10.3紫外可见分光光度法讲授版
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2013年7月19日星期五
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47-17
（三）多组分混合物的定量分析
理论依据：吸光系数加和性 混合物光谱常见的三种情况：
2013年7月19日星期五
上一内容
下ห้องสมุดไป่ตู้内容
47-18
计算策略
最大吸收波长处， A不重迭：按单一组分处理 最大吸收波长处， A有重叠：计算分光光度法
2013年7月19日星期五
2013年7月19日星期五
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47-8
二、定性分析
1、定性分析的依据
吸收光谱的形状 吸收峰的数目、位置（λmax） 吸收峰强度和吸收系数，εmax 特点：只是某些官能团的表征，不能反映分 子的整体结构，特征性不强。
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47-9
2013年7月19日星期五
2、定性分析的方法
d A d ε 3 = 3 •C •l dλ dλ
3 3
各阶导数信号与浓度成正比。定量依据 曲线斜率越大，灵敏度越高 导数阶数越增加，峰形越尖锐，分辨率越高
2013年7月19日星期五
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47-29
（3）导数光谱法对干扰吸收的消除
将干扰组分的干扰吸收表达为一个幂函数：
A干 = a0 + a 1 λ + a 2 λ + a 3 λ + … + a n λ
－
[ HA] p H ＋A －Ka = pH－lg － AHA A +[ A ]
＋ －
AHAa－A c HA [ H ] c HA K =εa pKHA =a + [H+－ε A－ (Ka + [ H + ] ) p H ] ＋lg K A－A
A
－
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47-16
2013年7月19日星期五
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47-11
（3）对比吸收光谱的一致性 制作试样的吸收曲线并与标准品紫外光谱 （或文献记载的标准图谱）对照：
醋酸可的松 醋酸氢化可的松 醋酸泼尼松 光谱特征几乎相同，但光谱曲线有差异
相同并非同一物，不同则一定不是同一物
2013年7月19日星期五
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47-12
三、纯度检查
醋酸可的松醋酸可的松醋酸氢化可的松醋酸氢化可的松醋酸泼尼松醋酸泼尼松光谱特征几乎相同但光谱曲线有差异光谱特征几乎相同但光谱曲线有差异相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物上一内容下一内容2013年12月27日星期五471311杂质检查杂质检查化合物无吸收杂质有吸收化合物无吸收杂质有吸收杂质有更强吸收吸光系数增大峰形可能会有杂质有更强吸收吸光系数增大峰形可能会有变化变化化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收吸光系化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收吸光系数降低
2013年7月19日星期五
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47-7
3、仪器测试条件的选择
仪器检查和校正，调 0，调100% 测定波长
首选最大吸收峰，次选次强峰或肩峰；避开溶剂 等干扰，需大于溶剂截止波长。
狭缝宽度
直接影响灵敏度、校正曲线的线性范围 不能太宽，不是越小越好。试样半峰宽的1/10
吸光度范围
降低信号噪音和暗噪音等因素的影响
上一内容
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47-19
1、解方程组法
前提：如果各组分均符合L-B定律
A A
a +b λ1 a +b λ2
= ε ca l + ε cb l
a λ1 b λ1
= ε ca l + ε cb l
a λ2 b λ2
解方程组可求得 ca 及cb
2013年7月19日星期五
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47-20
2013年7月19日星期五
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47-27
（1）导数光谱的波形和特点
高斯曲线模拟一个吸收峰，如右图 零阶光谱的极大在奇数阶导数中相 应于零，在偶数阶导数中相应于极 值。有助于吸收曲线峰值的精确确 定。 零阶光谱的拐点在奇数阶导数中产 生极值，在偶数阶导数中为零值。 利于肩峰的鉴别和分离。 导数阶增加，极值数目增加（导数 阶数+1）。谱带宽度变小，分辨力 增高，可分离和检测重叠的谱带。
