海参岩藻聚糖硫酸酯的超滤纯化工艺研究

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海带岩藻聚糖硫酸酯酶解工艺及分离和纯化研究

正交试验结果表明：纤维素酶、果胶酶优化的酶解工艺参数为：纤维素酶０２１、果胶酶０７％，温度５ ℃ ，Ｈ值４，时间．％２．４０Ｏｐ．５５ｍｎ经ＤＡ一２纤维素离子交换柱层析分离得到３个岩藻聚糖硫酸酯组分，个组分经Ｓｐａｅ－００ｉＥＥ５３ｅｈｄｘＧ２０凝胶柱层析进一步纯化得５个分子量很大（于２ａ的组分，可能为岩藻聚糖硫酸酯的凝聚体，另５个组分的分子量为５．Ｋａ１５Ｄ、大ＭＤ）７８Ｄ、１Ｋａ
ＡｂｔａｔＦｃｉａｓｏｙａｃａｉｅｏｔｉｉｇｓｂｔｎｉｌｐｒｅｔｇｓｏ－ｕｏｅａｄｓｌｔｓｅｒｕｓｈｖｏｅｔｂｏｏｉｓｒｃ：ｕｏｄｎ，ｐｌｓｃｈｒｄｓｃｎａｎｎｕｓａｔｅｃｎａｅｆＬｆｃｓｎｕｆｅｅｔｒｇｏｐａｅｐｔｎｉｌｇ－ａａ
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沈阳农业大学学报，０７０，８）１— １２０ —４３（：５２９２２
ＪｕｎｌｏｈｎａｇＡｒｕｔｒｌＵｉｅｓｙ０７０，８２：１— １ｏｒａｆＳｅｙｎｇｉｌａｎｖｒｉ，０－４３（）２５２９ｃｕｔ２
ｉｄｈｅｏｔｍａｔｒｒｅｅｍｉｅｏｅｌｌｓｎｅｔｓｈｏｇｈｒｏｏａｅｔｈｅｃｌｌｓ．２％，ｔｅｐｃａｅｅ．Ｔｐｍｕｆｃｏｓｗｅｅｄｔｒｎｄｆｒｃｌａｅａｄｐｃａｅｔｒｕｈｔｅｏｔｇｎｔｓ：ｔｅｌａｅＯ２１ｉｕｈｌｕｈｅｔｓ００４，ｔｍｐｒｔｒ．７％ｅｅａｕｅ５，ｐ４５ｎｔ５ｍｉｕｅ．ＴｒｅｆａｔｎｒｓｌｔｄｔｒｕｈａｉｎｅｃａｇｈｏｔｇａｈＨ．ａｄｉｍｅ０ｎｔｓｈｅｒｃｉｓｗｅｅｉｏａｅｈｏｇｎｏ．ｘｈｎｅｃｒｍａｏｒｐｙｏ

