费氏丙酸杆菌谢氏亚种转化芝麻油生成共轭亚油酸的研究
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Key words: Propionibacterium shermanii; sesame oil; conjugated linoleic acid; linoleic acid
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是亚 油酸(Linoleic acid, LA)分子的十多种位置与几何异 构体的通称。研究表明，在这些异构体中，自然 界中天然存在的有两种，这两种异构体具有重要 的生理功能，如促进生长、减肥、增强机体免疫 力、延缓机体衰老、降血脂、抗动脉硬化和抗癌 等，在医药、食品、保健品、化妆品等领域有着
白蛋白乳化底物的条件下，共轭亚油酸的最高生成量可达 45.682 mg/mL。
关键词： 费氏丙酸杆菌谢氏亚种；芝麻油；共轭亚油酸；亚油酸
中图分类号： TS 201.3 文献标志码： A
文章编号： 1005-9989（2010）01-0034-04
Study on CLA production from sesame oil by Propionibacterium shermanii
Abstract: Free cells of Propionibacterium shermanii CGMCC1.2231 were chosen to produce conjugated
linoleic acid(CLA) from sesame oil in this study. In single-factor test, effects on CLA production by such factors as temperature of reaction, amount of linoleate acid, and emulsifier were studied. Through orthogonal test, optimal conditions were determined as follows: temperature 30 ℃, linoleate acid level 0.15%(v/v), and pH7.4. The maximal amount of CLA reached as high as 45.682 mg/mL.
本 文 利 用 费 氏 丙 酸 杆 菌 谢 氏 亚 种 CGMCC 1.2231 菌体细胞转化芝麻油生成 CLA，研究了诱 导物亚油酸添加量、转化反应温度、缓冲液系统， 以及乳化剂的影响。在此基础上，通过正交实验 优化了反应温度、缓冲液系统 pH 值等参数。
1 材料与方法
1.1 实验菌种 费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacterium sher-
ZHANG Zhong-zhou1, CAO Jian1，2, LUO Yu1, WU Xing-quan1,WAN Qian1
(1.College of Biological Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001; 2.Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 450007)
生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 1 期
费氏丙酸杆菌谢氏亚种转化 芝麻油生成共轭亚油酸的研究
张中洲 1， 曹 健 1,2， 罗 宇 1， 吴兴泉 1， 万 谦 1 (1.河南工业大学生物工程学院，郑州 450001；2.中原工学院，郑州 450007)
在 50 mL 三角瓶中分别加入 0.5 mL 细胞悬浮 液、0.5 mL 亚油酸，充分混匀后，在 30 ℃的摇床 上缓慢振摇反应 30 min；加入 1 mL 终止液(15%三 氯乙酸 - 5%三氯化铁混合物)和 5 mL 环己烷，在 摇床上振摇萃取 30 min(210 r/min)后，4 ℃、10000 r/min 冷 冻 离 心 20 min 。 取 上 清 液 (环 己 烷 层 )10 μL，加入含 10 mL 环己烷的比色皿中，用分光光 度 计 检 测 233 nm 处 的 吸 光 值 ， 对 照 标 准 曲 线 (y=10.022x)[6]求得 CLA 的浓度。 1.5.3 诱导物亚油酸添加量对菌体细胞酶活力的影 响 分别在亚油 酸添加量 (v/v)为 0.05%、0.1%、
2007 年，Estelle Devillard 等的最新研究发现， 一株从奶酪中分离得到的费氏丙酸杆菌谢氏亚种 (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermani DMS 20270)， 其 共 轭 亚 油 酸 异 构 酶 活 性 高 达 (14.3±1.1) nmol CLA/mg protein·min，亚油酸转化 率高达(96±9)%[3]。