2013年7月19日星期五
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47-33
（1）褶合光谱的基本原理和主要特点
基本原理:
Qij = Q
1% 1cm
·· cl
特点： 信息量大： 一条吸收光谱通过褶合变换可获得成百上 千条褶合光谱，形成独立的光谱体系。 同时包容导数光谱法和正交函数法，具二 者的优点和理论基础，实用价值更广泛。 提高了信噪比和分辨率，显露更多细微信 息和变化。
据 A =εcl 求 c
2、校正（标准）曲线法：
同台仪器固定工作状态和测定条件，测定一系列 标准溶液的A值，绘制A-c关系图。 可采用回归直线方程计算。
上一内容 下一内容
47-14
2013年7月19日星期五
3、标准对照法
在相同条件下配制标准溶液和试样溶液，在 同台仪器、同样条件下分别测定A值：
K' c x l
2013年7月19日星期五
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47-24
3、示差分光光度法
适用情况：试样中组份的吸光度A值很高或很低 时，克服其较大的相对误差。 测量原理：以一浓度略大或略小于待测试样组分 浓度的溶液作参比溶液，测得的吸光度实际为二 者之差ΔA：
Ax = εlc（待测物浓度） x As = εlcs （参比浓度） ΔA = Ax－As = εl ( c x－c s ) = εlΔc
上一内容
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47-30
导数光谱的特点
选择性及灵敏度均提高 定性优势：利用信号更 多更明显和易于辨认 定量优势：导数光谱法 能消除背景干扰、可分 离重叠谱带 导数光谱变异很灵敏， 导数光谱上的数值与浓 度比值无通用常数。故 需采取标准对比法。
数值计算法的前提及其局限性
理论上，测定的波长点数大等于组分数即可对多组 分混合物进行数值计算。但其前提条件是样品要满 足一定的理想条件： 各组分数据均符合L－B定律； 各组分吸收度符合加和性原则； 各组分之间相关性小； 各组分含量相差不大。 实际上，多数情况并不能完全满足这些条件，致使 计算结果出现偏差。为此，化学计量学的相关理论 需要不断发展。如褶合光谱法、计量置换理论等。
2 3
n
求一阶导数后：
A = a1 + 2a2 λ + 3a3 λ + … + nan λ
' λ 2
n-1
求n阶导数后：
dnA n = n! a n dλ
干扰背景随求导阶次的增加而逐步降幂 n阶导数后，干扰组分的n阶导数值为一常数，说 明：导数光谱法可有效消除共存组分的干扰吸收
2013年7月19日星期五
As Ecs l ； Ax＝Ec x l
As c s ＝ Ax c x
2013年7月19日星期五
Ax c x＝ c s As
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47-15
（二）定量分析的其他应用
1、弱酸（碱）的离解常数的测定
HA
HA
A = AHA＋AA－ = ε HA[ HA]＋ε A－ [ A ]
+
Ka [ HA] + [ A－] （ ）H ] · [ c == A－AA－
（1）对比UV吸收光谱特征数据
max 240 1nm
黄体酮 E
1% 1cm
408
上一内容
炔诺酮 E
下一内容
1% 1cm
571
47-10
2013年7月19日星期五
（2）对比吸光度（或吸光系数）的比值：
适于多峰
A1 E1Cl E1 A2 E2Cl E2
VB2
2013年7月19日星期五
2、双波长法
（1）等吸收双波长消去法
2013年7月19日星期五
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47-21
①等吸收双波长法的适用条件
干扰组分至少有一个完整的 吸收峰谷; 待测组分在两波长处吸光度 差值足够大，即⊿A待测» ; 0 ② 基本原理
在干扰组分吸收曲线上找出
两个等吸收波长，即 Ab1=Ab2，⊿A干扰＝0
2013年7月19日星期五
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47-28
（2）导数光谱定量原理
保持入射光强度 I0 在测定波长范围内恒定， 则据L-B定律，吸光度A 对波长λ的导数：
dA dε = •C •l dλ dλ
2 2
dε ( 波长一定， dλ为定值 )
d A d ε 2 = 2 •C •l dλ dλ
1、杂质检查
化合物无吸收，杂质有吸收 杂质有更强吸收，吸光系数增大、峰形可能会有 变化 化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收，吸光系 数降低；
2、杂质的限量检查
规定按一定方法测试其A值不超过某限度
2013年7月19日星期五
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47-13
四、定量分析方法
（一）单组分的定量方法
1、吸光系数法（绝对法）： 1% 查得吸光系数ε 或 E1cm ，测得A。
