胶质瘤IDH1基因突变检测及其临床应用策略

胶质瘤IDH1基因突变检测及其临床应用策略
黎相照;薛小磊;张中满;张颖芬;丁彦青;韩慧霞
【摘要】目的比较免疫组化EnVision法与高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting curve analysis,HRM)法在测定异柠檬酸脱氢酶-1(IDH1)基因突变中的优缺点,为临床IDH1基因突变的检测提供策略.方法运用免疫组化EnVision法和HRM法检测279例人胶质瘤及胶质神经元混合性肿瘤中IDH1基因突变.结果免疫组化检测结果:279例中有81例发生IDH1基因突变;HRM检测结果:275例中77例存在IDH1基因突变,4例因为DNA质量不佳导致检测无结果.免疫组化EnVision法和HRM法检测IDH1基因突变具有较好的一致性,差异无显著性(P =0.375).结论 IDH1基因突变主要发生在WHOⅡ～Ⅳ级的星形细胞、少突胶质细胞以及星形-少突胶质细胞瘤中;中国人IDH1基因突变率较国外低,原因有待进一步分析.IDH1-R132H抗体免疫组化检测IDH1基因突变的结果与HRM法检测结果具有高度的一致性,临床IDH1-R132检测首推免疫组化法,IDH1突变分子检测适用于免疫组化检测突变阴性的病例.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)007
【总页数】4页(P778-781)
【关键词】脑肿瘤;胶质瘤;IDH1;免疫组织化学;高分辨率熔解曲线分析法
【作者】黎相照;薛小磊;张中满;张颖芬;丁彦青;韩慧霞
【作者单位】南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系,广州510515;南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大
学基础医学院病理学系,广州510515;广州好芝生物科技有限公司,广州510515;广
州好芝生物科技有限公司,广州510515;南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系,广州510515;南方医科大学南方医院
病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系,广州510515
【正文语种】中文
【中图分类】R730.26
胶质瘤是脑组织最常发生的恶性肿瘤，占全部颅内肿瘤的40%～50%。

胶质瘤呈
侵袭性生长，手术后易复发，特别是高级别胶质瘤，预后差，生存期短，病死率高。

因此针对胶质瘤的发生、发展和预后的研究成为近年的热点。

2008年Parsons等[1]首次利用高通量测序技术在多形性胶质母细胞瘤中发现异柠檬酸脱氢酶-
1(IDH1)基因点突变，后续实验发现突变型胶质瘤患者相对于野生型胶质瘤患者具有良好的预后[2-4]。

2009年Yan等[5]发现IDH1突变不仅仅存在于WHO Ⅳ级
胶质母细胞瘤中，也广泛存在于WHO Ⅱ级、Ⅲ级的星形细胞瘤和少突胶质细胞
瘤中。

因此检测IDH1基因突变对于胶质瘤患者具有重要意义，已逐渐成为胶质瘤临床常规检测项目。

目前关于免疫组化检测IDH1基因突变准确度与分子检测一致性的报道不多，方法选择策略也未明确。

因此本文采用免疫组化EnVision法和高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting curve analysis, HRM)法检测胶质瘤中IDH1基因的突变，分析两种方法在检测中的差异及优缺点，希望为临床检测胶质瘤IDH1基因突变提供策略。

1.1 标本来源收集2012～2014年南方医科大学南方医院外科手术切除且经病理
确诊为胶质瘤及其它神经上皮性肿瘤标本279例，其中男性155例，女性124例，年龄3～85岁，中位年龄40岁。

病理分级依据WHO(2007)中枢神经系统肿瘤分类标准：WHO Ⅰ级38例，Ⅱ级99例，Ⅲ级54例，Ⅳ级88例。

1.2 试剂 IDH1-R132H抗体为鼠抗人单克隆抗体，购自德国DIANOVA公司，工作浓度为1 ∶50，免疫组化检测EnVision试剂盒购自DAKO公司；石蜡组织基
因组DNA提取试剂盒和人类IDH1-R132基因突变检测试剂盒由广州好芝公司提供，检测位点为IDH1基因第4外显子的R132密码子，包括R132H、R132C、
R132G、R132L、R132S和R132V共6种突变位点。

1.3 免疫组化免疫组化染色采用EnVision法。

常规石蜡包埋组织，3 μm厚切片，60 ℃烤片1 h，常规脱蜡脱水后用pH 6.0的柠檬酸盐作为抗原修复液，120 ℃高压修复3 min，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，IDH1抗体室温孵育1 h，DAKO K5007 EnVision二抗室温孵育0.5 h，DAB显色，苏木精复染，中性
树脂封固。