海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化

２０２０年１１月第３５卷第６期　ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＧＨＴＩＮＤＵＳＴＲＹ　Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．６Ｎｏｖ．２０２０收稿日期：２０２０－０６－０４基金项目：国家自然科学基金项目（３１３７１８３９）；山东省重点研发计划项目（２０１８ＹＹＳＰ００１）作者简介：李艳（１９９７—），女，山东省济宁市人，齐鲁工业大学硕士研究生，主要研究方向为食品生物技术．通信作者：李迎秋（１９７２—），女，山东省菏泽市人，齐鲁工业大学教授，博士，主要研究方向为食品生物技术．引用格式：李艳，宁厚齐，李迎秋．海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化［Ｊ］．轻工学报，２０２０，３５（６）：９－１５．中图分类号：ＴＳ２０９文献标识码：ＡＤＯＩ：１０．１２１８７／２０２０．０６．００２文章编号：２０９６－１５５３（２０２０）０６－０００９－０７海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅｆｒｏｍｓｅａｗｅｅｄｒｅｓｉｄｕｅ关键词：岩藻聚糖硫酸酯；海藻渣；酸提法；Ｄｉｓｃｈｅ比色法Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ；ｓｅａｗｅｅｄｒｅｓｉｄｕｅ；ａｃｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｄｉｓｃｈｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ李艳，宁厚齐，李迎秋ＬＩＹａｎ，ＮＩＮＧＨｏｕｑｉ，ＬＩＹｉｎｇｑｉｕ齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东济南２５０３５３ＳｃｈｏｏｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ），Ｊｉ′ｎａｎ２５０３５３，Ｃｈｉｎａ摘要：以海藻渣为原料，采用酸提法提取岩藻聚糖硫酸酯，通过单因素试验和正交试验优化提取工艺条件，并结合Ｄｉｓｃｈｅ比色法筛选最优的乙醇沉淀体积分数，以实现岩藻聚糖硫酸酯粗品的纯化．结果表明：采用酸提法提取海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯的最佳工艺条件为ＨＣｌ浓度０．２５ｍｏｌ／Ｌ，提取温度５０℃，提取时间２ｈ，料液比１１０，在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率为１．８９％；结合Ｄｉｓｃｈｅ比色法筛选出最优的乙醇沉淀体积分数为７０％，此时岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度达到最大值，为３．１２μｇ／ｍＬ．·９·　２０２０年１１月第３５卷第６期Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇｓｅａｗｅｅｄｒｅｓｉｄｕｅａｓｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙａｃｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅＤｉｓｃｈｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅｆｒｏｍｓｅａｗｅｅｄｒｅｓｉｄｕｅｂｙａｃｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｅｒｅＨＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０．２５ｍｏｌ／Ｌ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５０℃，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ２ｈ，ａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ１１０．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅｗａｓ１．８９％．ＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅＤｉｓｃｈｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｗａｓ７０％．Ａｔｔｈｉｓｔｉｍｅ，ｔｈｅｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍ，ｗｈｉｃｈｗａｓ３．１２μｇ／ｍＬ．０　引言海藻是指生长在潮间带及亚潮间带肉眼可见的大型藻类，主要包括褐藻（海带、裙带菜、鹿角菜等）、绿藻（扁藻、小球藻、孔石莼等）和红藻（紫菜、石花菜、海萝等）三大类．海藻富含褐藻胶、碘、甘露醇、氯化钾、褐藻淀粉等，可作为食品或医药工业原料，具有极高的经济利用价值．在褐藻胶、碘、甘露醇等的生产过程中，海藻经过浸泡、漂洗、粉碎、干燥等工序处理后，会留下大量的海藻残渣．由于缺乏科学利用的意识，这些海藻残渣或被用作饲料，或被用作肥料，甚而被作为工业废弃物丢弃，既造成了资源的浪费，也加重了沿海环境的污染［１］．岩藻聚糖硫酸酯，又名褐藻多糖硫酸酯或褐藻糖胶，通常提取分离自海带等褐藻，是一种分子量约为１０～１００ｋＤａ的水溶性杂聚多糖，主要由含硫酸基的Ｌ－岩藻糖（Ｆｕｃｏｓｅ）组成，也含有少量的半乳糖、甘露糖、糖醛酸等，其主要有效成分为α－Ｌ－岩藻糖－４－硫酸酯．