邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
单项技能实训指导书-自由基清除剂SOD活性的测定(精)
样品管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl
2.98
2.98
10mmol/L HCl
0.02
-
SOD样液
-
0.01
50 mmol/L邻苯三酚
-
0.01
4、结果处理
《保健食品》单项技能实训指导书
实训项目名称
自由基清除剂SOD活性的测定
学时
4学时
实训目的
1.掌握SOD活性测定的方法
2.熟练操作紫外分光光度计
一、配制试剂
1.pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
2.10mmol/L HCl
3.50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
4.SOD样液
二、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
试剂
空白管（mL）
自氧化管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl
2.98
2.98
10mmol/L HCl
0.02
0.01
50 mmol/L邻苯三酚
SOD活性测定
SOD活性测定SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
[精读]大蒜中sod活性的测定
![[精读]大蒜中sod活性的测定](https://img.taocdn.com/s3/m/61c457e0bb0d4a7302768e9951e79b8968026813.png)
大蒜中SOD活性的测定一、实验目的：（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
（3）掌握离心机的使用。
二、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
三、实验试剂：大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根四、实验步骤：（1）SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）（3）SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1mL备用，其余量取体积。
（4）粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的电化学研究
和一 ．４ （Ｃ １４ Ｖ Ｓ Ｅ）有 两 个 还 原 波 ，本 文建 立 邻 苯 三
酚 自氧化法测定 Ｓ Ｄ活性 的 电化 学方 法 ，并 研究 黄 Ｏ
０９ Ｖ 一１４ Ｖ处 极 谱 峰 高 随 时 间 的 变 化 ，即 ．６ 和 ．４
酮类化合物对邻苯三酚 自氧化产生的 Ｏ 的清除作
用 。此 方法 所 用 仪 器 便 宜 ，操 作 简 便 ，试 剂 易 得 ， 对 于抗 氧化剂 的筛选 具有一定 的应 用价值 。
和一．４ １４ Ｖ处 极谱 峰 高 随 时 间 的变 化 ，即每 隔 １ ｉ ｍｎ
读取 峰 电流一 次 。
１２ ２ Ｓ Ｄ活 性 测定 ． ． Ｏ
采 用 １２ １的方 法 ，在 加 ．．
人邻 苯三 酚 之 前 ，先 加 人 一 定 量 的 Ｓ Ｄ，使 总 体 Ｏ
积 为 １ ｍＬ ０ ，迅 速 混 匀 后 ，倒 人 电 解 池 中 ，记 录
１ ２ １ 邻苯 三 酚 的 自氧化 ．．
取 ５ ０ １０ ｏ Ｌ ．ｍＬ０ ｍｍ ｌ ／
Ｔｉ Ｈ Ｉ 冲溶 液 ，０４ ．５ ｏ Ｌ的 Ｅ Ｔ ｒ— Ｃ 缓 ｓ ． Ｌ０ ０ ｍ ｌ ／ Ｄ Ａ，加 人一 定 量 的二 次 蒸 馏 水 ，在 ２ ℃ 恒 温 槽 中 恒 温 ５ ２ ｍｉ，加 人 一 定 体 积 的 邻 苯 三 酚 ，使 总 体 积 为 ５ ｎ
一
黄酮类 化合 物均 购 自北 京 生化 试剂 公 司 ；黄酮类 化
合物 在 测 定 前 用 ０ １ ｌＬ Ｎ Ｈ Ｏ ． ｍｏ ａ Ｃ 溶 解 ，其 他 试 ／ 剂 均为 分析纯 ，试 验用 水 为二次 亚沸 石英 蒸馏 水 。
１ ２ 实验 方法 ．
１ ４ Ｖ处 的 峰与溶 液 中 的溶 解 氧有关 。 ．４
SOD酶测定的方案
二）连苯三酚自氧化法测SOD连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出，生成带色的中间产物。
在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。
中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成O2与H2O2，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。
紫外分光光度计、pH计。
【一】连苯三酚，K2HPO4•3H2O，KH2PO4，HCl均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）连苯三酚液：用1×10-2mol/L HCl将之配成浓度5×10-2mol/L连苯三酚液。
（3）pH8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）连苯三酚自氧化速率的测定：取4.5Ml ph8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液，在25℃水浴中保温15min，加入10μL5×10-2mol/L连苯三酚液，迅速摇匀（空白以K2HPO4- KH2PO4缓冲液代替），倒入光径1cm的比色杯内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次。
计算线形范围内每1min A的增值，此即为连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。
（3）酶活测定：测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，在加入连苯三酚之前，先加入待测SOD酶液，缓冲液减少相应体积。
计算加酶后测连苯三酚自氧化速率，按以下公式计算酶活。
5. 结果计算样品酶活单位表示在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
SOD酶的纯度分析及活力测定-修
3.试剂：(1)pH 8.2 50mM Tris-HCl缓冲液；(2)50mM 邻苯三酚；(3)10mM HCl。
4.试剂的配置 (1)pH8.2 50 mM Tris-HCl缓冲液 Tris 0.61g EDTA 0.037g 加双蒸水约80ml，充分溶解后，用HCl调pH至8.2，定容至100ml。
取两支试管按右表加入取两支试管按右表加入2525预热预热过过的缓冲液的缓冲液然后加入预热过的邻苯然后加入预热过的邻苯三酚空白管用空白管用1010mmollmmollhclhcl代替代替迅速摇匀迅速摇匀立即倾入立即倾入11cmcm比色杯中比色杯中在在325325nmnm波长处测波长处测定光吸收值定光吸收值每隔每隔3030ss读数一次读数一次测定测定44minmin内每分钟光吸收值的变内每分钟光吸收值的变化化
(2)50mM 邻苯三酚 邻苯三酚 0.063g 用10mM HCl溶解，定容至10ml，现配先用，避光保存。 (3)10mM HCl
三、SOD酶活力测定
在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性 测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法 和等电点聚焦法 ，其中化学法应用最普遍。化学法的 原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有 色中间物和O2 ，利用SOD分解而间接推算酶活力。 在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻 苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法， 光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚 自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自 氧化方法。
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注意事项：
1.加入邻苯三酚后，后续操作要迅速，最好能在30s~ 45s之内完成。 2.邻苯三酚有毒，实验过程中要做好安全防护。
清
场
1.各组将实验台清理好，实验用具 清洗干净，恢复实验开始时的状 态。 2.派人清扫实验室。
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
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连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
文献来源
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH
计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。
因此，实验过程中，要严格控制温度。
缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。
用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。