肠道干细胞分离方法
基因治疗用于胃肠道疾病的最新研究现状
基因治疗用于胃肠道疾病的最新研究现状胃肠道疾病包括胃溃疡、炎症性肠病、肠易激综合征等多种消化系统疾病。
这些疾病给患者带来了巨大的健康负担，严重影响了他们的生活质量。
传统的治疗方法往往只能缓解症状，难以根治疾病。
然而，随着基因治疗技术的不断发展，人们开始关注基因治疗在胃肠道疾病中的应用前景。
基因治疗是利用基因工程技术来修复或治疗疾病的一种新兴治疗方法。
它通过改变人体基因的表达或功能，来达到治疗疾病的目的。
在胃肠道疾病的治疗中，基因治疗主要涉及以下几个方面的研究。
首先，基因治疗可以针对特定的致病基因进行修复。
研究人员发现，一些胃肠道疾病与特定的基因突变相关。
通过基因编辑技术，可以精确地修复这些突变基因，从而达到治疗疾病的效果。
例如，近年来的研究发现，炎症性肠病与NOD2基因突变密切相关。
科学家通过基因编辑技术成功修复了NOD2基因的突变，使其恢复正常功能，从而为炎症性肠病的治疗提供了新方向。
其次，基因治疗还可以通过调节免疫系统来治疗胃肠道疾病。
胃肠道疾病的发生往往与免疫系统失调有关。
通过改变某些关键基因的表达，可以调节免疫系统的功能，从而减轻炎症反应，改善胃肠道疾病的症状。
例如，最近的研究发现，调节肠道黏膜中的基因表达可以改变肠道免疫系统的平衡，从而减轻炎症性肠病的症状。
这一研究为基因治疗在炎症性肠病治疗中的应用提供了新思路。
此外，基因治疗还可以通过引导干细胞分化为胃肠道组织来治疗疾病。
一些胃肠道疾病由于组织损伤而导致功能障碍。
研究表明，通过基因治疗的方法，可以将患者自身的干细胞引导分化为胃肠道组织，实现组织的修复和再生。
这种方法被认为是治疗各种胃肠道疾病的一种潜在治疗途径。
目前，这一领域的研究已经取得了一些进展，但仍面临许多挑战，包括有效地引导干细胞分化为特定类型的胃肠道组织以及防止细胞异质性的发生等。
最后，基因治疗还可以通过基因转导技术来传递治疗基因。
基因转导技术是基因治疗中最常用的手段之一，可以将治疗基因传递到目标细胞中，从而改变细胞的功能和表达。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展耿艳霞【摘要】The intestinal mucosa epithelial cells are constantly self-renewing for a life time, this is realized by the stem cells through their continuous proliferation, differentiation and ultimate replacement of the lost epithelial cells. This dynamic balance plays an important role in normal intestine integrity maintenance, as well as intestinal restoration after injury. Right now, there is a lack of effective treatment after mucosal damage. In the natural wound repair process, intestinal stem cells (ISC) divide faster, and promote the restoration procedure. Understanding the biological characteristics of ISC such as its location, molecular marker, and mechanism of proliferation and differentiation, is meaningful in promoting the intestine structure and function regaining after injury.%肠黏膜上皮细胞终身不断自我更新,这一过程须凭借肠道隐窝干细胞(intestinal stem cell,ISC)持续增殖、分化,取代终末分化细胞来完成.这种动态平衡在正常肠道结构和功能的维持以及肠道损伤后的修复过程中起着重要作用.目前肠道黏膜损伤尚缺乏有效的治疗手段,ISC在肠道损伤后分裂加快,促进了损伤修复.了解ISC的相关生物学特性,例如定位、标记、分裂分化机制等对于促进肠道损伤后结构与功能的完全修复有着重大意义.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2013(026)002【总页数】5页(P181-185)【关键词】肠道干细胞;定位;分裂;分化;损伤修复;信号通路【作者】耿艳霞【作者单位】210002,南京,南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)解放军普通外科研究所【正文语种】中文【中图分类】R730.530 引言肠道上皮是成年哺乳动物机体代谢最活跃的场所，也是自我更新最快的组织之一。
结肠癌干细胞标记物及其相关通路的研究进展
结肠癌干细胞标记物及其相关通路的研究进展
结肠癌干细胞是一种特殊的肿瘤细胞亚群，具有自我更新、多向分化和肿瘤形成的能力。
研究表明，结肠癌中广泛存在着干细胞标记物，这些标记物可用于确定肿瘤干细胞，且与结肠癌的进展、复发和预后密切相关。
目前，已有许多干细胞标记物及其相关通路被用于研究结肠癌干细胞，本文将对其中较为重要的标记物进行综述。
1. CD133标记物及其相关通路
CD133（俗称AC133）是一种典型的肿瘤干细胞标记物，在结肠癌中表达量较高，被认为是结肠癌干细胞的标志物之一。
研究发现，CD133阳性的结肠癌细胞干细胞比例较高，具有很强的肿瘤形成能力和化疗耐药性。
此外，CD133还与Wnt/β-catenin等信号通路的活化相关。
Lgr5（又称GPR49）是一种受体蛋白，被认为是肠道干细胞的特异性标志物。
近年来的研究显示，Lgr5在结肠癌中也表达较高，并且能够促进结肠癌干细胞的自我更新和肿瘤形成。
此外，Lgr5还与Wnt/β-catenin通路等信号通路密切相关。
EpCAM（也称TACSTD1）是一种单个跨膜型细胞表面糖蛋白，广泛分布于多种肿瘤中。
研究表明，在结肠癌中，EpCAM的表达量也较高。
EpCAM阳性的结肠癌细胞显示出肿瘤形成和转移能力高等特征，与Wnt/β-catenin等信号通路相关。
综上所述，结肠癌中广泛存在着干细胞标记物，这些标记物在结肠癌干细胞的识别、分离和研究中具有重要的应用价值。
此外，这些标记物所涉及的信号通路也成为了研究结肠癌干细胞的热点方向之一，为深入探究结肠癌的发生和发展提供了新的思路和方法。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景，被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞，研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法，适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下：1. 细胞准备：收集组织样品，将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制：根据所需提取的干细胞类型，选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养基中并进行培养，在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离：通过倒置显微镜观察，使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化：将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化，去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法，利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下：1. 细胞样品准备：提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记：将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合，可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选：使用流式细胞术仪器进行细胞分选，根据标记物的不同发射光强度，将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化：将目标干细胞从其他细胞中纯化出来，根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法，可在单个细胞层面进行分析，帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下：1. 单细胞捕获：通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解：采用细胞裂解酶对细胞进行裂解，释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增：使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备：将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备，包括文库构建、PCR扩增等步骤。
