紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法

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µl MgCl2
5 µl NADP
5 µl 葡萄糖
12.5 µl ATP
121.5 µl Tris 缓冲液
0.5 µl 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
∑= 149.5 µl
使用移液器快速将溶液转移到比色皿槽的超微量比色皿中。 为适应反应温度，测定参数包括预孵育时间，时间至少为 6 分钟。 开始测定时，记录在 340nm 时的吸光度值变化。当检测不到 吸光度的进一步变化时，加入 0.5 µl 的己糖激酶溶液开始酶 促反应（约 1 分钟后）。
行跟踪。由于反应速度在酶测定时可能会快速变化，所以
每 10 秒（图 4）收集一次数据。活性测定的参数（图 5A）
和底物测定的参数（ 图 5B 和 5C）是根据初步实验的结果
设定。如图 5 所示，为测定活性和底物浓度，Hale Waihona Puke Baidu择了不同
的方法。使用线性回归方法确定己糖激酶的活性。线性回归
分析中，每 5 秒测定一次。该反应是在预热 6 分钟后（参数“延
为了进行测定，使用源自面包酵母的己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶进行偶联反应。由于 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学款）带有温控比色皿槽，也可演示这一反应对温度的依赖性。在 37 °C 时，检测到最高活性。
引言
己糖激酶反应的代谢意义
吸光度
NAD(P)/NAD(P)H2 光谱
3.000
2.500 2.000 1.500
NAD(P) NAD(P)H2
1.000
0.500
0.000 240 260 280 300 320 340 360 380 400 波长 ［ｎｍ］
图 1：NADP/NADPH2 的吸收光谱
NADPH2 在 340 nm 波 长 下 的 吸 收 峰 可 以 区 分 两 种 物 质。这 样， NADP/NADPH2 依赖性酶的活性就可以通过在 340 nm 处的吸光度 值变化来确定。
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迟”（Delay））加入己糖激酶开始的，总共检测时间为 6 分钟。
实验参数是根据初步实验使用 “单波长λ- 连续”（Singleλ-
continuous）（见上）设定的。以下公式分别用于计算酶活
性和底物浓度：
图 3：活性测定选项 A) 单波长λ- 连续 B) 简单动力学 C) 高级动力学 （Singleλ- continuous） （Simple kinteics） （Advanced kinetics）
再加入葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶和己糖激酶，充分混匀溶液， 分别在 22 °C、30 °C 和 37 °C 进行测定。
通过己糖激酶测试测定底物 为测定底物，使用与己糖激酶活性检测相同的成分。为测定 样品中未知浓度的 ATP，使用 1 mM 和 0.1 mM 的 ATP 作 为标准品。
BioSpectrometer kinetic 的设置 BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学款） 提供三种方法测定酶的活性（图 3）：
为了能直接从吸光度测定结果分别计算 U/L 或 µmol/min×L 的酶活性，（1 L 的相对酶活），系数需要从 mol/L 改成单位 µmol/L，即需要乘以 1 × 106。因此，系数应是 161。在图 5A 中， 给出 1 ml（U/ml） 酶活性的换算系数，所以系数是 0.161。 然后，直接从计算的斜率推导出酶活性，并在测定后显示。
图 2 中描述的检测反应是本用户指南中的一个样例反应。 其目的是为了演示使用 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学款）进行酶动力学测定的 两种应用：
