细胞因子融合蛋白技术及其应用前景

细胞因子融合蛋白技术及其应用前景

房永祥, 冯海燕, 莫斯科, 景志忠

【关键词】细胞因子融合蛋白

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功能、高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反映及对各类免疫活性细胞的分化、发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是现今免疫学研究的一个热点方向。该方式是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一路, 其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具有的复合生物学功能, 乃至还可能会产生一些新的结构及生物学功能, 这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的进展前景。早在1986年Seno等用含EcoR I 的12个核苷酸(4肽)CCGGAATTCATG为接头, 将IFNγ和IL2片段加以连接, 结果发觉产生的融合蛋白具有IFNγ与IL2的双重活性。迄今为止, 国内外已接踵报导了多种有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融合蛋白技术的原那么、构建类型、应用现状和进展前景做一简要概述。

1 细胞因子蛋白融合技术

蛋白融合的构建原那么基因工程构建细胞因子融合蛋白须知足以下几个条件: (1)各融合分子的目的DNA片段置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)的操纵之下。

(2)融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Linker连接, 同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、氨基酸的组成、排列顺序等因素。如融合蛋白内部接头的不同, 可致使融合蛋白各部份化学结构的改变, 而阻碍到各融合分子的空间构象, 致使其生物学活性不同。因此, 设计肽链之间的接头时, 要尽可能不阻碍两头蛋白的自然折叠, 使各融合成份互不干扰。(3)为了保证融合蛋白的生物学活性, 还需考虑组成融合蛋白各成份本身的特性及其彼此作用机制。如肿瘤坏死因子(TNF)和α干扰素(IFNα)在抑制肿瘤细胞、增强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了TNF和IFNα的融合蛋白, 但发觉该融合蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TNF和IFNα相较, 抗病毒活性降低24倍, 抗肿瘤活性降低15倍, 与构建融合蛋白的初衷相背。分析缘故, 可能是这两种细胞因子的理化性质不同较大, IFNα活性稳固, 而TNF活性极易丧失, 其融合蛋白在必然程度上阻碍了彼此的活性。

蛋白融合Linker的设计与选择接头序列(Linker)设计是基因融合技术可否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序

列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达到为一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基酸称为Linker[1]。融合蛋白中的两种成份可否别离形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成份的接头序列紧密相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能阻碍目的蛋白各自的功能。因此, Linker序列的设计和选择对融合基因的构建相当重要。

针对Linker序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究要紧有两种, 即螺旋形式的Linker肽如[A(EAAAK)nA]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较普遍。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的情形下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的linker序列, 包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性linker 和葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发觉螺旋状的linker同柔性linker 及PA一样, 能够有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 乃至可增强融合蛋白的功能。Linker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。若是Linker 的长度太长, 那么使融合蛋白对蛋白酶比较灵敏, 致使活性融合蛋白在生产进程中的产量下降; 应用较短的Linker, 能够克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近致使蛋白功能的丧失。Linker的长度不该小于 nm , 这是由于相邻肽键的距离为 nm, 因此连接肽至少应包括10个氨基酸。目前最为经常使用

的是Huston设计合成的(GGGGS)3序列。研究发觉, 连接肽为(Gly4Ser)3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。因此, Linker 的长度不能太长也不能太短。

Linker的选择, 还应考虑Linker内部的氨基酸序列, 研究发觉, Linker组成相同但序列不同时, 构建的融合蛋白的稳固性存在显著不同; 编码Linker的核苷酸组成, 调整编码Linker的核苷酸组成, 虽不改变原接头Linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表达存在显著不同。Linker序列中有太多的α螺旋和β角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而阻碍融合蛋白的生物学活性。总之, Linker的选择不是一成不变的, 而要依照融合蛋白分子的大小和特性来决定。

2 细胞因子融合方式及其应用

依照细胞因子融合分子的不同, 可把细胞因子融合蛋白大致分成以下几类:

不同或相同细胞因子的融合蛋白细胞因子具有多功能性和通用性, 其作用的靶点各有不同。利用细胞因子的这一特点, 能够通过基因融合技术创制出更佳的细胞因子融合蛋白, 其融合基因表达产

物极可能表现出双因子简单配伍所没有的复合功能, 而且有可能会增强各个组份间的协同作用。

IL3和GM CSF均为造血刺激因子, 它们对不同发育时期的造血干细胞及祖细胞均具有促增殖和分化的作用, 且共用受体β链。鉴于二者功能互补, Curtis等于1991年构建并报导了第一个由不同细胞因子组成的融合蛋白人GM CSF/IL3和IL3/GM CSF融合蛋白, 别离称为PlXY321和PIXY344。为确保其各自的天然构象, 在GM CSF与 IL3二者之间均引入了一段疏水氨基酸序列, 从而保证其与受体的结合。体外受体结合实验证明, PIXY321与只表达IL3受体的JM1细胞株或只表达GM CSF的HL60细胞株结合时其亲和力比单体略高, 说明该融合蛋白可经IL3、 GM CSF结构域与其各自的受体结合。同时, PIXY321对AML193细胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明显高于单独利用IL3、GM CSF或IL3加GM CSF的作用, 其作用可提高5～10倍。

IL二、 IL6是两个具有多种免疫调剂活性的细胞因子。1992年Fernad等构建了两个人IL2/IL6融合基因, 目的在于构建表达一种具有双重功能的免疫调剂因子, 实验说明融合蛋白与野生型IL2的活性一致, 较IL6活性中度下降。显现此结果的缘故可能是由于局部构象的改变或是IL2与IL6之间的彼此作用干扰所致。体外进一步研究说明, 该融合蛋白既可诱导T、 B细胞表