岩藻聚糖硫酸酯是一种优质的健康食品和药品原料，因含有天然硫酸根，故具有阴离子高分子化合物的特性．研究表明，岩藻聚糖硫酸酯具有多种生理活性，如降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、促进组织再生、增强机体免疫机能等［２－６］．实验室常用的提取岩藻聚糖硫酸酯的方法主要有酸提法、热水提取法、ＣａＣｌ２提取法等．根据岩藻聚糖硫酸酯的水溶特性，Ｍ．Ｅ．Ｄｕａｒｔｅ等［７］采用热水提取法提取海藻中的岩藻聚糖硫酸酯，但此方法会同时提取出海藻样品中的其他多糖和水溶性成分，选择性较低．Ｓ．Ｊ．Ｌｉｍ等［８］选择ＣａＣｌ２提取法提取海藻中的岩藻聚糖硫酸酯，利用ＣａＣｌ２将海藻酸盐转化为钙盐沉淀，在除去固体残渣后获得较为纯净的岩藻聚糖硫酸酯．酸提法则是利用ＨＣｌ或Ｈ２ＳＯ４水解海藻细胞壁，从而促进岩藻聚糖硫酸酯的提取［９］，该方法同时可将海藻中的海藻酸盐转化为不溶于水的藻酸，并随其他固体残渣一起被去除．１９１３年，Ｋｙｌｉｎ首次利用稀醋酸从掌状海带中萃取出了岩藻聚糖硫酸酯，并发现其结构中含有大量的Ｌ－岩藻糖［１０］．周林林［１１］比较了热水提取法、ＣａＣｌ２提取法和酸提法对岩藻聚糖硫酸酯得率的影响，发现酸提法的得率最高，分别为热水提取法和ＣａＣｌ２提取法的１．１倍和３．５倍．利用岩藻聚糖硫酸酯不溶于乙醇的特性，可选择乙醇沉淀法进一步纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品，相较于离子交换法，该纯化方法更为简便易行．另外，Ｄｉｓｃｈｅ比色法常被用来测定岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度，该方法目标单一，几乎不受其他单糖的干扰，可快速准确地定量岩藻聚糖硫酸酯中的Ｌ－岩藻糖［１２－１３］．基于此，本文拟采用酸提法提取海藻残渣中的岩藻聚糖硫酸酯，通过单因素试验和正交试验优化提取工艺条件，采用乙醇沉淀法进一步纯化岩藻聚糖·０１·　李艳，等：海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化硫酸酯粗品，同时选择Ｄｉｓｃｈｅ比色法测定岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度，以期为岩藻聚糖硫酸酯的有效提取和海藻残渣的科学利用提供参考．１　材料与方法１．１　材料与试剂海藻残渣，由齐鲁工业大学食品科学与工程学院实验室提供；Ｋ２ＳＯ４，天津市大茂化学试剂厂产；无水丙酮，济南试剂总厂产；Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司产；乙醇（体积分数为９５％）、明胶，天津市富宇精细化工有限公司产；Ｌ－岩藻糖标准品、ＨＣｌ，莱阳经济技术开发区精细化工厂产．以上试剂均为分析纯．１．２　主要仪器与设备ＴＧ１６－ＷＳ型高速台式离心机，湖南湘仪开发有限公司产；ＦＤ－１Ａ－５０型冷冻干燥机，上海豫明仪器有限公司产；７２１型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产；ＶｏｒｔｅｘＱＬ－９０１型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产．１．３　实验方法１．３．１　岩藻聚糖硫酸酯的提取　将海藻残渣粉碎后，过６０目筛；取一定量海藻残渣样品，分别加入一定量不同浓度的ＨＣｌ溶液，于恒温水浴锅中浸提一段时间；冷却至室温后，减压浓缩至原体积的１／３以下；将所得浓缩液用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调至中性，于４０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心１０ｍｉｎ，冷冻干燥后即得岩藻聚糖硫酸酯粗品．１．３．２　单因素试验　在前期实验的基础上，选择４种对岩藻聚糖硫酸酯提取率有明显影响的因素，即ＨＣｌ浓度（０ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ、０．２０ｍｏｌ／Ｌ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｏｌ／Ｌ）、提取温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃）、提取时间（１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ）、料液比（１５、１１０、１１５、１２０），进行单因素试验，分别测定各单因素对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响．岩藻聚糖硫酸酯提取率的计算公式为岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率＝岩藻聚糖硫酸酯粗品质量海藻残渣质量×１００％１．３．３　正交试验　在单因素试验的基础上，以岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率为指标，以ＨＣｌ浓度（Ａ）、提取温度（Ｂ）、提取时间（Ｃ）和料液比（Ｄ）４个因素进行四因素三水平Ｌ９（４３）的正交试验设计，以确定岩藻聚糖硫酸酯粗品提取的最佳工艺条件．Ｌ９（４３）的正交试验因素和水平见表１．表１　Ｌ９（４３）的正交试验因素和水平表Ｔａｂｌｅ１　ＴｈｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｔａｂｌｅｏｆＬ９（４３）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ水平因素Ａ／（ｍｏｌ·Ｌ－１）Ｂ／℃Ｃ／ｈＤ１０．