体外抗氧化实验方案

体外抗氧化实验方案

一、DPPH自由基清除法

[原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。

ON2

NONN2

NO2

当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。

[实验步骤]

1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M

取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 Vc溶液

(0.25mg/ml)

称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液

1.3 预试

取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、

200μL。浓度梯度mg/ml为

0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400

μg/ml 2.5、5、 10、20、40

1.4 测量

A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。 0 A值的测量:

取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。加样表如下:

表1 加样表

样品液甲醇总体积 DPPH测试液

30μL 970μL 2 mL 3mL

60μL 940μL 2 mL 3mL

120μL 880μL 2 mL 3mL

240μL 760μL 2 mL 3mL

480μL520μL 2 mL 3mL

1.5 正式测量

方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A. 0

[实验结果]

清除率(抑制率)的计算公式:

AA,0 Inhibition % = 100%，A0

二、FRAP法分析维生素C抗氧化作用实验原理:

3+参照Benzie与Strain的方法，原理为Fe-三吡啶三吖嗪(TPTZ)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色3并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

实验试剂

醋酸钠(三水)，冰醋酸，TPTZ，FeCl3•6HO，FeSO4•6HO 22

不同梯度FeSO4溶液配制:称取695mgFeSO•6HO，定容至25ml，即100mM，按梯度配42

制成10、25、100、150、200、400、500μM溶液

TPTZ工作液配制:

(1)称取1.02g乙酸钠(三水)，加4ml冰醋酸，定容至25ml(调整pH=3.6) (2)称取TPTZ粉末 7.8mg(小心腐蚀皮肤)，溶于2.5ml 40mM HCl溶液中，溶液澄清透明。 (3)称取1.35g FeCl3•6HO 溶于25ml水中，取2.5ml溶液定容至25ml，即20mM的FeCl溶23液。混匀三种溶液(10:1:1)制成TPTZ工作液，现配现用。

不同梯度Vc溶液配制:

取Vc溶于水，配成含Vc5、10、20、30、40、50μg/ml溶液(预实验)

实验步骤

(1)标准曲线的测定:按10:1:1比例，精确量取醋酸钠溶液，TPTZ溶液和不同梯度FeSO溶4液，混匀后于37?反应10min，测定593nm处吸光度，以醋酸钠溶液调零。以FeSO坐浓度为纵4标(表示为FRAP值)，吸光度为横坐标，绘制FRAP标准曲线。

(2) 取100μL不同浓度的Vc溶液，加入1.9mlTPTZ工作液混匀后37?反应

30min，测定593nm

处吸光度，以醋酸钠溶液调零，样品抗氧化活性(FPAP value)以达到同样吸光度所需的FeSO4

表示。进行平行实验。毫摩尔数