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准胃肠道恶性肿瘤是威胁我国人民生命健康的公共卫生问题之一。
良好的实验模型是解析肿瘤发病机制和研发临床治疗新方法的有力工具。
高质量的生物医药研究需要实验模型尽可能再现来源组织的生理、病理状态。
类器官（Organoid）便是新近发展起来的一种新型实验模型。
类器官是指将部分活组织在体外3D培养基中扩增、传代形成的小器官样细胞团。
类器官在组织细胞构成、生物学功能及基因组变异谱上均与其来源组织有极高的相似性。
类器官具有制备周期短、可以长期低温保藏和可重复使用等诸多优势。
近年来，国内外较多机构开展该领域的工作并积累了一定的经验。
为了使胃肠道肿瘤研究中类器官相关技术得到有效利用和健康发展，作者以采用常用实验耗材与试剂为例，就类器官构建中组织样本前处理、类器官构建、类器官冻存与复苏、类器官生长状态评估以及类器官质量控制等关键技术提出可参照标准。
类器官构建的总原则此标准是基于酶消化法将人胃肠道正常黏膜上皮和胃肠道腺癌组织制备成单个细胞悬液,再将细胞与3D培养支架（此处指基质胶）混合形成3D胶滴,再加入市售的胃肠道上皮专用完全培养基进行培养（类器官专用特定培养基是指含有所培养组织细胞需要的生长因子、细胞因子以及小分子化合物）。
其目的是模拟胃黏膜上皮的生长微环境，促使胃肠道干细胞分化成为各种类型的胃肠道黏膜上皮细胞，同时还可维持胃肠道干细胞或多能干细胞的干性，实现体外长期培养、传代目的，便可培养出与胃肠道黏膜组织结构功能类似的活组织类器官。
类器官培养中涉及到的供体生物样本来源均以自愿同意参与科学研究为原则，并以签署知情同意书QnfOrmedConSent)为具体体现。
主要试验耗材与试剂主要耗材包括24孑麻、1.5mLEP管、15mL离心管、培养皿、50mL离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、无菌棉球、银子、组织剪、70~100μm细胞过滤器(Coming)、细胞程序性冻存盒等。
干细胞提取过程
干细胞提取过程Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT一、实验准备1通知来血后，就应开始做实验准备，准备采集盒里面要有一个采血袋、采血管、温度计放置于有冰袋的保温箱里交给运输人员，保持运输温度高于4℃低于20℃.2实验室要事先做好清洁，打开传递窗口的紫外灯和生物安全柜的紫外灯，需照射30min，吹风10min。
3准备的物品：信息采集室要有无尘布、酒精棉球、棉签、喷壶、手套、储物盒、垃圾桶、垃圾袋、最好有热合机；在洁净室要准备，5ml、10ml、20ml、50ml注射器各2-3个，冷冻袋1个，剪刀3把，止血钳3把，EP管2-3个。
二、信息采集1接收到采集盒，带上手套，并喷上酒精消毒，打开盒子检查里面的物品，采血袋，采血管是否破损，有无漏血现象，并把各个管道的夹子夹紧。
2填写各种信息表格。
《脐血接收登记表》、《脐血交接记录》、《脐血采集信息等记表》、《脐血供者健康信息调查登记表》。
3按照公司规定打印标签，等酒精干后在采血袋上贴标签。
4把采血袋放入储物盒里放到传递窗中。
（传递窗口应用紫外照射30min，吹风10min）三、脐血制备1到洗手间把采集室所带的手套扔掉，用洗手液彻底把手洗干净。
2在一更换鞋，并脱掉日常穿的白大衣放在衣柜里；二更换洁净服，戴上帽子、口罩、手套。
3进入洁净室，从传递窗口把脐带拿到天平工作台上，称重采集袋毛重，称重时应注意管子别掉到天平外面，以免称重不准确。
脐血重量=采血袋毛重-采血袋净重4计算应加入HESPAN的体积，按照HESPAN:脐带血=1:4加入HESPAN。
5把采血管热合掉（就是连接针头的那一根长管）。
6用托盘把采血袋和HESPAN放入生物安全柜，放入之前应用酒精喷洗一遍。
拿一只5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，抽取1ml的全血打入EP管中用于提取前细胞计数，然后再把针孔热合掉。
拿一只20ml的注射器从装HESPAN袋的黄色端口扎入抽取相应体积的HESPAN溶液，注入到采血袋中，并热合掉针孔。
想了解肠道菌检测的不同方法优劣点及价格三甲医院可以提供什么样的检测
想了解肠道菌检测的不同方法优劣点及价格三甲医院可以提供什么样的检测正好控叔写过科普什么是肠道菌检测顾名思义，就是采集样本对肠道中微生物（包括细菌，真菌和病毒）进行一次非常深度、系统和全面的检测。
假设我们每天排出一公斤的粑粑，有二两的“干货”都是肠道菌，所以粑粑中包含了肠道细菌全部的资料。
只要收集很少一点粑粑样本，经过分离提取DNA，上机测序和生物信息学分析后，就可以了解你肠子里到底住了哪些菌和他们的“菌口数量”大概是怎样。
与肠镜等体内检查完全不同的是，肠道菌检测没有任何痛感，不需要专程到医院，只需要在家中使用专业的采样管，1分钟内即可轻松完成对粑粑的取样，so easy。
为什么要测肠道菌？认识你的肠道君，为不盲目服用益生菌很多妈妈喜欢给孩子补充益生菌和益生元，认为益生菌就是对人体有益无害的好东西，惭愧的说几年前甚至我和丁妈也是这么认为的。
近一两年，国际上肠道菌研究突飞猛进，在跟进了一系列最前沿的科学文献后，我们认为很有必要提醒大家：不要盲目服用益生菌。
每个人的身体的情况差别很大，可能对大多数人有益处的菌，对少数人来说反而是致病菌。
比如下面两个最常见的菌，你一定不陌生，大家感受一下它的差别。
01乳酸杆菌就是能够发酵糖类并且产生乳酸的细菌，是典型的益生菌，最常见的就是存在于各类酸奶中。
如果体内乳酸杆菌数量大幅减少，就可能导致很多疾病的发生，此时补充一定量的乳酸菌，肠道生态又能很快恢复平衡。
但乳酸杆菌也不是一直扮演“好人”的角色，因为就在这个月发表的重磅研究表明，乳酸杆菌过量很可能是疾病的罪魁祸首【1】。
过量繁殖的乳酸杆菌会分泌大量乳酸，从而激活肠道NADPH氧化酶No某，生成巨量的活性氧（ROS）【2】。
活性氧的富集会加速肠道老化，在一些人体内引发剧烈的肠道黏膜损伤及肠干细胞的发育紊乱，从而导致结肠炎和肠道衰老【3，4】。
所以，即使如乳酸杆菌这样的良好市民，也并不是量越大越好。
02屎肠球菌这个听上去就“味儿很正”的细菌，其实就是“妈某爱”中的活性菌之一、而严格来说，肠球菌尚不能算在益生菌之列，应该是人体的共生菌。
干细胞治疗结肠炎
干细胞移植在炎症性肠病中的治疗摘要炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因未明的慢性肠道炎症性疾病, 包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD). IBD的病因仍不明确, 传统治疗主要是控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 常用药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素和免疫抑制剂等, 部分病例最终需手术治疗. 目前治疗IBD应针对多种发病机制, 采取综合性措施. 随着治疗研究的进一步发展出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗、干细胞移植, 使治愈IBD成为可能. 其中干细胞移植是一种新兴的IBD治疗方法, 近年来成为治疗研究领域的热点之一, 本文就干细胞移植治疗IBD的研究现状及作用机制进行概述.0 引言炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)病因未明, 发病机制复杂, 患者数量呈逐年增加趋势, 发达国家发病率高于发展中国家. 据调查, 10%-20%的患者中其家庭成员至少有1人患IBD[1,2], 患病时间超过10年者具有发生结肠癌的高风险率. 