2013年7月19日星期五
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47-5
显色反应的条件： 酸碱度 显色剂用量 显色时间 显色温度 光、空气等其他环境条件
2013年7月19日星期五
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47-6
2、参比条件的选择
意义： 参比调100%T，消除背景吸收误差 溶剂参比：试样组成简单，共存组分少，显色剂 无吸收时采用。 试样参比：试样基体有吸收但不与显色剂反应时， 用不加显色剂的试样作参比。 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有 吸收时，用不含待测组分的试剂溶液作参比。 平行参比：用不含待测组分的试样与被测试样平 行处理的溶液作参比。
2013年7月19日星期五
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47-23
计算公式：令KAy2=Ay1
K 为掩蔽系数
干扰A和待测A值都放大K倍，⊿A加大，灵敏度增加 K：一般5～7倍，K过大，噪音被放大，S/N 减小
A2 = K ( Ax2 + Ay2）, A1 = Ax1 + Ay1
ΔA A2 A1 K(Ax2 Ay2 ) (Ax1 Ay1 ) KAx2－Ax1 ( KE x2－E x1 )c x l
2、配合平衡常数和配合物组成的测定
测定金属离子M-R络合剂不同比例溶液的A值， 以A对R/M作图测知其组成。
3、相对分子质量的测定
A=Ecl，Mr =εcl /A
4、氢键强度的测定
水中丙酮n→π*,λmax ΔE=452.96kJ/mol 己烷中丙酮 n→π*, λmax ΔE=429.40kJ/mol 丙酮在水中的氢键强度ΔE=452.96-429.40=23.56
第三节 UV-Vis 分光光度分析法
一、分析条件的选择 二、定性鉴别 三、纯度检查
四、定量分析 五、结构分析
2013年7月19日星期五
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47-1
一、分析条件的选择
意义：获得可靠分析数据的前提和保证！ 目的：方法最优化，高灵敏度和准确度。 包括：三方面
样品处理条件 参比选择条件 仪器测试条件
示差目的：使吸光度值读数处于正常范围
2013年7月19日星期五
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47-25
测定方法：
高浓度测定法 低浓度测定法 高精度测定法：医药学常量组分浓度测量
参比替代 消光片
2013年7月19日星期五
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47-26
3、导数光谱法
若将一个吸收光谱写作一个波长的函数： A=CE=C· f（λ） 该导函数的图像就是导数光谱。 导数光谱与吸收光谱（原函数）一样都是逐 点描绘的函数图像。 从原光谱数据中每隔一个波长小间隔（1－ 2nm），逐点计算出⊿A/⊿λ的值。将其对波 长描绘成图像就是一阶导数光谱。 导数光谱能给出更多的信息，用于鉴别、结 构分析和痕量分析。
2013年7月19日星期五
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47-2
1、样品处理条件的选择
（1）样品溶剂的选择 避免产生溶剂干扰，了解溶剂的UV截止波长 涉及光谱的精细结构，需考虑溶剂的极性
水 环己烷 正己烷 96%硫酸 乙醚 丙酮 200 200 220 210 210 330 甲醇 乙醇 正丁醇 异丙醇 甘油 205 215 210 210 230 二氯甲烷 四氯化碳 氯仿 苯 甲苯 乙酸乙酯 235 245 245 260 285 260
47-3
二硫化碳 385
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2013年7月19日星期五
1、样品处理条件的选择
（2）测试样品的性状 溶液浓度：保证吸光度范围适宜 样品纯度： 溶液酸碱性： 溶质粒径：真溶液，混浊液，乳浊液
2013年7月19日星期五
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47-4
（3）样品显色条件的选择
显色反应的要求： 有色产物的吸收系数足够大； 显色反应有较好的选择性； 有色产物与待测物定量关系确定； 有色产物组成恒定，有足够稳定性； 反应试剂的颜色无干扰；
A2 = A ＋A , A1 = A ＋A , A = A a a ΔA = A2－A1 = A2－A1 = ( E 2－E )c l
a 2 b 2 a 1 b 1 a b 2 a 1 a
2013年7月19日星期五
b 1
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47-22
（2）系数倍率法 适用情况：干扰组分无完整吸收峰