１５５０１１５２０．２０６０２１１０３０．２５７０３１１５１．３．４　岩藻聚糖硫酸酯粗品的纯化　采用乙醇沉淀法进一步纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品．利用褐藻酸可在低体积分数乙醇（２０％～３０％）中发生沉淀和褐藻淀粉可溶于较高体积分数乙醇（＞６０％）的性质，使用不同体积分数的乙醇对岩藻聚糖硫酸酯粗品进行分步沉淀；利用丙酮和活性炭除去色素、脂质、无机盐等杂质；加超纯水复溶后，采用Ｄｉｓｃｈｅ比色法测定岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度，以确定最适的乙醇沉淀体积分数，进而获得可行的岩藻聚糖硫酸酯粗品纯化方案．采用Ｄｉｓｃｈｅ比色法测定海藻残渣样品中岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度．配制质量浓度为０．０４ｇ／Ｌ的Ｌ－岩藻糖标准品溶液和质量分数为３％的Ｌ－半胱氨酸盐酸盐溶液［１４］．取Ｌ－岩·１１·　２０２０年１１月第３５卷第６期藻糖标准品溶液５份（０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１．０ｍＬ），加蒸馏水至１．０ｍＬ，于冰水浴中加入４．５ｍＬ体积分数为１４．３％的Ｈ２ＳＯ４溶液，１ｍｉｎ后用沸水浴加热并反应１０ｍｉｎ；降温至室温，向５份溶液中分别加入０．１ｍＬ质量分数为３％的Ｌ－半胱氨酸盐酸盐溶液，混匀，于３７℃条件下静置９０ｍｉｎ；在３９６ｎｍ和４２７ｎｍ处分别测其吸光度值，并作Ｌ－岩藻糖标准曲线［１５］．根据测得的Ｌ－岩藻糖质量浓度及标准曲线公式，即可推算出海藻残渣样品中的岩藻聚糖硫酸酯质量浓度．１．４　数据处理每个样品均重复进行３次实验，所得数据采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０软件处理并绘图．２　结果与分析２．１　单因素实验结果分析２．１．１　ＨＣｌ浓度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响　ＨＣｌ浓度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响如图１所示．由图１可以看出，ＨＣｌ浓度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响较明显，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率随着ＨＣｌ浓度的增加呈先增大后减小的趋势．当ＨＣｌ浓度为０．２０ｍｏｌ／Ｌ时，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率最大，为１．７０％，这可能是因为随着ＨＣｌ浓度的增加，ＨＣｌ分解多糖糖苷键得到更多的小分子量多糖，进而增大了岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率．而当ＨＣｌ浓度超过０．２０ｍｏｌ／Ｌ时，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率不增反减，这可能是因为ＨＣｌ浓度过大会导致岩藻聚糖硫酸酯水解，从而减小岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率．因此，选择ＨＣｌ浓度０．２０ｍｏｌ／Ｌ作为正交试验的中心值较为适宜．２．１．２　提取温度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响　提取温度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响如图２所示．由图２可以看出，岩藻图１　ＨＣｌ浓度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响Ｆｉｇ．１　ＥｆｆｅｃｔｏｆＨＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ图２　提取温度对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ聚糖硫酸酯粗品提取率随着提取温度的升高呈先增大后减小的趋势．当提取温度低于６０℃时，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率随着提取温度的升高逐渐增大，在６０℃时达到最大值１７０％，这可能是因为温度的提升加剧了分子的热运动，从而使目标提取物质更易溶出．温度继续提升至６０～８０℃之间，提取率有轻微波动，但总体上呈下降的趋势，这可能是因为温度过高造成了多糖水解，从而导致岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的降低．考虑到能耗和高温对设备的损害，适宜的提取温度应该保持在５０～７０℃之间．因此，选择提取温度６０℃作为正交试验的中心值较为适宜．·２１·　李艳，等：海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化２．１．３　提取时间对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响　提取时间对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响如图３所示．由图３可以看出，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率随着提取时间的增加先增大后减小并趋于平缓．当提取时间小于２ｈ时，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率随着提取时间的增加而增大，２ｈ时达到最大值１．