2003-2005年在一些发达国家(例如丹麦, 瑞典)的调查研究发现, 克罗恩病(Crohn's disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)每年发病率分别为8.6/10万、13.4/10万[3], 发病高峰年龄为10-40岁人群, 年轻患者较普遍; 同时, IBD首次发作也可见于任何年龄段, 15%的患者在确诊时年龄已超过60岁[1,2,4,5]. IBD病程迁延、反复发作, 多数患者因疼痛生活质量受到严重影响[6]. 近年来随着人们生活水平的不断提高IBD在我国的发病率也渐呈上升趋势, Lok等[2]对我国UC患者人口流行病学及临床学特征进行调查研究后发现, UC患者在我国正逐年增加并对年轻患者影响较大, 其中一部分呈严重暴发起病, 虽多数患者病情可为内科药物治疗所缓解, 但少数病例仍需手术治疗或者死亡. 由于IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 这使得广大学者寻求一种新的治疗途径, 其中干细胞移植给IBD的临床治疗带来了全新的思路, 干细胞移植可调节或重建患者免疫系统, 修复受损肠道黏膜并可恢复肠道黏膜正常功能, 拥有其他治疗方法无法替代的作用. 干细胞移植将有望成治愈IBD的重要方法, 本文就干细胞移植在IBD的治疗研究进展及作用机制方面作一综述.1 IBD的治疗研究现状目前, IBD的治疗主要着眼于控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 传统药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等. 上述药物对CD与UC的缓解率分别为70%和80%, 但临床疗效欠佳, 长期应用不良反应多, 难以维持长期缓解, 不能有效缩短IBD的自然病程, 对危重病例疗效有限, 存在停药后复发等问题. 与过去30年相比, 免疫抑制剂在IBD的治疗中使用更加频繁, 但并未有效降低CD的肠道并发症[7], 对患者长期的生活质量并没有明显改善. Lix等[8]研究发现, 随着时间的推移CD患者较UC患者具有较高的心理压力、焦虑情绪及病痛灾难感, 这些负面情绪可加重IBD的自然病程, 进一步降低患者的生活质量. 在手术治疗方面, 该疗法主要用于内科治疗无效、合并严重并发症及结肠炎癌变患者, 最终目的是挽救生命、改善患者健康状况, 但术后存在不同程度复发, 其中CD复发率很高. 随之, 在传统药物治疗的基础上出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗及干细胞移植等新的治疗方法. 在生物治疗方面, 最常使用新型生物制剂Infliximab作为IBD的治疗药物, 该药较多数传统药物起效迅速, 不良反应小, 研究表明Infliximab可有效治疗CD, 愈合瘘管提高患者生活质量[9-11], 对IBD的治疗具有积极作用, 但其临床效果明显时间仅持续2-4 mo, 部分治疗有效的患者可能出现急性肠梗阻, 对可产生Infliximab抗体的患者疗效较差, 在长期用药过程中部分患者可能会产生严重的不良反应[12-14]. 传统IBD的治疗目标主要是控制发作、维持缓解、预防复发、防治并发症及保证生活质量. 近年出现的新型治疗目标主要是早期控制发作、长期维持缓解、改变自然病程、使肠黏膜愈合并试图最终恢复肠道黏膜正常功能、甚至治愈疾病.2 干细胞移植与IBD的关系在诸多治疗IBD的研究中, 干细胞移植作为治疗IBD的新方法主要起源于对造血系统恶性肿瘤合并IBD患者进行干细胞移植后, 观察发现IBD病情在临床及内镜下得到了长期维持缓解, 再次启发了人们研究治疗IBD的新思路, 当前干细胞移植治疗IBD在实验动物研究和临床观察方面均取得了一定的进展.2.1 干细胞与肠黏膜损伤修复干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞. 成体干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞、肠道干细胞等. 肠道干细胞即肠道上皮干细胞, 位于肠道隐窝内, 越靠近肠隐窝基底部其增殖能力越强, 越近肠腔增殖能力越弱. 肠道上皮干细胞具有持续更新与分裂增殖能力, 能修复受损肠道黏膜并恢复正常功能, 对维持肠道黏膜的更新及内环境稳定发挥着重要作用, 近两年研究报道, 肠道上皮干细胞移植后可持续生长并稳定表达基因产物[15,16]. 在结合基因技术的基础上, 肠道干细胞可望作为基因载体细胞治疗肠道疾病. 采用干细胞移植治疗IBD造成的肠道黏膜损伤中, 最佳干细胞来源为肠道上皮干细胞, 但由于其数量来源有限, 在体外不能长期培养扩增, 因此可采用造血干细胞作为移植来源. 在干细胞中, 间充质干细胞是一种无造血功能的干细胞, 他有助于组织损伤的修复, 具有较高的可塑性及可移植性, 成人的任何器官组织中均存在该细胞, 在特定条件下间充质干细胞能诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种非造血组织细胞. 2007年Philipe在UC大鼠动物模型中进行骨髓间充质干细胞移植实验中, 发现这类干细胞能定居于受体的肠道上皮[17,18]. 具有正常功能的肠道组织能使炎症所导致的急性肠道损伤得以修复, 间充质干细胞在控制炎症活动、修复肠道黏膜、恢复肠壁完整中起着重要作用. 研究表明, 间充质干细胞可促进放射性损伤的肠上皮的修复[19,20]. 间充质干细胞在修复肠道损伤过程中, UC患者通常能恢复正常的肠道组织结构, 但CD患者则由于过度纤维化常导致肠腔狭窄和梗阻, 这与间充质干细胞持久增生、组织破坏和胶原纤维沉积有关. 目前, 间充质干细胞已成功应用于循环系统、骨关节病等自身免疫性疾病的治疗.2.2 干细胞移植的理论基础干细胞移植的实践与概念始于造血干细胞, 并被几十年的动物实验所支持, 在对患有血液系统疾病或恶性肿瘤的患者进行干细胞移植后发现他们原来患有的IBD得到了意想不到的缓解[21,22]. 目前, 干细胞移植在造血系统疾病方面应用较成熟, 在治疗自身免疫性疾病方面也得到了进一步发展. 自身免疫性疾病的治疗以提高宿主的免疫耐受性为重点, 而IBD患者对肠道共生菌的免疫耐受发生障碍, 这促使我们考虑从促进免疫细胞耐受性治疗入手, 改变IBD的自然病程. IBD是多基因病, 易感点位于第3、7、12、16号染色体上. 研究表明, 突变是IBD的易感因素, Hugot等[23]和Inohara等[24]在2001年报道了IBD的第1个易感基因NOD2/CARD15, 该基因主要存在于单核细胞、巨噬细胞、潘氏细胞、树突状细胞、肠道上皮细胞以及T、B淋巴细胞内[25-27], NOD2/CARD15编码的蛋白质仅在外周血单核细胞中表达, 其作用是介导细胞凋亡以及诱导核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的激活. NOD2/CARD15存在3个突变位点, 突变在IBD肠黏膜的严重损伤中具有重要作用, 使患者体内合成大量蛋白, 其蛋白表达可能在造血干细胞内. 因此, 通过造血干细胞移植可重建患者免疫系统从而达到治疗目的.在骨髓源性干细胞中含有多种干细胞组分, 具有多向分化能力, 可直接定居于肠道或与肠道干细胞融合并促进受损微循环的重建等多种机制修复黏膜、恢复正常的肠上皮功能, 也可能其中还参与了肠道的免疫调节, 研究证明骨髓干细胞移植能使IBD模型小鼠受损的肠黏膜组织微循环得以重建, 最终加速受损组织的修复[28], 骨髓干细胞可能成为肠上皮再生的可替代来源.3 干细胞移植治疗IBD的机制及临床试验研究3.1 造血干细胞移植在干细胞移植中造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)应用的较为普遍, HSCT指通过大剂量放、化疗或其他免疫抑制剂的预处理方法清除受体异常的造血和免疫系统, 阻断其发病机制, 然后将供者的造血干细胞移植入受体内, 以替代原有的病理性造血干细胞, 使受体质量建造血及免疫功能, 最终达到治疗目的. HSCT按造血干细胞的来源分为骨髓移植、外周血造血干细胞移植、脐带血干细胞移植和纯化CD34+细胞移植等. 据造血干细胞供者和受者关系及遗传背景分为自体移植、同基因移植和异基因移植. 在进行异基因HSCT时首先要经过移植前预处理, 要求受者和供者具有相匹配的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA)系统, 并有一定数量的造血干细胞作为前提. IBD肠道炎症的发生、发展和转归过程与肠道黏膜免疫系统密切相关. 在人体免疫调节中, T淋巴细胞是重要的免疫细胞, 分为辅助性T淋巴细胞(helper T cells,Th)、细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和调节性T淋巴细胞, 其中调节性T淋巴细胞对自身免疫调节起着重要作用[29], 主要使机体的自身免疫耐受与自身免疫反应维持平衡[6]; T淋巴细胞功能异常可导致多种疾病[30-32], 同时也是IBD发病的重要因素; IBD患者受累肠段能产生大量抗体, 当T淋巴细胞产生免疫应答时: Th1为主的免疫应答发展为CD, 此时促炎介质IL-2、INF-γ、TNF释放增加, 引起炎症反应或迟发型超敏反应; Th2为主的免疫应答发展为UC, 此时抗炎介质IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13释放增加, 从而增强体液免疫应答. 