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2013年7月19日星期五
47-32
4、褶合光谱法 convolution spectrometry
褶合光谱法：以正交函数为基础的一种信号分 析方法。可使信号所包含的重要特征显现出来。 褶合曲线分析：采用褶合的数学模型将吸收曲 线转换成褶合曲线群，扩大不同组分对光吸收 的差异性和吸收曲线的细微变化，减少各组分 间的数学相关性，为定性和混合物定量提供了 更多可利用信息。 褶合变换（Convolution Transform，CT）被称 为数学显微镜
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47-17
（三）多组分混合物的定量分析
理论依据：吸光系数加和性 混合物光谱常见的三种情况：
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计算策略
最大吸收波长处， A不重迭：按单一组分处理 最大吸收波长处， A有重叠：计算分光光度法
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二、定性分析
1、定性分析的依据
吸收光谱的形状 吸收峰的数目、位置（λmax） 吸收峰强度和吸收系数，εmax 特点：只是某些官能团的表征，不能反映分 子的整体结构，特征性不强。
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2、定性分析的方法
d A d ε 3 = 3 •C •l dλ dλ
3 3
各阶导数信号与浓度成正比。定量依据 曲线斜率越大，灵敏度越高 导数阶数越增加，峰形越尖锐，分辨率越高
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（3）导数光谱法对干扰吸收的消除
将干扰组分的干扰吸收表达为一个幂函数：
A干 = a0 + a 1 λ + a 2 λ + a 3 λ + … + a n λ
－
[ HA] p H ＋A －Ka = pH－lg － AHA A +[ A ]
＋ －
AHAa－A c HA [ H ] c HA K =εa pKHA =a + [H+－ε A－ (Ka + [ H + ] ) p H ] ＋lg K A－A
A
－
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（3）对比吸收光谱的一致性 制作试样的吸收曲线并与标准品紫外光谱 （或文献记载的标准图谱）对照：
醋酸可的松 醋酸氢化可的松 醋酸泼尼松 光谱特征几乎相同，但光谱曲线有差异
相同并非同一物，不同则一定不是同一物
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三、纯度检查
醋酸可的松醋酸可的松醋酸氢化可的松醋酸氢化可的松醋酸泼尼松醋酸泼尼松光谱特征几乎相同但光谱曲线有差异光谱特征几乎相同但光谱曲线有差异相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物相同并非同一物不同则一定不是同一物上一内容下一内容2013年12月27日星期五471311杂质检查杂质检查化合物无吸收杂质有吸收化合物无吸收杂质有吸收杂质有更强吸收吸光系数增大峰形可能会有杂质有更强吸收吸光系数增大峰形可能会有变化变化化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收吸光系化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收吸光系数降低
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3、仪器测试条件的选择
仪器检查和校正，调 0，调100% 测定波长
首选最大吸收峰，次选次强峰或肩峰；避开溶剂 等干扰，需大于溶剂截止波长。
狭缝宽度
直接影响灵敏度、校正曲线的线性范围 不能太宽，不是越小越好。试样半峰宽的1/10
吸光度范围
降低信号噪音和暗噪音等因素的影响
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1、解方程组法
前提：如果各组分均符合L-B定律
A A
a +b λ1 a +b λ2
= ε ca l + ε cb l
a λ1 b λ1
= ε ca l + ε cb l
a λ2 b λ2
解方程组可求得 ca 及cb
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（1）导数光谱的波形和特点
高斯曲线模拟一个吸收峰，如右图 零阶光谱的极大在奇数阶导数中相 应于零，在偶数阶导数中相应于极 值。有助于吸收曲线峰值的精确确 定。 零阶光谱的拐点在奇数阶导数中产 生极值，在偶数阶导数中为零值。 利于肩峰的鉴别和分离。 导数阶增加，极值数目增加（导数 阶数+1）。谱带宽度变小，分辨力 增高，可分离和检测重叠的谱带。
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（1）褶合光谱的基本原理和主要特点