４４％，这是因为增加提取时间能使提取更充分，获得更多的目标提取物．当提取时间超过２ｈ时，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率逐渐减小并趋于平缓，这可能是因为此时底物已基本上反应完全，继续增加提取时间已不能改变岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率，另外，提取时间过长还可能导致多糖水解．因此，选择提取时间２ｈ作为正交试验的中心值较为适宜．２．１．４　料液比对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响　料液比对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响如图４所示．由图４可以看出，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率随着料液比的减小呈先增大后趋于平缓的趋势．随着料液比的减小，岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率逐渐增大，１１０时达到最大值，为１．５４％，这是因为ＨＣｌ溶液用量越多，越有利于充分提取海藻渣里的多糖．考虑到提取工艺的经济成本因素，选择料液比１１０作为正交试验的中心值较为适宜．图３　提取时间对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ图４　料液比对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｌｉｄｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ２．２　正交试验结果分析正交试验结果见表２．由表２可知，４种因素对岩藻聚糖硫酸酯粗品提取率的影响大小为Ａ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｄ，即酸提法提取岩藻聚糖硫酸酯粗品时，ＨＣｌ浓度对提取率的影响最大，其次是提取时间，料液比对提取率的影响最小．最佳的提取工艺条件组合为Ａ３Ｂ１Ｃ２Ｄ２，即ＨＣｌ浓度０．２５ｍｏｌ／Ｌ，提取温度５０℃，提取时间２ｈ，料液比１１０，在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率为１．８９％．表２　正交试验结果Ｔａｂｌｅ２　Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ试验号ＡＢＣＤ提取率／％１１１３１１．７２２１２１２１．５６３１３２３１．６５４２１１３１．６８５２２２１１．６７６２３３２１．７７７３１２２１．８９８３２３３１．８７９３３１１１．７５ｋ１１．６４１．７６１．６６１．７１ｋ２１．７１１．７０１．７９１．７４ｋ３１．８４１．７２１．７４１．７３Ｒ０．２００．０６０．１３０．０３主次因素Ａ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｄ最优组合Ａ３Ｂ１Ｃ２Ｄ２·３１·　２０２０年１１月第３５卷第６期２．３　岩藻聚糖硫酸酯粗品纯化结果分析Ｌ－岩藻糖标准曲线如图５所示．由图５可以看出，Ｌ－岩藻糖标准曲线的回归方程线性关系良好．对Ｌ－岩藻糖标准品进行平行测定的结果如表３所示．由表３可知，平均偏差为０７６％，表明采用Ｄｉｓｃｈｅ比色法的测定结果误差小，准确性高，可用于岩藻聚糖硫酸酯质量浓度的测定．图５　Ｌ－褐藻糖标准曲线Ｆｉｇ．５　Ｌｆｕｃｏｓｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ表３　Ｌ－岩藻糖标准品的平行测定结果Ｔａｂｌｅ３　ＰａｒａｌｌｅｌｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆＬｆｕｃｏｓｅｓｔａｎｄａｒｄ％样品平行测定值第１次第２次第３次平均值平均偏差１２１．８６２２．１１２２．２１２２．０６２２２．５６２１．５９２３．０８２２．４１０．７６３２０．０８２１．３３２０．０８２０．５３乙醇体积分数对纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品的影响见表４．由表４可知，岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度随着乙醇体积分数的增加呈先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为７０％时，岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度达到最大值．因此，纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品较适宜的乙醇体积分数为７０％．３　结论本文采用酸提法提取海藻残渣中的岩藻聚糖硫酸酯，通过单因素试验和正交试验优化的表４　乙醇体积分数对纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品的影响Ｔａｂｌｅ４　Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｕｄｅｆｕｃｏｉｄａｎｓｕｌｆａｔｅ乙醇体积分数／％岩藻聚糖硫酸酯质量浓度／（μｇ·ｍＬ－１）３０１．１９４０２．２３５０２．７０６０３．１１７０３．１２８０３．１１最佳提取工艺条件为ＨＣｌ浓度０．２５ｍｏｌ／Ｌ，提取温度５０℃，提取时间２ｈ，料液比１１０，在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯粗品的提取率为１８９％．