电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳

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电泳技术
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第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术
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常见电泳技术
第二节
纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
梯度凝胶电泳等电聚焦电泳
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
印迹电泳毛细管电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE
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PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。

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1、聚丙烯酰胺凝胶的特点
①可用于分离不同分子量的生物大分子
聚丙烯酰胺凝胶的特
点
②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L
③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”
④电泳分离的重复性好
⑤透明度好，便于照相和复印
⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存
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⑦无紫外吸收
⑧可用作固定化酶的惰性载体
2、凝胶聚合的原理及有关特性
（1）聚合反应凝胶单体
丙烯酰胺
加速剂
四甲基乙二胺Acr
TEMED
交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis
催化剂
过硫酸铵(AP) 或核黄素
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（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系
T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= a
b
m
b
a
b
100
100
其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)
a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关
a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂
完全透明而又有弹性
C=6.5−0.3T
不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。

当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。

T为15%-20% 2%-5%
T为5%-10%
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a/b=40左右
a/b=125-200左右
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②凝胶浓度与孔径的关系
T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。

孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30 ％之间。

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低浓度的凝胶具有较大的孔径高浓度凝胶具有较小的孔径
③凝胶浓度与被分离物相对分子量的关系
分离胶浓度（%）
20～30
15～20
10～15
5～10
2～5
蛋白质相对分子量
< 10KD
10～40KD
40～100KD 100～500KD >500KD
3、影响凝胶聚合的因素
Acr及Bis 纯度
AP
核黄素TEMED
pH
分析纯；pH值为4.9-5.2；4℃避光贮存
聚合在40-60min完成
碱性条件下聚合较快，但碱性
过强时胶硬而脆
3、影响凝胶聚合的因素
温度氧分子
一般25-35℃聚合
凝胶先抽真空脱气，再加引发剂
4、PAGE原理
有无浓缩效应
连续系统电荷效应
分子筛
效应不连续系统
电荷效应分子筛效应浓缩效应
不连续体系
样品胶
浓缩胶
分离胶
样品胶T=3%,c=2%
，其中含有一定量的样品及pH6.7的Tris- HCl缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。

直接在样品液中加入等体积40%蔗糖。

浓缩胶
浓缩胶是样品胶的
延续，凝胶浓度及
pH值与样品胶完全
相同，其作用是使
样品进入分离胶前
，被浓缩成窄的区
带，从而提高分离
效果。

分离胶
分离胶的T=7.0%-
7.5%,c=2.5%，缓冲
液为pH8.9的 Tris-
HCl，大部分蛋白质
在此pH条件下带负
电荷。

此胶主要起分
子筛作用。

（1）样品浓缩效应
①缓冲体系离子成分及pH值的不连续性
②凝胶孔径的不连续性
③电位梯度的不连续性
电极缓冲液pH8.3 Gly- Gly-
sample ①缓冲体系离子成分及pH值的不连续性
HCl在任何pH溶液中均易
解离出(Cl-)，在电场中迁移率
Cl- 浓缩胶pH6.7 快，走在最前面称为
快离子。

甘氨酸pI=6.0，在pH8.3的Gly-
sample
Cl-
分离胶pH8.9 电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，，称为慢离子。

大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处
. ，被浓缩成为极窄的区带。

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sample ②凝胶孔径的不连续性
浓缩胶为大孔胶
在电场作用下，样
sample
分离胶为小孔胶品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。

因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

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sample
Cl- Cl- Cl- Cl- ③电位梯度的不连续性低电导区，使局部电
位梯度增高
sample
电泳开始后，快离子的快速
移动会在其后形成一个离子
强度很低的低电导区，使局
部电位梯度增高，将蛋白质
.
浓缩成狭窄的区带。

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（2）分子筛效应
大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。

蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。

这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者
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是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。

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（3）电荷效应
在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。

净电荷多，则迁移快；反之，则慢。

因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。

不连续PAGE原理总结
缓冲体系离子成分不连续性四个“不连续性”促“浓缩”
pH值的不连续性
电位梯度的不连续性凝胶孔径的不连续性
不连续PAGE原理总结
分子筛效应电荷效应
电荷效应
两个“效应”
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促“分离”
分子筛效应
连续PAGE
PAGE连续体系虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。

三、SDS－PAGE
1、原理
SDS-PAGE的基本原理与PAGE的原理相同，不同之处在于：
在SDS-PAGE中，样品介质和聚丙烯酰胺中添加了离子去污剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）和强还原剂（如巯基乙醇）。

蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子大小，而电荷电荷因素可以忽略。

（1）SDS
SDS即十二烷基磺酸钠，是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS总浓度、离子强度及温度有关。

断裂分子或分子间氢键阴离子去污剂
助溶剂分子去折叠
变性剂
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破坏蛋白质分子的二、三级结构
在单体浓度为0.5m mol/L以上时，蛋白质和SDS单体能结合成复合物；
当SDS单体浓度大于1m mol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4gSDS/g 蛋白质；
在低于0.5mmol/L浓
度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质。