1) ATP 浓度的酶测定 底物的浓度通过 37 ° C 下定量 ATP 的两点校准法来确定。 这一过程中，在底物转化的线性范围内进行两次测定。该转 化的线性范围需在初步测定中确定。 2) 酶活性的测定 如图 2 所示，己糖激酶反应对温度的依赖性。在 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学 款）具备可加热比色皿槽，可以对样品进行温度控制：可选 温度范围在 20 °C 到 42 °C 之间。由于酶活性与孵育温度相关， 所以温度调节对于酶活性的精确测定至关重要。因此，分别 在 22 ° C、30 ° C 以及 37 ° C 下测定己糖激酶的酶活性。根 据曲线的线性回归确定准确的酶活性。
Tris 缓冲液 pH 7.0 MgCl2 葡萄糖 NADP+ ATP 己糖激酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在 Eppendorf IsoPack 冰盒中以 4 °C 保存。Tris 缓冲液在室温下保存。酶 在使用后立即放回冰箱。
以下是用于一次测定反应所需溶液的量：
材料
BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学 款），IsoPack 冰盒 +IsoRack 支架（Eppendorf），Ultra-Mikro 比色皿 105.202-QS（Hellma, 105-202-85-40） ATP（Roche Applied Science, 10127523001） 酿酒酵母己糖激酶（Roche Applied Science, 11426362001） 酿酒酵母葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶（Roche Applied Science, 10127671001） NADP（Sigma-Aldrich, 93205-50MG） α-D- 葡萄糖（Sigma-Aldrich, 158968-25G） MgCl2（Sigma-Aldrich, 63069-100ML） Tris 缓冲液 pH 7.0（AppliChem, A5247, 0500） 分子生物学用水（AppliChem, A7398,1000）
糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 解。葡萄糖通过分步反应转化为 2 分子的丙酮酸。1 分子的 葡萄糖生成 2 分子的 ATP 和 2 分子以 NADPH2 形式存在的 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 的降解产物是 H2O 和 CO2。
在 BioSpectrometer kinetic 上进行线性回归分析以测定酶活 只在在曲线线性范围内的酶活性进行分析，因为只有在线性 范围内才可以排除诸如底物浓度降低或来自最终产物的抑制 作 用 等 类 似 抑 制 因 素。Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外 ／ 可见光分光光度计（动力学款）反向将回归曲线变为 线性曲线，并提供在活性检测时使用线性回归加以分析。在 测定过程结束后，激活 “处理结果”（Process results）区 里的 “线性回归”（Linear regression）功能。这样，就可以 重新设定回归曲线的起点和终点（图 6）。
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文献参考
酶活性测定不但可以确定酶的性质，还可以用来分别检测某 些底物或底物的浓度。如可以使用以上提到的己糖激酶反应 测定葡萄糖或 ATP 的浓度。通过与葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 在偶联反应中生成 NADPH2 可间接检测葡萄糖或 ATP。生 成 ATP 的量与葡萄糖或 ATP 的量成正比（图 2）。
方法
己糖激酶活性测定
所有测定均是在 Eppendorf BioSpectrometer 紫外 ／ 可见光
分光光度计上进行的。为进行酶测试，准备以下溶液：
• 10 ml 0.1 M • 1 ml 0.1 M • 1 ml 5 mM • 0.5 ml 10 mM • 1 ml 1 mM • 1 ml • 2 ml
代谢酶的酶促降解检测 由于这些相关代谢途径和酶的意义重大，所以它们在生化研 究和教育领域中倍受关注。其中一个重要的方面是酶活性的 测定，因为酶活性是酶的独有特征。测定各个酶活性的基本 方法是使用分光光度计进行光度测定法。
由于 NADP（NAD）和 NADPH2（NADH2 ）分别参与中间代 谢中几乎所有酶促反应，酶活性的确定主要是通过 NADPH2 的增加或减少来确定。NADP 和 NADPH2 均在 260 nm 波 长下显示出最大吸收峰。然而，NADPH2 在 340 nm 波长下 还会显示一个波峰（图 1），这就可以在光度测定上区分 NADPH2 和 NADP。