将培养好的菌体以 3%的接种量接种于新鲜的 添加有一定量亚油酸的改良 PYG 液体培养基中， 置于二氧化碳培养箱中，设定 CO2 浓度 5%，30 ℃ 下培养 48 h，诱导产酶。 1.5.2 菌体细胞酶活力测定 将培养好的菌体培养 液于 4 ℃、4800 r/min 下冷冻离心 15 min，收集菌 体；用 30 mL 的缓冲液洗涤 2~3 次，4800 r/min 离 心 收 集 菌 体 。 称 取 一 定 量 (g)的 湿 菌 体 于 一 定 体 积 (mL)的 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液(pH5.0)中(m∶ v=1∶20)，于快速混匀器上振荡混合均匀，即得细 胞悬浮液。
·35·
生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 1 期
CLA 的生成量/(mg/mቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ)
0.15%、0.2%的条件下进行诱导产酶，以确定亚油 酸添加量对菌体细胞酶活力的影响。 1.5.4 转化反应温度对 CLA 生成量的影响 分别在 25、30、37、40、45、50 ℃条件下，利用已诱导 好的菌体细胞转化未经乳化的芝麻油。 1.5.5 缓冲体系 pH 值对 CLA 生成量的影响 分别 以 pH5.0(磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液)、pH5.6(磷 酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液)、pH6.2(磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液)、pH6.8(磷酸氢二钠 - 柠檬 酸 缓 冲 液)、pH7.4(Tris- HCl 缓冲液 )、pH8.0(Tris- HCl 缓冲液)等不同 pH 值的缓冲液系统制备细胞悬浮 液，与芝麻油进行反应，确定缓冲体系 pH 值对 CLA 生成量的影响。诱导产酶培养时亚油酸的添 加量为 0.15%(v/v)，反应底物为未经乳化的 芝麻 油，反应温度为 30 ℃。 1.5.6 底物的乳化分散 按 5∶1(w/w)的比例称取芝 麻油和乳化剂，加入 pH5.0 磷酸氢二钠 - 柠檬酸 缓冲液(缓冲液体积为总体积的 10%)，在冰水浴中 进行超声波乳化分散。超声波功率 600 W，工作 5 s，间歇 10 s，共 50 次。 1.5.7 乳化剂种类对转化反应的影响 诱导产酶培 养时亚油酸的添加量为 0.15%(v/v)，细胞悬浮液的 制备时缓冲液系统为 pH7.4(Tris- HCl 缓冲液)，反 应 温 度 为 30 ℃ 。 反 应 前 将 底 物 芝 麻 油 分 别 用 Tween- 20、Tween- 80、TritonX- 100、 1,3 丙 二 醇 、 牛血清蛋白(BSA)等乳化剂乳化，以未添加任何乳 化剂的样品做空白实验。
广阔的应用前景。 目前，工业上主要以亚油酸及其酯，或富含
亚油酸的植物油为底物，通过碱催化的异构化反 应合成 CLA。此外，还有羟基脂肪酸脱水法等。 这些化学合成法需要高温和一定的压力，可以实 现规模生产和大量制备，但其产物是十几种异构 体的混合物，要将其中的活性异构体分离出来，
收稿日期： 2009-03-02 基金项目： 河南省高校杰出科研人才创新工程项目(2006KYCX008)；河南省教育厅高等学校创新人才培养工程项目(豫教高[2005]126 号)。 作者简介： 张中洲(1981—)，男，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。
2002 年，Stanton Catherine 等人先在 MRS 培养 基中厌氧培养费氏丙酸杆菌 9093(Propionibacterium freudenreichii 9093)48 h，再将菌体转接到含有 0.5 mg/mL 亚油酸和 2%(v/v)Tween- 80 的 新鲜 MRS 培 养基中诱导 72 h，生成了 30 mg/mL 的 9c,11t- 18∶2 CLA[4]。2002 年，Auli Rainio 等在《Science》上发表 了对费氏丙酸杆菌谢氏亚种的研究，结果表明， 在添加 0.06~0.2 mg/mL 亚油酸进行诱导时，80% ~87%的亚油酸都会转化为 CLA[5]。
manii)CGMCC 1.2231：中国普通微生物菌种保藏管 理中心。 1.2 主要培养基
改良 PYG 培养基(1 L)：蛋白胨 7 g，酪蛋白胨 3 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 10 g，Tween- 80 1 g，L胱氨酸 0.5 g，碳酸氢钠 5 g，调 pH7.0~7.2，121 ℃ 灭菌 30 min。 1.3 主要试剂