采用乙醇沉淀法进一步纯化岩藻聚糖硫酸酯粗品，结合Ｄｉｓｃｈｅ比色法筛选出最优的乙醇沉淀体积分数为７０％，此时岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度达到最大值，为３．１２μｇ／ｍＬ．本研究可为科学利用海藻残渣提供技术参考，为海洋高附加值产品的提取提供借鉴，有望进一步推动岩藻聚糖硫酸酯等功能性物质的深入研究．参考文献：［１］　聂小伟，何粉霞，陈志兵，等．响应面优化海带岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺研究［Ｊ］．食品研究与开发，２０１７，３８（２３）：４４．［２］　杨月梅，王士斌．新型药物载体岩藻聚糖硫酸酯的研究进展［Ｊ］．材料导报，２０１１，２５（２１）：９１．［３］　赵铮蓉，任娟，朱旭祥．褐藻多糖的药理作用与制备［Ｊ］．海洋学研究，２００４，２２（３）：６２．［４］　杨雷．低聚岩藻多糖的制备及抗寒诱导效应研究［Ｄ］．大连：辽宁师范大学，２００６．［５］　ＣＵＭＡＳＧＩＡ，ＵＳＨＡＫＯＶＡＮＡ，ＰＲＥＯＢＲＡＺＨＥＮＳＫＡＹＡＭＥ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ，ａｎｄａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｎｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｕ·４１·　李艳，等：海藻渣中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺优化ｃｏｉｄａｎｓｆｒｏｍｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１７（５）：５４１．［６］　ＢＩＳＷＡＪＩＴＡＰ，ＳＲＩＭＡＮＴＡＰ，ＲＡＢＩＮＤＲＡＮ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｏｆｆｕｃｏｉｄａｎ，ｓｕｌｆａｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ：Ａｊｏｕｒｎｅｙｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅａｉｎｐｕｒｓｕｉｔｏｆｐｏｔｅｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０，１６４：４２６３．［７］　ＤＵＡＲＴＥＭＥ，ＣＡＲＤＯＳＯＭＡ，ＮＯＳＥＤＡＭＤ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｆｕｃｏｉｄａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄＳａｒｇａｓｓｕｍｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌｕｍ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２００１，３３３：２８１．［８］　ＬＩＭＳＪ，ＷＡＮＡＩＤＡＷＭ，ＭＡＳＫＡＴＭＹ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｆｕｃｏｉｄａｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＭａｌａｙｓｉａｎＳａｒｇａｓｓｕｍｂｉｎｄｅｒｉ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，２０９：２６７．［９］　ＳＥＮＧＪＬ，ＷＡＮＭＷＡ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｓｕｌｆａｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｆｕｃｏｉｄａｎ）ｆｒｏｍｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄ［Ｍ］∥ＪＡＹＡＣＨＡＮＤＲＡＮＶ，ＳＵＫＵＭＡＲＡＮＡ，ＳＥＫＷＯＮＫ．Ｓｅａｗｅｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１７：２７－４６．［１０］张惟杰．复合多糖生化研究技术［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９８７：２４７．［１１］周林林．海带渣中岩藻聚糖硫酸酯提取条件和硫酸基含量测定方法研究［Ｄ］．青岛：中国海洋大学，２０１３．［１２］赵增芹．海带中Ｌ－褐藻糖的测定及其制备［Ｄ］．青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），２００４．［１３］王春霞，高鹏，王晓梅，等．海带中岩藻聚糖硫酸酯的测定方法比较［Ｊ］．轻工科技，２０１４，３０（９）：１５．［１４］ＫＵＭＡＲＮＳＳ，ＮＡＺＥＥＲＲＡ，ＪＡＩＧＥＮＥＳＨＲ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｅｓｋｉｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｏｆｔｗｏｍａｒｉｎｅｆｉｓｈｅｓ，ｈｏｒｓｅｍａｃｋｅｒｅｌ（Ｍａｇａｌａｓｐｉｓｃｏｒｄｙｌａ）ａｎｄｃｒｏａｋｅｒ（Ｏｔｏｌｉｔｈｅｓｒｕｂｅｒ）［Ｊ］．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，２０１２，４２（５）：１６４１．［１５］蔡璐．不同分子量马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及降血脂机理的初步研究［Ｄ］．湛江：广东海洋大学，２０１４．·５１·。