a) “单波长λ- 连续”（Singleλ- cont） ：限定波长、限定 时间间隔以及限定一段时间内简单测定吸光度值的变化。温 度控制功能可选。该方法特别适用于初步实验，即某反应的 动力学检测（速度、线性范围）。 b) “简单动力学”（Simple kinteics） ：和 a) 一样；另外可 以定义直接换算吸光度值的单位和换算系数。可以进行终点 测定、两点测定以及线性回归分析。“延迟”（Delay）功能 可对延迟检测过程进行编程，以确保反应混合液充分适应实 际测定温度等。 c) “高级动力学”（Advanced kinetics） ：和 b) 一样；另外 提供 “试剂空白对照”（Reagent blank）编程以及标准品编程。 “试剂空白对照”（Reagent blank）可以验证在反应开始前 没有显著的吸光度值变化。
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文献参考
3A
4
图 4：“单波长λ- 连续”（Singleλ- cont） 方法中己糖激酶测定初步 实验的参数设置
3B
为 测 试 己 糖 激 酶 反 应 的 进 程，先 使 用 “单 波 长λ- 连 续”
（Singleλ- cont）方法进行初步反应。选择的参数可以对反
应混合液的吸光度在一定持续时间内（10 分钟）的变化进
直接计算酶活性 图 5A 中的系数是根据 NADPH 的摩尔吸光系数（6.32×103 L / (mol * cm)）计算所得。
朗伯 － 比尔定律基本原理： A= ε× c × l 或 c=A/ε× l 其中 c 为浓度，A 为吸光度，ε为摩尔吸光系数，l 为光路（比 色皿光路长度）。 对于光路长度为 1 cm 的比色皿，适用以下公式：分别是 c=A/ε或 c=A × 1/ε或 c=A × F。 这样，系数 F 就是摩尔消光系数的倒数，它的单位分别是 mol/L 或 µmol/µl（相对于 NADPH2 1.61 × 10-4）。
葡萄糖 + ATP
己糖激酶 / Mg 2+
葡萄糖-6-磷酸 + ATP
葡萄糖－６－磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸 + NADP
6-磷酸葡萄糖 + NADPH2
图 2：葡萄糖或 ATP 的间接酶检测 两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶催化的偶联反 应得以确定（偶联测试系统 [1]）。通过生成的 NADPH2 的量来计算 两种物质的量。
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文献参考
5A
6A
5B 6B
5C 6C
图 5：酶活性和底物浓度测定参数 Ａ） “ 简单动力学”（Simple kinteics） 方法中通过线性回归测定己糖 激酶的参数。 Ｂ） ＋ Ｃ）“ 高级动力学”（Advanced kinetics） 方法中通过两点校准测 定底物浓度的参数。
底物浓度测定 在测定底物浓度的过程中，预孵育 7 分钟后进行一次测定，然 后加入己糖激酶，将反应混合物温育 2 分钟。根据两点测定法， 分别在孵育起始时和结束时各进行一次测定。为计算样品的浓 度，在限定底物浓度的情况下进行两次初步标准品测定。未知 样品的浓度根据标准品来计算。
文献参考
使用酿酒酵母己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 在 Eppendorf BioSpectrometer® kinetic 紫外 / 可见光
分光光度计上进行酶动力学测定
简介
该用户指南将演示使用 Eppendorf BioSpectrometer 紫外 ／ 可见光分光光度计进行的酶活性测定。为优化测定流程，先使用 “单 波长λ- 连续”（Singleλ- continuous）测定法进行初步测定。然后，根据这些结果进行实际活性测定。通过线性回归确定酶活性。
己糖激酶反应活化葡萄糖 葡萄糖的降解维持着所有生物的呼吸作用。在降解葡萄糖之 前，需使葡萄糖易于降解，即激活。这一过程包括己糖激酶 催化的葡萄糖磷酸化和消耗 ATP，生成葡萄糖 -6- 磷酸。后 者实际上是糖酵解的初始底物（图 1）。
另外，葡萄糖 -6- 磷酸也是进一步重要代谢途径 ，即戊糖 磷酸途径的初始底物。戊糖磷酸途径可提供重要的氧化还原 产物，如 NADPH2，以及被认为进一步参与分解代谢和生物 合成途径的各种碳水化合物。