亚油酸：武汉远程科技有限公司；蛋白胨： 英国 OXOID 公司；芝麻油：郑州市春芝调味品有 限公司；酵母膏：加拿大 BBI 公司；酪蛋白胨： 北京奥博星生物技术责任有限公司；葡萄糖：天 津市福晨化学试剂厂；Tween- 20：国药集团化学
试剂有限公司；TritonX- 100、Tween- 80：北京索 莱宝生物科技有限公司；1,3 丙二醇：瑞士 Fluka 公司；胱氨酸：上海正翔化学试剂研究所；牛血 清蛋白：上海生工生物工程有限公司；琼脂：广 州化学试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。 1.4 主要实验仪器
·34·
2010 年 第 35 卷 第 1 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
生物工程
不仅成本高，难度也很大，尤其是其中的 t,t 异构 体无益于健康，在合成中还应尽可能避免生成[1]。 因此，对化学法合成产物的安全性还存在质疑[2]。 一些微生物经诱导可产生共轭亚油酸异构酶，该 酶具有专一性地将亚油酸转化为天然活性 CLA 的 能力。因此，利用生物酶法制备共轭亚油酸已引 起人们广泛的关注。
摘要： 对费氏丙酸杆菌谢氏亚种 CGMCC 1.2231 菌体细胞转化芝麻油生成共轭亚油酸进行了研
究。首先通过单因素实验，研究了诱导产酶阶段亚油酸的添加量，以及转化反应温度、缓冲体
系 pH 值、乳化剂种类对共轭亚油酸生成量的影响，进而通过正交实验得到最佳转化条件。在诱
导产酶培养阶段加入 0.15%(v/v)的亚油酸，转化温度 30 ℃，反应体系 pH 值为 7.4，使用牛血清
二 氧 化 碳 培 养 箱 ： 德 国 Heraeus 公 司 ； UV- 2450 紫外 - 可见光分光光度计、AY120 型电 子天平：日本岛津公司；Eppendorf 台式高速冷冻 离心机、Eppendorf Centrifuge 5804 台式高速离心 机、微量移液器：德国 Eppendorf 公司；61814- 1 型超纯水系统：德国 SG 公司；HVE- 50 型全自动 灭菌锅：日本 HIRAYAMA 公司；SW- CT- 2F 型超 净工作台：苏州净化设备有限公司；JY92- II 超声 波破碎仪：宁波新芝科器研究所；雷磁 PHS- 3C 型 pH 计：上海精密科学仪器有限公司；恒温摇 床：江苏省金坛市医疗仪器厂。 1.5 实验方法 1.5.1 诱导产酶方法[4] 将菌种接种于 5 mL 改良 PYG 液体培养基中，接种量为 1%(v/v)，置于二氧 化碳培养箱中，设定 CO2 浓度 5%，30 ℃下培养 48 h。
2 结果与分析
2.1 诱导产酶培养时亚油酸添加量对菌体细胞酶 活力的影响
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是亚 油酸(Linoleic acid, LA)分子的十多种位置与几何异 构体的通称。研究表明，在这些异构体中，自然 界中天然存在的有两种，这两种异构体具有重要 的生理功能，如促进生长、减肥、增强机体免疫 力、延缓机体衰老、降血脂、抗动脉硬化和抗癌 等，在医药、食品、保健品、化妆品等领域有着
白蛋白乳化底物的条件下，共轭亚油酸的最高生成量可达 45.682 mg/mL。
关键词： 费氏丙酸杆菌谢氏亚种；芝麻油；共轭亚油酸；亚油酸
中图分类号： TS 201.3 文献标志码： A
文章编号： 1005-9989（2010）01-0034-04
Study on CLA production from sesame oil by Propionibacterium shermanii
Abstract: Free cells of Propionibacterium shermanii CGMCC1.2231 were chosen to produce conjugated
linoleic acid(CLA) from sesame oil in this study. In single-factor test, effects on CLA production by such factors as temperature of reaction, amount of linoleate acid, and emulsifier were studied. Through orthogonal test, optimal conditions were determined as follows: temperature 30 ℃, linoleate acid level 0.15%(v/v), and pH7.4. The maximal amount of CLA reached as high as 45.682 mg/mL.
