
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
实验一:双缩脲法测定蛋白质含量 一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。 二原理 双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。 在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。 将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。 由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。 三仪器与器材 可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）。 四试剂 1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。 2、0.05 ml/L的NaOH（需标定）。 3、标准酪蛋白溶液准确称取0.5 g酪蛋白（干酪素）溶于0.05 ml/L的NaOH溶液中，并定容于100ml，即为5mg/L的标准溶液。 4、未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。 五方法与步骤 1、标准曲线的绘制取12支试管分两组，分别加入0. 0ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、 0.8ml、1.0ml的标准蛋白质溶液，然后分别加入1.0ml、0.8ml、0.6 ml、0.4 ml、、0.2 ml、0 .0ml蒸馏水，使每支试管总液量为1.0ml，最后分别加入4 ml双缩脲试剂。 充分摇匀后，室温下（20—25℃）放置30min，于540nm处进行比色测定，用未加 蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液，并取两组测定的平均值。以蛋白质的含 量作为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线绘制操作表见下。（共 12支管，分两组，只列出一组。）
双缩脲法蛋白质含量测定试剂盒使用说明
双缩脲法蛋白质含量测定试剂盒使用说明 货号:PC0040 产品简介: 样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。 形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度强碱性溶液中，双缩脲与CuSO 4 成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。 自备仪器和用品: 可见分光光度计、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1瓶，5mg/mL，4℃保存。 样品中可溶性蛋白质提取: 1.液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。 2.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取 约0.1g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释） 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比 例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定步骤: 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。 2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A空白管。 3.标准管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL标准液，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A标准管。 4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待测液，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A测定管。 样品中蛋白质浓度计算： C待测（mg/mL）=C标准管×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) =5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 注意事项： 1.样品蛋白浓度须在1~10mg/ml范围内，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml 须做相应稀释。因此测定前用1~2个样做预实验，确保蛋白浓度在1~10mg/ml范围内。 2.待测样品蛋白提取可用生理盐水、双蒸水或不含蛋白的PBS提取。该法受硫酸 铵、Tris缓冲液干扰，提取液中应不含这些物质；否则改用BCA蛋白质含量测定试剂盒。
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 实验一:双缩脲法测定蛋白质含量 一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。 二原理 双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。 在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。 将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。 由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。 三仪器与器材 可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml） 容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）。 四试剂 1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。 2、0.05 ml/L的NaOH（需标定）。 3、标准酪蛋白溶液准确称取0.5 g酪蛋白（干酪素）溶于0.05 ml/L的NaOH 溶液中，并定容于100ml，即为5mg/L的标准溶液。 4、未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。
双缩脲法测定蛋白质含量
实验三双缩脲法测定蛋白质含量 目的 1．掌握双缩脲法测定蛋白质的具体操作和原理； 2．了解蛋白质测定在生命科学中的应用。 原理 双缩脲反应是指双缩脲在硷性溶液中能与Cu2+络合生成紫红色物质。双缩脲可由脲缩合而成。 蛋白质分子的肽链结构在硷性中也能与Cu2+络合生成紫红色络合物，因其反应机制相似，就把蛋白质的这一反应称为蛋白质的双缩脲反应。 由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分于肽链氨基酸残基的侧链功能基关系较小。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。这是本法的优点之一。此外试剂和操作的简单也是其优点。缺点是灵敏度较低，能测出的蛋白质浓度约须在0.5mg／ml。 本实验用双缩脲法测定血清的总蛋白质浓度。如结合盐析法(饱和硫酸钠)分离白蛋白和
球蛋白还可用于血清白蛋白和球蛋白浓度及其比值(A／G)的测定。 器材 1．试管及试智架 2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器) 3．1ml、2ml、5ml刻度吸管 4．721型分光光度计 试剂 1．0.9％NaCl 2．双缩脲试剂称取CuSO45H2O结晶(AR级试剂)1.5g,酒石酸钾钠(AR级试剂)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混匀后加水稀释至1000ml。本试剂可长期保存。 3．牛血清白蛋白标准液此溶液可用于替代标准血清。称取试剂级冻干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀释至刻度，避免振摇起泡，置4℃冰箱保存。此标准液浓度为300mg／m1。 4．被检血清样本 操怍 1. 取试管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被检血清0.200ml(吸管外壁须用滤纸片拭净)。慢慢放入试管底部。最后一点液体应吹出，靠落在试管壁上。 2．加入0.9%NaCl 3.80ml,充分混匀但不要振摇起泡。 3．另取试管二支，标上号码，其一用吸管加入操作2所准备的血清样本稀释液1.00ml 另一管加入牛血清白蛋白标准液1.00ml。二管各加入双缩脲试剂4.00m1，混匀，放置半小时后以1m1蒸馏水加4m1双缩脲试剂作空白调节比色计零点，选用蓝色滤光片或500nm波长光作比色。 4．计算 思考题 1.为什么稀释血清样本时应避免振摇起泡? 2.是否可用硫酸铵盐析分离白蛋白和球蛋白结合用双缩脲法分别测定这两个血清蛋白质的组份试讨论之。
常用试剂的配制总结
常用溶液的配制 信息来源：生物谷更新时间：2004-12-21 1:33:00 一、常规溶液 (一)1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS) 甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO49.465g 蒸馏水加至1000ml 乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 KH2P049.07g 蒸馏水加至1000m1 分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表: pH 甲液ml 乙液mI pH 甲液ml 乙液mI 5.29 5.59 5.91 6.24 6.47 6.64 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 97.5 95.0 90.0 80.0 70.0 60.0 6.81 6.98 7.17 7.38 7.73 8.04 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 5.0 (二)0.3％台盼兰染液 称取台盼兰(Trypan blue)粉0.3克，溶于100ml生理盐水中，加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。 (三)0.5％酚红指示剂 酚红0.5g 0.1N(0.4％)NaOH 15ml
双蒸水85ml 将0.5克酚红置研钵中，缓漫滴加0.1NNaOH溶液边加边磨，并不断吸出已溶解的酚红液，直至全部溶解，然后加入85ml双蒸水，颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用，室温保存。 (四)5.6％NaHCO3溶液 称NaHCO35.6克，溶于100ml蒸馏水中，室温保存即可(如需要也可10磅15分钟高压灭菌，4℃冰箱保存) (五)10μg／ml秋水仙素 秋水仙素lOmg 生理盐水100ml 装入茶色瓶中，为贮备液，4℃冰箱中保存。甩时取贮备液1ml加生理盐水9ml即可。 (六)0.4％KCl-0.4％柠檬酸钠低渗液 将0.4％KCl和0.4％柠檬酸钠两液等量混合即可，室温保存。 (七)2％柠檬酸钠 称取柠檬酸钠2克，加100ml双蒸水即可，室温保存。 （八）0.2％次甲基兰染液 称次甲基兰(Methylene blue)0.2克，加蒸馏水100ml，室温保存。 (九)0.5％醋酸洋红(Aceio Carmine)染液 洋红lg 醋酸90ml 蒸馏水 110ml
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量 09救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336 室温：20° （一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。2.学习掌握分光光度计的使用。 3.掌握标准曲线的制作。 4.学习分光光度法测定的原理和方法。 （二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。 （三）实验材料与仪器： 1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。 2.试剂：6mol/L 的NaOH 、双缩脲试剂、9g/L 的NaCl 溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。 （四）实验步骤和结论: 1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。 表 1 2.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。 表2 试剂 管号 空白管 标准管 测定管 1 2 3 4 5 蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.4