正常情况下, 肠道成纤维细胞可产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs), 其作用可降解细胞外基质阻止其大量沉积, 而活化的具有正常功能的T淋巴细胞可激活成纤维细胞产生MMPs[33], 研究表明, IBD病变肠黏膜中MMPs的表达均明显高于正常的肠黏膜, MMPs在IBD的发病机制中起着重要作用[34]. IBD肠道成纤维细胞与正常肠道成纤维细胞相比具有显著的增殖和胶原分泌能力, 这表明IBD患者肠道产生免疫反应时功能异常的T淋巴细胞激活成纤维细胞,使MMPs产生异常, 从而导致病程的进一步发展. 因此, 造血干细胞移植治疗IBD的可能机制为: (1)移植后的干细胞能参与IBD患者受损肠黏膜的修复, 取代肠黏膜中受损的细胞成分, 还可参与调节肠道内的免疫反应; (2)调节T淋巴细胞功能使肠道正常表达MMPs; (3)移植的前提是摧毁机体病态免疫, 在此基础上进行自体或异体HSCT, 可恢复正常免疫, 阻止了机体对自身组织的免疫攻击, 使IBD的免疫发病机制根除; 与此同时, 在干细胞动员及预处理时应用的超常剂量免疫抑制剂对IBD的治疗具协同作用. 针对IBD的发病机制采用HSCT, 当IBD患者接受HSCT治疗后全身免疫系统得以恢复正常、异常的T淋巴细胞会消失, 通过免疫系统重建可恢复全身正常的免疫反应, 从而治愈IBD.3.2 骨髓间充质干细胞移植骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 是骨髓基质细胞的前体细胞, 是由中胚层分化而来的一种具有多向分化潜能的非造血成体干细胞, 主要存在于骨髓, 可塑性很强, 在不同诱导条件下可分化为多种细胞[35-37], 诸如心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞等. BMSCs移植治疗IBD的可能机制为: 首先, 受损肠道对BMSCs可能有特异性趋化作用, 可释放趋化性细胞因子使BMSCs归巢, 对UC大鼠模型进行BMSCs 移植后发现, 迁移至受损结肠的BMSCs高于正常结肠[38]. 在修复消化系损伤过程中, BMSCs随损伤的加重迁移率增加, 恢复期则明显下降[39]. 研究还证实, 移植后的BMSCs能在大鼠UC模型的肠道中定位[40], 从而分化成具有一定功能的肠道上皮细胞, 可参与消化系损伤修复和功能重建[41], 与此同时BMSCs可抑制T、B淋巴细胞增殖, 降低树突状细胞抗原呈递作用以及改变自然杀伤(natural killer, NK)细胞的功能[42,43], 从而抑制肠道的异常免疫反应, 还可调节细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和 TNF-α[44]等的分泌, 进一步调节受损肠道的炎症反应; 其次, BMSCs还可参与受损肠道微环境的重建, 促进新生血管形成[45], 从而有利于肠道黏膜的修复过程; 最终达到治愈IBD的目的, 移植后重建的免疫系统功能替代了原有的导致肠道慢性炎症的异常的免疫系统功能. BMSCs移植后并发症少、骨髓采集安全方便、对机体损伤小, 易于分离、纯化和体外扩增, 不涉及伦理道德问题, 因此是干细胞移植治疗IBD的理想细胞.3.3 HSCT治疗IBD的临床试验研究 1993年, Drakos报道了第1例淋巴瘤合并CD患者在接受同种异体HSCT后其CD病情得到了改善. 随后, 至少有22例癌症合并CD患者在接受自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)后病情得到缓解, 其中19例移植后中位随访时间7年达长期缓解, 18例在中位随访时间超过20 mo后仍达到临床缓解, 18例中有2例同时服用传统药物[46]. 这表明在不服用任何药物的情况下AHSCT也能带来长期的临床缓解疗效, 这引起了人们极大的关注, 使IBD临床治疗方法出现了全新的思路. 2003年报道, 对2例Infliximab疗效较差的CD患者进行HSCT发现CD活动指数(Crohn's disease activity index, CDAI)完全正常[47]; 同时, Burt等[48]也作了报道; 在IBD的治疗中, 有两例关于AHSCT作为CD主要治疗方法的报道, 第1例来自于芝加哥的Ⅰ期临床试验, 包括12例活动性中重度CD患者, 在使用传统治疗和抗TNF-α单克隆抗体治疗无效情况下, 用环磷酰胺联合粒细胞集落刺激因子动员后采集外周血干细胞, 经CD34+纯化处理, 在移植前用环磷酰胺和抗胸腺球蛋白进行预处理, 结果发现出院时CDAI和CD症状均得到改善, 在随访7-37(中位时间为18.5) mo后发现影像学及内镜异常均逐渐改善, 其中11例获得维持缓解(CDAI≤150)[49]; 另1例报道来自米兰的Ⅰ-Ⅱ临床试验, Cassinotti等[50]对4例难治性CD患者进行自体造血干细胞移植后, 撤出所有传统治疗药物, 4例患者有3例经中位随访时间16.5 mo后临床和内镜评估达到了维持缓解; 在这2例报道中进行HSCT后均无患者死亡. 目前欧洲正进行Ⅲ期临床试验, 旨在调查大剂量免疫抑制剂加用AHSCT所带来的潜在临床疗效. 国外报道了1例出生后10 mo患有IBD合并CD3γ缺陷的患儿, 出生后2 mo时经常发生顽固性腹泻、反复肺部感染、口腔念珠菌病, 在进行严格的移植前准备后为该患儿进行第1次异基因HSCT, 并在5 mo后进行第2次移植, 在第2次移植后的第19天患儿由IBD导致的严重腹泻、肛周病变、直肠瘘得到了显著改善[51]. 国内报道, 2004年对5例复发性CD患者进行自体AHSCT治疗, 有4例缓解, 1例术后6 mo复发[52]. 所有这些相关报道在HSCT治疗IBD的进一步研究中给人们产生了巨大鼓舞.4 结论干细胞移植治疗IBD具有广阔的应用前景, 他可从遗传和免疫方面对IBD起到治疗作用, 能够改变IBD的自然病程、达到长期维持缓解、愈合受损肠道黏膜、恢复肠道正常功能并显著提高患者生活质量. 当前干细胞移植对IBD的治疗还处于试验性阶段, 主要用于对难治性CD试验性治疗的研究, 尚缺乏大量的临床资料, 有待于更多病例研究和长期随访. 随着干细胞移植技术的迅速发展, 成纤维细胞、骨髓细胞诱导成多能干细胞相继报道, 给干细胞移植治疗IBD的研究和应用打开了新的前景. 此外, 干细胞移植在基础和临床研究方向上仍存在着有待解决的问题, 如干细胞移植治疗最佳时机的选择; 移植适应证的选择; 合理的预处理方案; 自体移植物去除T淋巴细胞的利弊; 如何进行个体化治疗; 并发症的防治; 移植后激素减量的方法; 移植后免疫重建的研究; 干细胞移植后在体内的转化过程及机制; 如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的方向, 随着基础研究的深入和临床实践经验的不断积累, IBD患者有望得到彻底的治愈. 我们期待着干细胞移植能在IBD的治疗中得到广泛和有效的应用. 在未来的一段时间内, 随着技术的不断创新, 治疗经验的不断丰富, 会有越来越多的患者得到更好的救治, 重获健康. 干细胞移植治疗在IBD中的应用将仍是消化系疾病的研究热点, 相信不远的将来应用干细胞移植治疗IBD将会成为必然趋势.背景资料 IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 药物及手术治疗均不能获得满意疗效.同行评议者郁卫东, 副研究员, 北京大学人民医院临床分子生物学研究所/中心实验室研发前沿目前, 干细胞移植治疗IBD的研究主要集中于造血干细胞和骨髓间充质干细胞移植, 在基础和临床研究方面均取得了一定的进展, 但移植后免疫重建的研究、干细胞在体内的转化过程及机制、移植适应证的选择、个体化治疗方案、如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的关键.相关报道研究表明干细胞移植后可迁移至受损肠道参与损伤组织修复和功能重建, 并可恢复肠道正常的免疫功能, 国内外仍在进行临床研究探索.创新盘点本文就干细胞移植治疗IBD的研究进展进行综述, 并对其治疗的可能机制进行了概括总结.同行评价本文科学性较好, 综述全面, 为读者了解干细胞移植治疗炎症性肠病的研究进展奠定基础.。
大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究
（ 州医学院 浙江 温州 ３ ５ ２ ，１ 附属育 英儿童医院 外科 ； 生物 学实验教 学中心 ） 温 ２ ０７ ． ２．
