从土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌1

从土壤中筛选产淀粉酶的菌株
(四川化工职业技术学院食品1131)
总述：查资料可知在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加淀粉溶液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

实验流程
待测数据：透明圈直径菌落直径
摘要：查资料可知枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此从四川化工职业技术学院的土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌株，利用五点取样采集土样，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

引言：芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。

早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。

从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。

1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。

工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。

据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29%，饲料酶占15%，一般的工业酶占56%。

枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%。

由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。

研究资
料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α2淀粉酶、纤维素酶、β2葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[4]。

枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50%[5]。

其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和Effront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。

1材料
1．1菌种来源：四川化工职业技术学院实训楼旁
1．2培养基：
淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、
牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。

1．3器皿：试管，量筒，移液管，培养皿，洗耳球，玻璃棒，酒精灯，接菌环，三角瓶等。

1．4仪器：高压蒸汽灭菌锅，电炉，恒温培养箱，摇床，天平等。

1．5其他：纱布，棉花，棉绳等。

2方法
2．菌种的筛选
2．1初筛：
2．1．1配制培养基：按照上述培养基成分及数量称取各物质，放入三角瓶中，加水到100ml，包扎。

和包扎好的试管、移液管、涂布器、培养皿等一起放如灭菌锅中120℃高压灭菌20min。

2．1．2倒平板: ：把培养基置于无菌工作台上，待冷却到55℃左右后，
倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。

2．1．3菌悬液制备:从三教后的树林中利用五点采样法采集土样，称取5g，放入装有 45mL无菌水的三角瓶中，震荡 20m in后静置 5m in
2．1．4浓度稀释：在无菌试验台上进行浓度梯度稀释,把土样摇匀，从中吸取1ml置于事先灭好菌的试管中，再加入9 ml无菌水，再从该试管中吸取1ml 土样置于另一只无菌试管中，加入9ml无菌水，依次稀释到10-6，待用。

2．1．5涂布平板：分别在10-4、10-5、10-6浓度下各取1 ml土壤稀释液倒入已冷却的平板中，用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。

把标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养 24 h 。

取出培养好的平皿，在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。

2．2复筛
2．2．1平板划线：用上述配制培养基和到平板的方法再制得培养基，用灭过菌的接菌环从上述培养皿中挑去菌落周围透明圈和菌落直径比值较大的菌落在新配置的培养基上进行划线分离，之后进行浓度标注。

将标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养 24 h。

2．2．2线面划线：继续用上述配制培养基的方法制得培养基，倒入试管后进行灭菌处理。

然后摆线面，等待冷却。

再取出上述平板，在加入淀粉溶液对其进行鉴定，继续挑取透明圈与菌落直径比值较大的菌落进行线面划线。

画好线后放入37 ℃培养箱中培养 24 h。

就可得到较纯的菌株，如有需要，可再重复上述步骤进一步纯化。

3结果和分析
细菌鉴定:
1、参照%伯杰细菌鉴定手册(第8版)[6],鉴定项目包括:形态观察、革兰氏染色、木糖产酸、V-P试验、乳糖产酸、麦芽糖产酸、蔗糖产酸、D-核糖产酸、淀粉水解等,
2、酶动力学参数检测配制pH值分别为5.7、6.4、6.6、7.0、7.5的缓冲溶液,在不同pH缓冲液中测定淀粉酶活性,确定最适pH;分别在30度、37度、40度、45度、50度条件下按淀粉酶活性的测定方法测酶活性,确定最适温度。

3、产酶条件优化分别用配置的碳源(淀粉)浓度梯度为0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和氮源(蛋白胨)浓度梯度为1.5%、2%、2.5%、3%而其它营养成分不变的LB 培养基对90号菌株进行恒温摇床培养,探究该菌株产酶的最适碳源和氮源。