基本原理:
Qij = Q
1% 1cm
·· cl
特点： 信息量大： 一条吸收光谱通过褶合变换可获得成百上 千条褶合光谱，形成独立的光谱体系。 同时包容导数光谱法和正交函数法，具二 者的优点和理论基础，实用价值更广泛。 提高了信噪比和分辨率，显露更多细微信 息和变化。
据 A =εcl 求 c
2、校正（标准）曲线法：
同台仪器固定工作状态和测定条件，测定一系列 标准溶液的A值，绘制A-c关系图。 可采用回归直线方程计算。
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3、标准对照法
在相同条件下配制标准溶液和试样溶液，在 同台仪器、同样条件下分别测定A值：
K' c x l
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3、示差分光光度法
适用情况：试样中组份的吸光度A值很高或很低 时，克服其较大的相对误差。 测量原理：以一浓度略大或略小于待测试样组分 浓度的溶液作参比溶液，测得的吸光度实际为二 者之差ΔA：
Ax = εlc（待测物浓度） x As = εlcs （参比浓度） ΔA = Ax－As = εl ( c x－c s ) = εlΔc
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导数光谱的特点
选择性及灵敏度均提高 定性优势：利用信号更 多更明显和易于辨认 定量优势：导数光谱法 能消除背景干扰、可分 离重叠谱带 导数光谱变异很灵敏， 导数光谱上的数值与浓 度比值无通用常数。故 需采取标准对比法。
数值计算法的前提及其局限性
理论上，测定的波长点数大等于组分数即可对多组 分混合物进行数值计算。但其前提条件是样品要满 足一定的理想条件： 各组分数据均符合L－B定律； 各组分吸收度符合加和性原则； 各组分之间相关性小； 各组分含量相差不大。 实际上，多数情况并不能完全满足这些条件，致使 计算结果出现偏差。为此，化学计量学的相关理论 需要不断发展。如褶合光谱法、计量置换理论等。
2 3
n
求一阶导数后：
A = a1 + 2a2 λ + 3a3 λ + … + nan λ
' λ 2
n-1
求n阶导数后：
dnA n = n! a n dλ
干扰背景随求导阶次的增加而逐步降幂 n阶导数后，干扰组分的n阶导数值为一常数，说 明：导数光谱法可有效消除共存组分的干扰吸收
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As c s ＝ Ax c x
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（二）定量分析的其他应用
1、弱酸（碱）的离解常数的测定
HA
HA
A = AHA＋AA－ = ε HA[ HA]＋ε A－ [ A ]
+
Ka [ HA] + [ A－] （ ）H ] · [ c == A－AA－
（1）对比UV吸收光谱特征数据
max 240 1nm
黄体酮 E
1% 1cm
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571
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（2）对比吸光度（或吸光系数）的比值：
适于多峰
A1 E1Cl E1 A2 E2Cl E2
VB2
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2、双波长法
（1）等吸收双波长消去法
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①等吸收双波长法的适用条件
干扰组分至少有一个完整的 吸收峰谷; 待测组分在两波长处吸光度 差值足够大，即⊿A待测» ; 0 ② 基本原理
在干扰组分吸收曲线上找出
两个等吸收波长，即 Ab1=Ab2，⊿A干扰＝0
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（2）导数光谱定量原理
保持入射光强度 I0 在测定波长范围内恒定， 则据L-B定律，吸光度A 对波长λ的导数：
dA dε = •C •l dλ dλ
2 2
dε ( 波长一定， dλ为定值 )
d A d ε 2 = 2 •C •l dλ dλ
1、杂质检查
化合物无吸收，杂质有吸收 杂质有更强吸收，吸光系数增大、峰形可能会有 变化 化合物有强吸收而杂质无吸收或弱吸收，吸光系 数降低；
2、杂质的限量检查
规定按一定方法测试其A值不超过某限度
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四、定量分析方法
（一）单组分的定量方法
1、吸光系数法（绝对法）： 1% 查得吸光系数ε 或 E1cm ，测得A。
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显色反应的条件： 酸碱度 显色剂用量 显色时间 显色温度 光、空气等其他环境条件
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2、参比条件的选择