本 文 利 用 费 氏 丙 酸 杆 菌 谢 氏 亚 种 CGMCC 1.2231 菌体细胞转化芝麻油生成 CLA，研究了诱 导物亚油酸添加量、转化反应温度、缓冲液系统， 以及乳化剂的影响。在此基础上，通过正交实验 优化了反应温度、缓冲液系统 pH 值等参数。
1 材料与方法
1.1 实验菌种 费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacterium sher-
ZHANG Zhong-zhou1, CAO Jian1，2, LUO Yu1, WU Xing-quan1,WAN Qian1
(1.College of Biological Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001; 2.Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 450007)
生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 1 期
费氏丙酸杆菌谢氏亚种转化 芝麻油生成共轭亚油酸的研究
张中洲 1， 曹 健 1,2， 罗 宇 1， 吴兴泉 1， 万 谦 1 (1.河南工业大学生物工程学院，郑州 450001；2.中原工学院，郑州 450007)
在 50 mL 三角瓶中分别加入 0.5 mL 细胞悬浮 液、0.5 mL 亚油酸，充分混匀后，在 30 ℃的摇床 上缓慢振摇反应 30 min；加入 1 mL 终止液(15%三 氯乙酸 - 5%三氯化铁混合物)和 5 mL 环己烷，在 摇床上振摇萃取 30 min(210 r/min)后，4 ℃、10000 r/min 冷 冻 离 心 20 min 。 取 上 清 液 (环 己 烷 层 )10 μL，加入含 10 mL 环己烷的比色皿中，用分光光 度 计 检 测 233 nm 处 的 吸 光 值 ， 对 照 标 准 曲 线 (y=10.022x)[6]求得 CLA 的浓度。 1.5.3 诱导物亚油酸添加量对菌体细胞酶活力的影 响 分别在亚油 酸添加量 (v/v)为 0.05%、0.1%、
2007 年，Estelle Devillard 等的最新研究发现， 一株从奶酪中分离得到的费氏丙酸杆菌谢氏亚种 (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermani DMS 20270)， 其 共 轭 亚 油 酸 异 构 酶 活 性 高 达 (14.3±1.1) nmol CLA/mg protein·min，亚油酸转化 率高达(96±9)%[3]。
将培养好的菌体以 3%的接种量接种于新鲜的 添加有一定量亚油酸的改良 PYG 液体培养基中， 置于二氧化碳培养箱中，设定 CO2 浓度 5%，30 ℃ 下培养 48 h，诱导产酶。 1.5.2 菌体细胞酶活力测定 将培养好的菌体培养 液于 4 ℃、4800 r/min 下冷冻离心 15 min，收集菌 体；用 30 mL 的缓冲液洗涤 2~3 次，4800 r/min 离 心 收 集 菌 体 。 称 取 一 定 量 (g)的 湿 菌 体 于 一 定 体 积 (mL)的 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液(pH5.0)中(m∶ v=1∶20)，于快速混匀器上振荡混合均匀，即得细 胞悬浮液。
·35·
生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 1 期
CLA 的生成量/(mg/mቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ)
0.15%、0.2%的条件下进行诱导产酶，以确定亚油 酸添加量对菌体细胞酶活力的影响。 1.5.4 转化反应温度对 CLA 生成量的影响 分别在 25、30、37、40、45、50 ℃条件下，利用已诱导 好的菌体细胞转化未经乳化的芝麻油。 1.5.5 缓冲体系 pH 值对 CLA 生成量的影响 分别 以 pH5.0(磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液)、pH5.6(磷 酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液)、pH6.2(磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液)、pH6.8(磷酸氢二钠 - 柠檬 酸 缓 冲 液)、pH7.4(Tris- HCl 缓冲液 )、pH8.0(Tris- HCl 缓冲液)等不同 pH 值的缓冲液系统制备细胞悬浮 液，与芝麻油进行反应，确定缓冲体系 pH 值对 CLA 生成量的影响。诱导产酶培养时亚油酸的添 加量为 0.15%(v/v)，反应底物为未经乳化的 芝麻 油，反应温度为 30 ℃。 1.5.6 底物的乳化分散 按 5∶1(w/w)的比例称取芝 麻油和乳化剂，加入 pH5.0 磷酸氢二钠 - 柠檬酸 缓冲液(缓冲液体积为总体积的 10%)，在冰水浴中 进行超声波乳化分散。超声波功率 600 W，工作 5 s，间歇 10 s，共 50 次。 1.5.7 乳化剂种类对转化反应的影响 诱导产酶培 养时亚油酸的添加量为 0.15%(v/v)，细胞悬浮液的 制备时缓冲液系统为 pH7.4(Tris- HCl 缓冲液)，反 应 温 度 为 30 ℃ 。 反 应 前 将 底 物 芝 麻 油 分 别 用 Tween- 20、Tween- 80、TritonX- 100、 1,3 丙 二 醇 、 牛血清蛋白(BSA)等乳化剂乳化，以未添加任何乳 化剂的样品做空白实验。