一种从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011107485.6(22)申请日 2020.10.16(71)申请人中国海洋大学地址 266003 山东省青岛市市南区鱼山路5号(72)发明人赵雪　王莉　张鸿伟　张晓梅　安子哲　卢海燕　(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201代理人曾庆国(51)Int.Cl.C08B 37/08(2006.01)C08B 37/00(2006.01)(54)发明名称一种从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法(57)摘要本发明提供一种从海参中同步提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法，更有效的利用海参组织中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的结构和水溶性不同，完成海参中两种硫酸多糖的提取和分离。

本发明方法具有提取条件温和、过程简便的优势，有效的从海参中将硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯进行提取和分离纯化；节省了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的离子色谱分离、凝胶色谱纯化和脱盐等步骤，大大简化了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的分离纯化工艺。

本发明方法成本低廉、容易扩大、回收率高，是一种绿色环保的大规模制备海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素两种硫酸多糖纯品的方法。

权利要求书1页说明书4页附图2页CN 112175107 A 2021.01.05C N 112175107A1.一种从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)海参预处理：将海参进行组织破碎后加入蒸馏水进行浸提，浸提结束后进行离心，取沉淀待用；2)水溶液提取和分离：将步骤1)离心获得的沉淀中加入Tris -HCl水溶液进行提取，提取结束后离心，收集提取液和沉淀；3)将步骤2)获得的提取液真空浓缩后，加入氯化十六烷基吡啶进行沉淀，离心收集沉淀；沉淀溶解于添加了NaCl的醇溶液中；然后用90％乙醇水溶液进行沉淀、冷冻干燥后得海参岩藻聚糖硫酸酯干品；4)将步骤2)中获得的沉淀加入复合蛋白酶，在45-60℃水浴中酶解3-5h；5)将步骤4)的酶解液离心，收集上清液；上清液真空浓缩后，采用超滤膜超滤脱蛋白脱盐，收集截留液；截留液经真空浓缩、干燥后，得到岩藻糖基硫酸软骨素干品。

三种褐藻中岩藻聚糖硫酸酯的纯化及结构分析

三种褐藻中岩藻聚糖硫酸酯的纯化及结构分析多肋藻、日本真海带与厚叶解曼藻是具有较高经济价值的三种褐藻，岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)也称褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖胶，主要存在于多种褐藻中，是一种水溶性的硫酸杂多糖，具有多种生物活性，是海洋生物活性物质的研究热点。

本研究以此三种褐藻为原料，用DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析分离纯化岩藻聚糖硫酸酯，分别得到4、3、4种组分。

对各组分的总糖、硫酸基、岩藻聚糖硫酸酯含量进行了测定和对比；并对比分析了其分子结构。

通过对多肋藻、日本真海带和厚叶解曼藻进行复合酶解提取，乙醇分级沉淀法纯化，制备得到岩藻聚糖硫酸酯产品CF、SF和KF；利用DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析对岩藻聚糖硫酸酯进行分离纯化。

多肋藻经分离纯化得到四个组分CF1、CF2、CF3和CF4，多糖组分主要集中在盐洗脱部分，其得率分别为2.81%、27.55%、11.44%、23.48%，CF2为低硫组分，其硫酸基含量为1.01%，CF4为高硫组分，硫酸基含量为16.12%；日本真海带经分离纯化得到三个组分SF1、SF2以及SF3，多糖组分也主要集中在盐洗脱部分，得率分别为12.95%、63.71%、15.70%，其中SF2为低硫组分，其硫酸基含量为5.56%，SF3为高硫组分，硫酸基含量达高达27.08%；厚叶解曼藻经分离纯化得到四个组分KF1、KF2、KF3以及KF4，多糖组分全部集中在盐洗脱部分，各组分分别占组分总量的4.41%、18.98%、4.04%、57.45%，其中KF1为低硫组分，其硫酸基含量为4.27%，KF4为高硫组分，硫酸基含量达高达29.31%。

经Sephadex G200凝胶柱分离可知，真海带和厚叶解曼藻所得组分SF1、SF2、SF3、KF1、KF2、KF3和KF4组成单一，分子量分别约为48KD、146KD、155KD，136KD、136KD、119KD、104KD；多肋藻所得组分CF1、CF2和CF4的分子量约为52KD、5KD和94KD，其中CF3经凝胶柱层析分离后得到两个峰，即CF3-1和CF3-2，表明CF3组分纯化程度较差，两个组分分子量约为103KD和5KD。

分子量对海参岩藻聚糖硫酸酯活性和消化吸收的影响研究的开题报告

分子量对海参岩藻聚糖硫酸酯活性和消化吸收的影响研究
的开题报告
一、选题背景
海参岩藻聚糖硫酸酯（海参多糖）是从海参中提取的一种多糖类化合物，具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、减轻心血管系统损伤等。