意义： 参比调100%T，消除背景吸收误差 溶剂参比：试样组成简单，共存组分少，显色剂 无吸收时采用。 试样参比：试样基体有吸收但不与显色剂反应时， 用不加显色剂的试样作参比。 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有 吸收时，用不含待测组分的试剂溶液作参比。 平行参比：用不含待测组分的试样与被测试样平 行处理的溶液作参比。
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计算公式：令KAy2=Ay1
K 为掩蔽系数
干扰A和待测A值都放大K倍，⊿A加大，灵敏度增加 K：一般5～7倍，K过大，噪音被放大，S/N 减小
A2 = K ( Ax2 + Ay2）, A1 = Ax1 + Ay1
ΔA A2 A1 K(Ax2 Ay2 ) (Ax1 Ay1 ) KAx2－Ax1 ( KE x2－E x1 )c x l
2、配合平衡常数和配合物组成的测定
测定金属离子M-R络合剂不同比例溶液的A值， 以A对R/M作图测知其组成。
3、相对分子质量的测定
A=Ecl，Mr =εcl /A
4、氢键强度的测定
水中丙酮n→π*,λmax ΔE=452.96kJ/mol 己烷中丙酮 n→π*, λmax ΔE=429.40kJ/mol 丙酮在水中的氢键强度ΔE=452.96-429.40=23.56
第三节 UV-Vis 分光光度分析法
一、分析条件的选择 二、定性鉴别 三、纯度检查
四、定量分析 五、结构分析
2013年7月19日星期五
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47-1
一、分析条件的选择
意义：获得可靠分析数据的前提和保证！ 目的：方法最优化，高灵敏度和准确度。 包括：三方面
样品处理条件 参比选择条件 仪器测试条件
示差目的：使吸光度值读数处于正常范围
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47-25
测定方法：
高浓度测定法 低浓度测定法 高精度测定法：医药学常量组分浓度测量
参比替代 消光片
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47-26
3、导数光谱法
若将一个吸收光谱写作一个波长的函数： A=CE=C· f（λ） 该导函数的图像就是导数光谱。 导数光谱与吸收光谱（原函数）一样都是逐 点描绘的函数图像。 从原光谱数据中每隔一个波长小间隔（1－ 2nm），逐点计算出⊿A/⊿λ的值。将其对波 长描绘成图像就是一阶导数光谱。 导数光谱能给出更多的信息，用于鉴别、结 构分析和痕量分析。
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47-2
1、样品处理条件的选择
（1）样品溶剂的选择 避免产生溶剂干扰，了解溶剂的UV截止波长 涉及光谱的精细结构，需考虑溶剂的极性
水 环己烷 正己烷 96%硫酸 乙醚 丙酮 200 200 220 210 210 330 甲醇 乙醇 正丁醇 异丙醇 甘油 205 215 210 210 230 二氯甲烷 四氯化碳 氯仿 苯 甲苯 乙酸乙酯 235 245 245 260 285 260
47-3
二硫化碳 385
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1、样品处理条件的选择
（2）测试样品的性状 溶液浓度：保证吸光度范围适宜 样品纯度： 溶液酸碱性： 溶质粒径：真溶液，混浊液，乳浊液
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47-4
（3）样品显色条件的选择
显色反应的要求： 有色产物的吸收系数足够大； 显色反应有较好的选择性； 有色产物与待测物定量关系确定； 有色产物组成恒定，有足够稳定性； 反应试剂的颜色无干扰；
A2 = A ＋A , A1 = A ＋A , A = A a a ΔA = A2－A1 = A2－A1 = ( E 2－E )c l
a 2 b 2 a 1 b 1 a b 2 a 1 a
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b 1
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47-22
（2）系数倍率法 适用情况：干扰组分无完整吸收峰
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47-32
4、褶合光谱法 convolution spectrometry
褶合光谱法：以正交函数为基础的一种信号分 析方法。可使信号所包含的重要特征显现出来。 褶合曲线分析：采用褶合的数学模型将吸收曲 线转换成褶合曲线群，扩大不同组分对光吸收 的差异性和吸收曲线的细微变化，减少各组分 间的数学相关性，为定性和混合物定量提供了 更多可利用信息。 褶合变换（Convolution Transform，CT）被称 为数学显微镜