胡
［ 摘
要］ 目的： 探索和建立大鼠肠神 经干 细胞分离与体 外培 养的方 法。方法 ： 取胎龄 ２ 的 ｓ ０ ｄ Ｄ大鼠肠道 ，
ｎ ｔ ｐ ｒｔ ｏ Ｅ Ｓ ｂ ｏｌ ｇｉ ａｌ ｈ ａ ｄ ｈｅ ａ ｓ ｆ Ｎ Ｃｓ ｉ ｏ ｃ ｃ ａ ａ ｅ ｗ ｅ ａｌ ａ ｅ ｒ ｃｔ ｒ ａｓ ｖ ｕ ｔ ｄ． Ｒ ｕ ｔｓ： Ｔ ｄ ｙｓ ａｔ ｒ。 ｃｈ ａ ｅｒ ｓ ｃ ｅｓ ｌ ｗｏ ａ ｌ ｅ ｒ ａ ｃｔ ｉ ｔｉ ｃ ｏ ｅ ｐ ｅ ｅ ｎ ｄ ｅ ， ｎ ｅ ｉ Ｌ ｓ ｗｅ ｅ ｅ ｎ ｙ ｄ ｙ １ ｗ ｃ ｘ ｒ ｓ ｅ ｓ ｉ ｏｌ ｎｉ ｓ ａ ｐ ａｒ ｄ ｉ ｍ ｉ ｅ ｍ ｅ ｔ ｒ ｃ Ｎ Ｂ ｒ ｓ ｅ ｂ ａ ０， ｈｉ ｈ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｎｅ ｔ ｎ； ｄｉ ｆ ｒ ｎ ｉ ｔ ｄ Ｎ Ｂ ｆ ｅ ｅ ｔ ａ ｅ Ｌ ｓ
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第３ ７卷 第 １期 ２０ ０ ７年 １月
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分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
肠道t细胞研究方法
肠道t细胞研究方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：肠道T细胞是一类生存在肠道的免疫细胞，主要起着免疫监视和保护作用。
研究肠道T细胞对于深入了解免疫系统在肠道中的作用和调节机制具有重要意义。
由于肠道T细胞数量少、分布广泛且功能复杂，对其研究存在一定的困难。
研究肠道T细胞的方法也日益多样化和精细化。
一、细胞分离与纯化肠道T细胞研究的第一步是将肠道组织中的T细胞分离、纯化出来。
常用的方法包括：1. 胶原酶消化法：将肠道组织经过消化处理，使细胞松解，再通过离心等操作得到T细胞。
2. 密度梯度离心法：利用不同质量的梯度溶液，使细胞按密度不同沉降，从而分离出T细胞。
3.磁珠分选法：利用表面标记的磁珠，结合特定的抗体，通过磁场把T细胞与其他细胞分开。
这些方法可以根据实验需求选择合适的方式进行T 细胞的分离和纯化。
二、表面标记与检测肠道T细胞的类型和功能不同，表面标记也不尽相同，因此必须通过特定的抗体对肠道T细胞进行检测和表征。
目前常用的表面标记包括CD3、CD4、CD8、CD45等多种标记，通过流式细胞术或免疫荧光染色技术可以对肠道T细胞进行标记和检测，进而分析其表型和功能。
三、功能评估了解肠道T细胞的功能状态是肠道T细胞研究的重要内容之一。
常用的方法包括：1. 流式细胞术：通过检测T细胞分泌的细胞因子（如IFN-γ、IL-17等）或使用功能性标记（如CD107a等）来评估其功能状态。
2. T淋巴细胞增殖试验：通过检测T细胞在特定刺激条件下的增殖能力来评估其功能。
四、免疫组织化学肠道T细胞不仅在肠黏膜中存在，还可能分布在淋巴结、脾脏等淋巴器官中。
通过免疫组织化学技术，可以对肠道T细胞在组织中的定位和表达情况进行研究。
这包括对组织切片的染色、显微镜观察等操作，可以直观地了解肠道T细胞在组织中的分布情况。
五、基因组和转录组分析现代生物技术的发展为肠道T细胞研究提供了更多的手段。
通过基因组和转录组分析，可以深入了解肠道T细胞的基因表达水平和转录调控机制，揭示其在肠道免疫调节中的作用和调控网络。
干细胞的分离和应用
干细胞的分离和应用干细胞是一种特殊的细胞，它可以随时分化成各种类型的细胞，为人类带来了巨大的生物医学和临床应用前景。
干细胞分离和应用是干细胞研究的重要内容，也是实现干细胞临床应用的先决条件。
干细胞分离是干细胞研究的关键步骤之一。
目前，分离干细胞的主要方法有三种：手工选取法、细胞排序法和负选择法。
手工选取法是最古老的分离方法，指的是在显微镜下用手工选取干细胞。
由于这种方法受技术水平和操作难度的限制，所选取的细胞也存在很大的不确定性，因此已经逐渐淘汰。
细胞排序法是一种可行性较高的干细胞分离方法。
具体步骤是将干细胞和非干细胞按照表面标志分别染色，然后将细胞流在细胞排序仪中进行分离。
这种方法可以比较准确地筛选出干细胞，但仍然存在一定的误差和侵袭性。
负选择法是目前最有效的干细胞分离方法之一。
该方法采用反向分离的原理，通过去除非干细胞而获得干细胞。
由于这种方法不依赖于细胞的表面标志，因此通用性较高，分离效率也较高。
干细胞的应用领域非常广泛，可以涉及到人体的多个系统和器官。
例如，干细胞可以用于再生医学，通过干细胞的分化和增殖来修复或替代受损组织和器官。
这种应用目前已经在临床中得到验证，取得了显著的治疗效果。
此外，干细胞还可以用于药物筛选和工业化生产。
干细胞具有高度的可塑性和繁殖能力，可以大量生产基因和生物药物，为药物研发和生产提供了重要的技术手段。
综合而言，干细胞的分离和应用是干细胞研究的重要方向。
不断深入研究干细胞的分子机制和生理功能，以及探寻更加安全有效的干细胞分离和应用方法，将有望为人类带来更多诸如再生医学、药物研发和工业化生产等领域的巨大贡献。
动物肠类器官培养技术
畜牧兽医学报 2023,54(7):2743-2750A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.008开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):动物肠类器官培养技术陈奡蕾,黄德如,安娅菲,李守军*(华南农业大学兽医学院,广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室,广州510642)摘 要:类器官被定义为三维(t h r e e -d i m e n s i o n a l ,3D )多细胞体外自组装组织结构,在细胞类型㊁结构和功能方面能模拟还原相应的体内器官,具有明显的组织特异性,可作为新型体外模型㊂随着技术的发展,肠类器官已被应用于器官发育㊁器官功能㊁器官修复与移植㊁疾病诊断和药物筛选等多个研究领域㊂目前除了小鼠肠类器官外,关于其他种属动物肠类器官培养的研究较少㊂但在临床中,其他动物,特别是家畜动物仍存在多种传染性或非传染性的肠道疾病,亟待新型的体外模型用于揭示致病机理或开发新的治疗方案㊂为此,本文对近十年动物肠类器官培养的研究进展进行综述,总结了动物肠类器官培养的优㊁缺点并对动物肠类器官培养进行了小结与展望,以期为动物肠类器官的培养提供参考㊂关键词:动物肠类器官;3D 培养中图分类号:Q 813.13 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-2743-08收稿日期:2022-11-28基金项目:广东大学生科技创新培育专项资金资助项目(p d j h 2021b 0083);广州市科学技术局的基础研究计划(S L 2022A 04J 01164)作者简介:陈奡蕾(1989-),女,广东广州人,博士,副教授,主要从事小动物疾病和马病研究,E -m a i l :c h e n o l a y@s c a u .e d u .c n *通信作者:李守军,主要从事动物临床重大疾病防治研究,E -m a i l :S h o u ju n l i @s c a u .e d u .c n A n i m a l I n t e s t i n a l O r ga n o i d s C u l t u r e C H E N A o l e i ,HU A N G D e r u ,A N Y a f e i ,L I S h o u ju n *(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y ,S o u t h C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,G u a n g d o n g P r o v i n c i a l K e yL a b o r a t o r y o f P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l fo r S e v e r e C l i n i c a l A n i m a l D i s e a s e s ,G u a n gz h o u 510642,C h i n a )A b s t r a c t :O r ga n o i d s a r e d e f i n e d a s t h r e e -d i m e n s i o n a l (3D )m u l t i c e l l u l a r s e l f -a s s e mb l e d t i s s u e s t r uc