但是，由于其分子量较大，存在一定的消化吸收难度。

因此，在研究海参多糖的活性和应用价值时，分子量
的影响是一个重要的研究方向。

二、研究目的
本文旨在探讨海参多糖分子量对其活性和消化吸收的影响，并寻找适宜的海参多糖分子量范围，以提高其应用价值和效果。

三、研究内容和方法
1. 海参多糖分子量的测定：采用凝胶渗透色谱分析法，分析不同分子量的海参多糖。

2. 海参多糖活性的测定：选取细胞培养、小鼠免疫、抗氧化等多个模型测定海参多糖的活性，比较不同分子量下海参多糖的活性差异。

3. 海参多糖消化吸收的测定：模拟人体消化过程，采用体外模拟肠道消化法和肠上皮细胞模型法，测定不同分子量下海参多糖的消化吸收效果和影响因素。

四、研究意义和预期成果
本研究将探讨海参多糖分子量与活性、消化吸收之间的关系，为其应用提供理论基础和实验依据。

预计可以寻找海参多糖适宜的分子量范围，提高其应用效果和意义。

同时，本研究可为海参多糖进一步研究提供新的思路和方法，为人类健康事业做出贡献。

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＝＝８
２０１７年１月第３８卷第２期
ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈＡｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
食品研究与开发
分离提取
ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１７．０２．０１０
ｏｆ２００ｋＤａａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｐｕｉｆｒｙｉｎｇＳＣＦ．ｈｅＴｐｒｏｄｕｃｔｔｏｔａｌｓｕｇａｒｃｏｎｔｅｎｔｗａｓａｓｈｉｇｈａｓ５６．１２％．ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ
海参岩藻聚糖硫酸酯的超滤纯化工艺ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ究
王瑞芳，吴光斌，谢远红，陈素艳
（集美大学食品与生物工程学院福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门３６１０２１）
摘要：采用超滤膜分离技术对海参岩藻聚糖硫酸酯提取液进行纯化，研究膜截留分子量、跨膜压力等对膜通量及
纯化效果的影响，并测定了膜污染后的清洗效果。结果发现：截留分子量２００ｋＤａ的ＵＶ２００膜最适于海参岩藻聚糖硫酸酯的分离纯化，所得固形物产品中总糖含量高达５６．１２％，蛋白质含量仅为６．３７％，岩藻糖含量为３６．３４％，硫酸根
ＷＡＮＧＲｕｉ－ｆａｎｇ，ＷＵＧｕａｎｇ－ｂｉｎ，ＸＩＥＹｕａｎ－ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＳｕ－ｙａｎ
（ＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｚｙｍｅＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇ，ＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１０２１，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）
含量为１０．７５％；超滤工艺优化结果显示，跨膜压强以Ｏ．２ＭＰａ为宜，蛋白质脱除率高达９１．０９％，色素脱除率可迭
６５．３０％；膜污染后，采用含酶强碱性清洗剂可有效去除膜面污染物。
ｏｎｌｙ６．３７％．ｆｕｃｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ３６．３４％ａｎｄｓｕｌｆａｔｅｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ１０．７５％．ｈｅＴｒｅｓｕｌｔｓｏｆｕｈｒａｆｉｈｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓ０．２ＭＰａｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅａｓｈｉｇｈａｓ９１．０９％ａｎｄｔｈｅｐｉｇｍｅｎｔｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅ６５．３０％．ｈｅＴｓｔｒｏｎｇａｌｋａｌｉｎｅｃｌｅａｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｎｚｙｍｅｃｏｕｌｄｅｆ－ｆｅｅｔｉｖｅｌｙｒｅｍｏｖｅｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓａｔｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｒｆａｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｅａｃｕｃｕｍｂｅｒｆｕｃｏｉｄａｎ；ｕｈｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ｍｅｍｂｒａｎｅ —ｃｌｅａｎｉｎｇ
关键词：海参岩藻聚糖硫酸酯；超滤；膜清洗
ＳｔｕｄｙｏｎＰｕｒｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆＳｅａＣｕｃｕｍｂｅｒＦｕｃｏｉｄａｎｂｙＵｌｔｒａｉｌｆｔｒａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｗｅｉｇｈｔｃｕｔ —ｏｆａｎｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｅｓｓｕｒｅｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｆｌｕｘａｎｄｐｕｉｆｒｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｃｌｅａｎｉｎｇｆｏｒｐｏｌ－ｌｕｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＵＶ２００ｍｅｍｂｒａｎｅｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｃｕｔ－
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅａｃｕｃｕｍｂｅｒｆｕｃｏｉｄａｎ（ＳＣＦ）ｗｅｒｅｐｕｉｒｔｉｅｄｂｙｕｌｔｒａｉｆｈｒａｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