广阔的应用前景。 目前，工业上主要以亚油酸及其酯，或富含
亚油酸的植物油为底物，通过碱催化的异构化反 应合成 CLA。此外，还有羟基脂肪酸脱水法等。 这些化学合成法需要高温和一定的压力，可以实 现规模生产和大量制备，但其产物是十几种异构 体的混合物，要将其中的活性异构体分离出来，
收稿日期： 2009-03-02 基金项目： 河南省高校杰出科研人才创新工程项目(2006KYCX008)；河南省教育厅高等学校创新人才培养工程项目(豫教高[2005]126 号)。 作者简介： 张中洲(1981—)，男，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。
2002 年，Stanton Catherine 等人先在 MRS 培养 基中厌氧培养费氏丙酸杆菌 9093(Propionibacterium freudenreichii 9093)48 h，再将菌体转接到含有 0.5 mg/mL 亚油酸和 2%(v/v)Tween- 80 的 新鲜 MRS 培 养基中诱导 72 h，生成了 30 mg/mL 的 9c,11t- 18∶2 CLA[4]。2002 年，Auli Rainio 等在《Science》上发表 了对费氏丙酸杆菌谢氏亚种的研究，结果表明， 在添加 0.06~0.2 mg/mL 亚油酸进行诱导时，80% ~87%的亚油酸都会转化为 CLA[5]。
manii)CGMCC 1.2231：中国普通微生物菌种保藏管 理中心。 1.2 主要培养基
改良 PYG 培养基(1 L)：蛋白胨 7 g，酪蛋白胨 3 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 10 g，Tween- 80 1 g，L胱氨酸 0.5 g，碳酸氢钠 5 g，调 pH7.0~7.2，121 ℃ 灭菌 30 min。 1.3 主要试剂
亚油酸：武汉远程科技有限公司；蛋白胨： 英国 OXOID 公司；芝麻油：郑州市春芝调味品有 限公司；酵母膏：加拿大 BBI 公司；酪蛋白胨： 北京奥博星生物技术责任有限公司；葡萄糖：天 津市福晨化学试剂厂；Tween- 20：国药集团化学
试剂有限公司；TritonX- 100、Tween- 80：北京索 莱宝生物科技有限公司；1,3 丙二醇：瑞士 Fluka 公司；胱氨酸：上海正翔化学试剂研究所；牛血 清蛋白：上海生工生物工程有限公司；琼脂：广 州化学试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。 1.4 主要实验仪器
·34·
2010 年 第 35 卷 第 1 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
生物工程
不仅成本高，难度也很大，尤其是其中的 t,t 异构 体无益于健康，在合成中还应尽可能避免生成[1]。 因此，对化学法合成产物的安全性还存在质疑[2]。 一些微生物经诱导可产生共轭亚油酸异构酶，该 酶具有专一性地将亚油酸转化为天然活性 CLA 的 能力。因此，利用生物酶法制备共轭亚油酸已引 起人们广泛的关注。
摘要： 对费氏丙酸杆菌谢氏亚种 CGMCC 1.2231 菌体细胞转化芝麻油生成共轭亚油酸进行了研
究。首先通过单因素实验，研究了诱导产酶阶段亚油酸的添加量，以及转化反应温度、缓冲体
系 pH 值、乳化剂种类对共轭亚油酸生成量的影响，进而通过正交实验得到最佳转化条件。在诱
导产酶培养阶段加入 0.15%(v/v)的亚油酸，转化温度 30 ℃，反应体系 pH 值为 7.4，使用牛血清
二 氧 化 碳 培 养 箱 ： 德 国 Heraeus 公 司 ； UV- 2450 紫外 - 可见光分光光度计、AY120 型电 子天平：日本岛津公司；Eppendorf 台式高速冷冻 离心机、Eppendorf Centrifuge 5804 台式高速离心 机、微量移液器：德国 Eppendorf 公司；61814- 1 型超纯水系统：德国 SG 公司；HVE- 50 型全自动 灭菌锅：日本 HIRAYAMA 公司；SW- CT- 2F 型超 净工作台：苏州净化设备有限公司；JY92- II 超声 波破碎仪：宁波新芝科器研究所；雷磁 PHS- 3C 型 pH 计：上海精密科学仪器有限公司；恒温摇 床：江苏省金坛市医疗仪器厂。 1.5 实验方法 1.5.1 诱导产酶方法[4] 将菌种接种于 5 mL 改良 PYG 液体培养基中，接种量为 1%(v/v)，置于二氧 化碳培养箱中，设定 CO2 浓度 5%，30 ℃下培养 48 h。
2 结果与分析
2.1 诱导产酶培养时亚油酸添加量对菌体细胞酶 活力的影响