t u r e s i n v i t r o ,w h i c h c o u ld s i m u l a te c o r r e s p o n d i n g o r g a n s i n v i v o i n t e r m s of c e l l t y pe s ,s t r u c t u r a l a r c h i t e c t u r e a n df u n c t i o n .T h e y h a v e o b v i o u s t i s s u e s p e c i f i c i t y an d c a n b e u s e d a s a n o -v e l e x p e r i m e n t a l m o d e l i n v i t r o .W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f t e c h n o l o g y ,o r ga n o i d s h a v eb e e n a p p l i e d i n m a n y f i e l d s i nc l ud i n g o r g a n m o r p h o ge n e s i s ,o r g a nf u n c t i o n ,o rg a n r e pa i r a n d t r a n s -p l a n t a t i o n ,d i s e a s e d i a g n o s i s ,d r u g s s c r e e n i n g ,e t c .C u r r e n t l y,o t h e r t h a n m u r i n e i n t e s t i n a l o r -g a n o i d c u l t u r e ,o n l y f e w s t u d i e s o n a n i m a l i n t e s t i n a l o r g a n o i d c u l t u r e w e r e r e p o r t e d .H o w e v e r ,o t h e r a n i m a l s ,e s p e c i a l l y do m e s t i c a n i m a l s ,s t i l l s u f f e r f r o m i n f e c t i o u s a n d n o n -i n f e c t i o u s i n t e s t i -n a l d i s e a s e s t h a t u r g e n t l y n e e d a n e w s t u d y m o d e l f o r p a t h o g e n e s i s o r n e w t h e r a p y.T h e r e f o r e ,t h i s r e s e a r c h p r o g r e s s f o c u s e d o n a n i m a l i n t e s t i n a l o r ga n o i d s c u l t u r e i n t h e l a s t t e n y e a r s w i t h t h e a d v a n t a g e s a n d t h e d i s a d v a n t a g e s o f i t w e r eb e i n g s u mm a r i z e d .T h i s r e v i e w m a y p r o v i d e n e w i d e -a s f o r t h e r e l a t e d r e s e a rc h o f a n i m a l i n t e s t i n a l o r ga n o i d s .K e y wo r d s :a n i m a l i n t e s t i n a l o r g a n o i d ;3D c u l t u r e *C o r r e s p o n d i n g au t h o r :L I S h o u j u n ,E -m a i l :S h o u j u n l i @s c a u .e d u .c n畜牧兽医学报54卷肠类器官(i n t e s t i n a l o r g a n o i d)是由离体的干性细胞如成体干细胞(a d u l t s t e m c e l l s,A S C s)㊁胚胎干细胞(e m b r y o n i c s t e m c e l l s,E S C s)及其分化形成的多能干细胞(p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s,P S C s)㊁诱导性多能干细胞(i n d u c e d p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s,i P S C s)或肠隐窝(i n t e s t i n a l c r y p t s)组织,在基质胶(m a t r i g e l)和特殊生长因子的培养条件下,自发组织增殖和分化且表现明显肠组织特性的空心细胞团块[1]㊂它们高度折叠,呈肠纤毛和隐窝样(图1)㊂图1肠类器官模型F i g.1I n t e s t i n a l o r g a n o i d m o d e l2007年C l e v e r s研究组[2]利用小鼠体内试验证明了L g r5+上皮细胞属于肠道上皮干细胞㊂2009年该研究组成员S a t o等[3]在N a t u r e上展示了团队成功利用单一的L g r5+细胞培养出小肠绒毛状上皮结构㊂这些结构不但具有完整的肠道上皮结构特性,且含肠道内各种分化的功能细胞,包括肠上皮细胞㊁肠内分泌细胞㊁杯状细胞㊁潘氏细胞和L g r5+干细胞[3]㊂随后的多项研究也证明,离体的肠道干细胞和隐窝可以在3D培养条件下形成肠道类器官,也称为 迷你肠 (m i n i-g u t),它们能呈现源组织的典型功能[4-10]㊂目前报道培养人和小鼠的肠类器官的文献比较丰富,但伴侣动物和家畜动物的相关报道较少㊂然而伴侣动物和家畜动物仍存在很多传染性和非传染性的肠道疾病,需要新型的研究模型㊂为此,本文将综述动物肠类器官的培养进展,旨在为构建不同动物的肠类器官提供参考㊂1肠类器官的培养方法目前肠类器官的培养方法主要有两种:S a t o 等[3]在2009年发表的 浸泡培养法 (s u b m e r g e d m e t h o d)和W a n g等[11]在2015年发表的 气液双向培养法 (a i r-l i q u i d m e t h o d)㊂前者是将分离的样品与基质胶混合后,滴加到培养皿正中间使之呈圆滑的 水珠状 ,待基质胶凝固后加入含有特殊生长因子的类器官生长培养基并浸没样品基质胶混合物以实现3D培养;后者是利用T r a n s w e l l小室,在一个培养板中间放置一个底下可以允许生长培养基通过的滤膜皿,在滤膜皿底部先铺一层基质胶,再在上层加入基质胶和样品混合物,最后在培养板中加入完全类器官培养基,构建 大皿套小皿 的方式培养㊂这两种方法都可使肠A S C s在体外培养条件下自发分化成各种成熟细胞,并重现与源组织相同的结构和功能㊂前者单次培育的成熟类器官较少,而后者单次培育的类器官数量更多㊂除了在类器官培育数量上有区别外,更重要的是,后者的培养方式改变了小肠上皮细胞的极性,使单层上皮细胞的小肠绒毛面朝向培养液,便于进行小肠功能探索与评估或宿主与病毒关系的试验[6,12-13]㊂2不同动物的肠类器官培养2.1鼠肠类器官2009年,C l e v e r s团队[3]首次利用E N R培养条件,即利用富含表皮生长因子(E G F)㊁头蛋白(N o g-g i n)和W n t激活剂R-s p o n d i n-3的培养基成功构建鼠小肠类器官㊂2018年,W a n g等[14]从成年小鼠的黏膜下组织和固有层中分离出了肠神经胶质细胞(E G C s),B a g h d a d i和K i m[15]在W a n g等的研究基44727期陈奡蕾等:动物肠类器官培养技术础上将E N R培养基和从E G C s培养中分离的条件培养基相结合,发现该培养系统会显著促进鼠小肠新隐窝的形成,增强干细胞活性,该培养系统可以用于研究鼠小肠类器官和E G C s通过分泌因子产生的相互作用㊂尽管小鼠小肠类器官的培养条件已经相对成熟,构建长期稳定的小鼠结肠类器官仍存在培养条件上的挑战㊂为此,S a t o等[16]开始改良E N R培养条件㊂研究发现鼠小肠类器官可持续表达W n t信号,而结肠隐窝在培养开始不久后便失去W n t信号,他们推测结肠类器官缺乏W n t配体,因此不能长期维持结肠干细胞的稳定[16];该课题组在E N R 条件培养基中添加W n t-3A,结果发现结肠隐窝的培养效率增加了10倍,最终成功探索出小鼠结肠类器官的培养条件[16];此外,他们还发现新鲜分离的结肠隐窝上部完全成熟细胞会干扰肠类器官的生长[16]㊂将结肠隐窝轻度消化成小簇细胞再进行培养,会极大提高结肠类器官形成的效率㊂Y i l m a z等[17]发现潘氏细胞能够通过检测肠干细胞代谢状态来调节自身活动㊂S a t o等[18]研究发现无论是在小鼠的体内或体外,L g r5+干细胞的生长维持都与潘氏细胞有密切的联系㊂潘氏细胞能够表达E G F㊁W n t3㊁T G F-α等多种培养干细胞所必须的信号分子,将分选出的L g r5+干细胞与潘氏细胞共培养可显著提高肠类器官培养的成功率㊂2.2猪肠类器官2013年,G o n z a l e z-C o r d e r o等[19]从野生型约克夏仔猪中获取肠道组织,采用免疫荧光法及电镜首次鉴定了猪肠细胞谱系,包括肠道干/祖细胞系,吸收细胞系及分泌细胞系㊂同时,构建了猪肠类器官长期培养体系,成功培养和传代猪肠类器官,为利用猪作为转化医学的动物模型奠定基础[19]㊂为了更好地研究肠道上皮细胞的更新情况,T h o r n e团队[20]成功开发了 单层类器官 的培养方法,并证实 单层类器官 具有增殖和分化区,自我更新,组织极性及分化主要肠道细胞类型的特性㊂v a n d e r H e e 等[21]利用完全酶解法将类器官分离为多细胞系悬液,取代了用机械破碎法获得肠道隐窝或肠道干细胞㊂这样不仅能提高单层类器官培养效率还能减少机械分离对细胞的损伤㊂利用上述培养方法,L i 等[12]成功将3D猪肠类器官制成2D单层类器官,用于研究P E D V感染宿主肠道的致病机制㊂2020年,L i等[22]通过去除猪肠类器官培养系统中的基质胶并利用超低吸附培养板,使原本肠绒毛内置的猪肠类器官在悬浮培养时发生极性反转,培养出了绒毛外置的猪肠类器官,为研究猪肠道病原体与宿主的相互作用提供了适宜的模型㊂2.3犬肠类器官近年来,人们建立并不断探索犬肠类器官的改良培养方案以期提高培养效率[16]㊂P o w e l l和B e-h n k e[23]利用可分泌W n t3a㊁R-s p o n d i n-1和N o g g i n (WR N)的小鼠纤维原细胞系,构建了50%L-WR N (条件培养基),并证明了WR N是犬类器官生长所需要的因子㊂在该培养方案下,犬肠类器官能稳定传代40代以上㊂K r a m e r等[24]采取F u j i i团队[25]的经验策略,通过移除烟酰胺㊁p38-MA P K抑制剂㊁N2和E G F及增添I G F1及F G F2,调制出改良培养系统㊂该培养系统在促进细胞分化的同时还能保持肠道干细胞的增殖㊂此外,由于每个肠段都有特定的解剖结构和生理功能,研究者开始探索更精准的肠段类器官㊂C h a n d r a和同事们[26]在试验中分离健康犬和炎性肠炎病(I B D)及肠道肿瘤病犬的空肠㊁十二指肠㊁回肠组织和结肠,并在改良的人肠类器官培养基(WR N㊁R O C K抑制剂和G S K3β)中培养出了对应的类器官㊂研究发现I B D犬源的类器官和健康犬源的类器官在形态学上无明显差异,且都能稳定传代20代以上㊂与传统截取肠段组织不同,该研究利用内窥镜对不同肠段进行活检采样,所得样本均能顺利形成对应的类器官,扩大了犬肠类器官的供体来源㊂就犬隐窝分离方法而言,P o w e l l和C h a n d r a 团队使用的方法略有差异:前者使用胶原酶消化达到隐窝分离的效果,而后者使用E D T A螯合法[23,26]㊂从分离效果上来看,使用E D T A进行隐窝分离显著提高了隐窝上皮的纯度,并减少了其他细胞类型的污染[26]㊂哺乳类动物肠道干细胞的分离具有种属差异,消化试剂浓度和孵育时间与对应种属肠道绒毛的长度㊁数量和大小相关[3,26-27]㊂与人和小鼠的肠道类器官相似,犬L g r5+肠道干细胞主要集中在肠道类器官及空肠组织的隐窝区域[26]㊂犬肠道类器官与犬全层空肠组织的免疫组化对比结果显示,犬肠道类器官为上皮细胞群组成,不含潘氏细胞㊁间充质细胞及免疫细胞且犬肠道干细胞能分化成杯状细胞㊁小肠内分泌细胞及空肠组织[26]㊂这些细胞的类型及空间定位与源组织一致,证明犬肠道类器官能较好地还原源组织的结构和5472畜牧兽医学报54卷功能[28]㊂2.4猫肠类器官目前,仅有一例报道描述了猫肠类器官的培养,但培养的结果并不理想㊂P o w e l l和B e h n k e[23]利用L-WR N条件培养基养出猫肠类器官,但猫肠类器官在P10代次前后停止扩增,并在P13~P18代次前后开始出现生长停滞㊂与此同时,他们观察到了一种间充质样细胞类型在猫肠类器官生长出现停滞前数量减少且猫肠类器官表达的波形蛋白(V I M)比对照组多,提示这类细胞可能是猫肠类器官生长的必需成分㊂P o w e l l和B e h n k e[23]根据间充质/基质成分与肠隐窝共培养的要求,尝试了添加多种用于诱导人和小鼠的肠类器官生长或由隐窝间充质/基质细胞分泌的因子,但培养结果依然没有太大的改善,说明猫肠类器官的培养条件仍需要更多探索㊂2.5禽肠类器官目前,关于禽肠道类器官的报道较少㊂P i e r z c h a l s k a等[29]首次利用鸡胚的上皮组织成功建立禽肠道类器官,并发现前列腺素E2(P G E2)可替代WR N培养体系中的R-s p o n d i n1和N o g g i n而不影响类器官球的生长㊂与哺乳类动物的肠类器官不同,禽肠类器官较少出现出芽样的隐窝[29-30]㊂近期,Z h a o等[30]采用L-WR N条件培养基,利用鸡胚的小肠组织和肉鸡或蛋鸡的盲肠成功构建了可传代㊁可冻存的禽肠类器官,并用R T-P C R和W e s t e r n b l o t证实了禽小肠类器官不仅有干细胞还有成熟的分化细胞,包括上皮细胞㊁肠内分泌细胞㊁潘氏细胞和杯状细胞㊂而外源添加物的浓度和种类可改变禽肠类器官的数量㊁表面积和干细胞标记物的表达量[30-32]㊂为了提高构建禽肠类器官的可重复性,除了培养体系方面的改良,P a n e k等[33]还应用悬滴法培养以鸡胚为材料的禽肠类器官,不但提升了培养效率而且还降低实验成本㊂2.6反刍动物及草食动物的肠类器官由于反刍动物(牛㊁羊)及草食动物(马㊁兔)的饮食特性,其消化道进化为与之适应的特殊解剖结构㊂例如牛和羊具有四个胃,马和兔子的盲肠和结肠发达㊂尽管反刍动物及草食动物的肠道与人和小鼠的肠道不同,但利用改良的人或小鼠肠道类器官培养系统如L-WR N㊁B E M或商品化培养基I n t e s t i-C u l t T M仍能培养出相应的反刍动物及草食动物的3D肠类器官,而M u s s a r d等发现利用化学抑制剂的2K i培养基更适用于增殖兔肠类器官,而低浓度(5%)的L-WR N更适合诱导分化兔肠类器官[23,34-38]㊂3动物肠类器官的优点与缺点3.1优点动物肠类器官是功能介于2D细胞系模型和动物模型之间的体外模型㊂它既具有某些2D细胞系模型或活体动物模型的优势,又能弥补他们在某些研究上的不足㊂C a c o-2细胞单层模型是药物研究常用的2D细胞系模型,但该模型无法模拟肠道真实结构和肠道细胞间的互作[39-40]㊂而与广泛使用的癌细胞系和永生细胞系构建的2D单层细胞系模型不同,3D肠类器官模型能更好地再现细胞的结构和功能,以及原始组织的遗传和表观遗传特征,是更加真实可靠的模型[4,41-44]㊂与活体动物模型相比,类器官不仅能模拟疾病在体内发生和发展的情况,还能更容易地进行基因操作,使之更好地研究特定细胞之间的联系和形态结构[45-46]㊂除此以外,类器官培养所需的原代细胞来源广泛,可从外科切除的组织㊁活检样品和屠宰组织中获得,极高效地利用组织,减少使用活体动物,符合实验3R原则[26,47-49]㊂由于类器官能很好地反映样本个体特征,因此也可服务于病患个体的精准医疗[35,50]㊂3.2缺点和所有正在发展的技术一样,类器官培养技术也有其短板㊂肠类器官的3D培养体系所用的基质胶是来自小鼠的肉瘤,而这些动物来源的基质胶成分复杂,组分无法标准化,具有传播动物源病原的风险㊂此外,这种肿瘤源基质不能有效地模拟天然肠道的微环境㊂上述缺点可能会限制肠类器官广泛地应用在机制研究和临床试验中[50]㊂G j o r e v s k i等[51]首次提出人造水凝胶替代基质胶,但由于类器官生长的不同阶段需要不同硬度的细胞外基质,因此人造水凝胶的培养效果不如动物源基质胶㊂随后人们开始尝试不同的非肿瘤源生物基质胶,并发现其培养性质与基质胶相当,甚至更优,如蛋白㊁肠道细胞外间质水凝胶和去细胞化的猪消化道[52-54]㊂这些尝试为以后生产标准化基质胶提供了理论基础[54]㊂当前类器官主要指上皮源性的类器官㊂而这些类器官几乎只含干细胞/足细胞及其分化的特异性上皮细胞,不含有成纤维细胞㊁免疫细胞㊁血管细胞64727期陈奡蕾等:动物肠类器官培养技术等间基质细胞[26]㊂这限制了类器官技术在模拟炎症反应㊁免疫细胞调控机制和模拟体内微环境等方面的研究[50]㊂当试验需要更复杂,更接近生理的研究模型时,单个类器官或简单的共培养系统则不能满足此要求㊂为此,科学家开发了类器官芯片(o r-g a n o i d-o n-c h i p s),以更好地模拟生理微环境[55-56]㊂肠上皮细胞具分泌物质㊁消化大分子㊁吸收营养㊁抵抗病原体和自我更新的功能,其特殊细胞亚结构绒毛和微绒毛面向肠腔,具有极性[57]㊂研究肠类器官上皮细胞与其他物质或病原体之间的关系需要通过微注射方法[58]㊂这种高要求的操作技术限制了相关研究的发展㊂因此,探索培养绒毛外翻的肠类器官具有迫切性㊂2D类器官很好地解决了上述的难题㊂首先在培养皿中铺上基质胶薄层,待基质胶凝固后加入含基质胶的肠隐窝或肠干细胞与混合物,然后加入E N R培养液,即可构建出细胞基底面朝向基质胶,细胞顶端面朝向培养液的单层肠类器官[12,20-21,59]㊂此外,N a s h等[60]利用悬浮法培养建立了肠绒毛外翻的禽肠类器官㊂4小结与展望C l e v e r s实验室开创性地发现L g r5+干细胞标记物,自此引起了探索人和动物的肠类器官构建㊁鉴定与改良的热潮㊂得益于肠类器官的立体结构及细胞异质性等特性,人们对这种新型的㊁更好模拟体内肠道生理结构和功能的体外模型产生巨大需求㊂为此,研究者纷纷开始探索和改良的类器官培养体系,以期望提高肠类器官的培养效率并根据研究需要开发出不同肠段的肠类器官㊂目前的培养体系和培养技术能快速成熟地培养出人㊁小鼠和犬不同肠段的肠类器官㊂利用改良的人和鼠肠类器官培养体系,也能顺利培养出反刍动物和草食动物的肠类器官;然而相似的培养体系在猫肠道类器官中的培养效率却较低㊂相反,由于没有太多研究和文献报道,禽肠类器官的培养体系没有其他物种的肠类器官培养体系丰富,仍有待继续优化㊂无论是3D肠类器官抑或是2D单层肠类器官,这些研究平台都能高度还原源组织的表型和功能㊂因此在不久的将来,当类器官培养体系能更标准化时,结合如C R I S P R/C a s9基因编辑㊁细胞共培养㊁大数据和人工智能等技术,动物肠类器官能进一步服务于疾病诊断㊁药物筛选㊁器官修复或移植等研究领域,推动精准医学的发展㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] M E N E S E S A M C,S C HN E E B E R G E R K,K R U I TWA G E N H S,e t a l.I n t e s t i n a l o r g a n o i d s-c u r r e n t a nd f u t u re a p p 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小鼠肠道细胞提取完整版
小鼠肠道细胞提取 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】小鼠结肠固有层单个核细胞(LPMCs)提取及细胞表面染色1.成功麻醉小鼠后，取血并脱颈处死，取出结直肠肠道切成4 cm~5 cm每段，置于预冷的1×PBS中；2.镊子固定肠道组织一侧，去除排泄物，切除剩余的肠系膜脂肪组织和派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）；3.将结肠纵向剪开，用预冷的1×PBS清洗排泄物后，将肠道切成1 cm大小（可在Tube管内剪），2000 rpm离心5 分钟，弃上清；4.将组织收集到装有5 ml消化液的50 ml 离心管中，37oC培养箱中80转缓慢旋转孵育25分钟；（消化液的量由消化效果和组织数量决定）5.孵育过程中每10分钟震荡离心管20秒，孵育完成后，再强烈的涡旋震荡细胞悬液20秒，并用70 μm的细胞筛网过滤细胞至50 ml离心管中，收集细胞冰上放置（或加PBS终止反应）；6.收集细胞筛网中剩下的肠道组织至50 ml 离心管中，加5 ml 消化液。
37oC培养箱中60 g缓慢旋转孵育25分钟；重复第8-9步，将组织消化完全，直至在过滤器中不出现肉眼可见的粘连组织块(一般反复消化共3次即可)；7.将多次消化后的单细胞悬液合并在50 ml离心管中，3500 rpm离心5 分钟后弃上清；8.用FACS缓冲液（或PBS）重悬细胞沉淀，3500 rpm离心5分钟后弃上清；9. 6 ml 40% percoll重悬细胞沉淀，后用巴氏吸管将细胞悬液小心加入到含3 ml 80% percoll的15 ml离心管中（percoll的量：一般3只鼠对应1份percoll）；10.1000 g 20oC离心20分钟(升5降0)。
离心后，可见白色的LPMCs细胞层在两层分离液之间；11.用PBS洗一次，1800rpm，，离心，弃上清；12.1×PBS重悬细胞，计数。
肠道巨噬细胞的提取
肠道巨噬细胞的提取肠道巨噬细胞的提取是一个复杂的过程，下面将尽量清晰地为您分点阐述：一、实验准备实验动物：选择6-8周龄，体重在18-22克之间的健康小鼠，如昆明小鼠或SPF级小鼠。
实验材料：准备必要的实验器材，如注射器、细胞培养板、离心管等，以及实验试剂，如PBS缓冲液、RPMI-1640培养液、胎牛血清等。
二、提取步骤注射刺激物：向小鼠腹腔内注射3%巯基乙醇酸钠或其他刺激物，以积聚巨噬细胞。
注射量为每只小鼠2ml，注射后等待3天。
处死小鼠并消毒：采用脱颈方式处死小鼠，将小鼠置于无菌操作台上，用75%乙醇浸湿小鼠腹部皮肤3分钟进行消毒。
收集腹腔液：用无菌剪刀剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹膜。
然后用无菌巴氏吸管从腹腔开口深入腹腔，反复冲洗腹膜腔，灌洗液可回收约8ml。
离心与清洗：将收集到的灌洗液在常温条件下以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用PBS液洗涤细胞沉淀。
细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，然后将细胞接种到培养板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养3小时。
之后洗去未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞即为巨噬细胞。
巨噬细胞观察与计数：培养24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态。
使用0.5%胰酶消化细胞，离心并重悬细胞悬液，使用细胞计数板计数每个灌洗液中分离的巨噬细胞数量。
三、活性检测（可选）通过台盼蓝染色法检测巨噬细胞的活性。
将巨噬细胞与台盼蓝染液混合后静置一段时间，然后滴在载玻片上观察。
活细胞不会被染色，而死细胞则会被染成蓝色，从而区分活细胞和死细胞，并计算细胞活性。
请注意，以上步骤仅供参考，具体操作可能因实验条件和需求而有所不同。
在实际操作中，应严格遵循实验室安全规范和操作指南以确保实验的成功和安全。
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肠道干细胞分离方法
肠道干细胞是指存在于肠道上皮层基底膜下的一类具有自我更新与多向分化能力的干细胞。
研究肠道干细胞对于了解肠道组织发育、修复和肿瘤发生具有重要的意义。
在肠道干细胞研究领域，分离肠道干细胞是一项关键的技术，本文将介绍几种常用的肠道干细胞分离方法。
1.组织消化法：
该方法是通过消化肠道组织来分离肠道干细胞。
首先，将小鼠或人体肠道组织进行分离，并去除粘液和腺体组织。
然后，将组织切片并加入消化酶，比如胰蛋白酶和DNA酶等，将组织分解成单个细胞。
最后，通过离心将消化后的细胞分离成上清液和沉淀，上清液中含有肠道干细胞。
2.磁珠分离法：
该方法是利用特定的磁珠和抗体对肠道干细胞进行分离。
首先，将肠道组织分离并加入酶，消化组织为单个细胞。
然后，在单个细胞中加入特定的抗体-磁珠复合物，抗体能够结合肠道干细胞特定的表面标志物，如Lgr5、接着，将细胞溶液通过磁场，磁珠结合的肠道干细胞会被吸附在磁力架上。
最后，通过移除磁力架，可以将肠道干细胞从磁珠中分离出来。
3.流式细胞术：
该方法是通过细胞在流式细胞术仪中的特定性质进行分离。
首先，将肠道组织消化为单个细胞。
然后，使用特定的抗体标记肠道干细胞的表面标志物，如CD44、CD24和Epcam。
接着，将单个细胞溶液注入流式细胞术仪中，通过激光激发标记抗体，识别并分离出标记阳性的肠道干细胞。
4.聚集体培养法：
该方法是通过培养肠道组织形成三维聚集体，并从中分离出肠道干细胞。
首先，将肠道组织分离并切割成小块，然后进行体外培养。
在培养条
件下，肠道干细胞会自发地形成三维聚集体，称为小肠体外培养聚集体（intestinal organoids）。
最后，通过物理或酶解去除上清液中的肠道
干细胞。
这些是目前常用的几种肠道干细胞分离方法。
每种方法都有其优缺点，研究人员可以根据具体实验需求选择适合的方法。
肠道干细胞的分离方法
的进一步改进将有助于更好地研究肠道生物学和相关疾病的治疗。