取经HRM法和免疫组化双重验证均为阳性的胶质瘤组织为阳性对照，取正常脑组织为阴性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。

免疫组化结果判定：IDH1抗体可特异性的检测脑肿瘤中IDH1基因R132H点突变。

IDH1表达于细胞质，以细胞胞质内有棕黄色或棕褐色颗粒判为阳性细胞；由两名病理医师采用双盲法阅片和双评分法进行评分，光镜下随机观察10个高倍视野，记录5个高倍视野中染色阳性细胞的百分率，以阳性细胞超过5%为IDH1突变阳性。

1.4 HRM法石蜡组织基因组DNA提取试剂盒提取各样本DNA，目的DNA扩增和HRM分析。

在进行样本检测时，每批标本同步设置野生型对照(对照Ⅰ)和突变型对照(对照Ⅱ)。

IDH1反应体系配制：PCR反应总体积为10 μl，包括检测反应
液Ⅰ 3.9 μl，荧光染料1 μl，DNA聚合酶0.1 μl，样本DNA或对照Ⅰ、对照Ⅱ 5 μl。

PCR反应和后续的HRM分析均在LightCycler 480荧光定量PCR仪上完成。

PCR及HRM反应参数：95 ℃预变性5 min；随后95 ℃变性15 s，64 ℃退火
30 s，共50个循环，PCR扩增完成后，进行变性和复性处理：95 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，之后40 ℃保温。

LightCycler 480仪器在70～95 ℃，以0.03 ℃/s的斜率
持续采集荧光信号，获得熔解曲线，结果经分析软件Gene Scanning自动分析归类，将样本分为野生组和突变组。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用免疫组化EnVision法和HRM法在测定IDH1基因突变中的差异和一致性采用配对χ2检验及Kappa
一致性检验。

P<0.05为差异有统计学意义；Kappa≥0.75两者一致性较好，
0.4≤Kappa<0.75两者一致性一般，Kappa<0.4两者一致性较差[6]。

2.1 免疫组化法检测IDH1基因突变 IDH1-R132H抗体表达定位于肿瘤细胞质，
胞质内有棕黄色或棕褐色颗粒判为突变阳性细胞，阳性病例表现为弥漫性强表达；约78%的阳性病例IDH1标记的阳性细胞占50%以上，呈弥漫性表达；约70%的IDH1基因突变病例阳性细胞着色较深，呈棕褐色为强阳性(图1、2)。

279例标本中81例有IDH1蛋白表达(表1)。

2.2 HRM法检测IDH1基因突变279例肿瘤标本中4例因为标本DNA质量不佳，PCR无扩增，导致检测无结果(这4例标本中1例胶质母细胞瘤免疫组化检测为阳性，另3例免疫组化检测为阴性)。

完成检测的275例标本中77例存在IDH1-
R132基因点突变(表1)。

2.3 免疫组化法与HRM法检测结果比较 275例同时完成免疫组化和HRM法检测IDH1基因突变的病例中270例检测结果一致，5例检测结果存在差异。

其中2例星形细胞瘤、1例间变型少突胶质细胞瘤和1例间变型少突星形细胞瘤免疫组化检测IDH1基因突变阳性，但HRM法检测结果为阴性；1例胶质母细胞瘤HRM法检测阳性但免疫组化法检测结果为阴性。

两者检测结果通过配对χ2检验比较，差异无统计学意义(P=0.375，表2)；通过Kappa一致性检验分析，表明两种检测方法的结果具有高度的一致性(Kappa=0.955)。

IDH是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，该酶依赖辅酶NAD或NADP
催化异柠檬酸氧化脱氢生成中间产物草酰琥珀酸，然后进一步氧化脱羧生成ɑ-酮
戊二酸(ɑ-KG)。

人类基因组含有5种IDH基因，编码3种不同的酶产物即IDH1、IDH2和IDH3，其中IDH1和IDH2是同源二聚体，均以烟酰胺腺嘌呤双核苷酸
磷酸盐(NADP+)为辅酶，所催化的反应是可逆反应[7]，无法通过变构效应进行调节；IDH3以四聚体的形式存在，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为辅酶[8]，所催化的反应是不可逆反应，具有变构调节的特性，是三羧酸循环中的关键酶。

IDH1基因位于染色体2q33，编码蛋白定位于胞质和过氧化物酶体[9]，IDH2和IDH3定位于线粒体中。

IDH1基因突变位点均位于IDH1基因第4外显子的R132位点，目前共报道6种类型，分别为R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V，其中
R132H最常见，密码子由CGT→CAT组成。

本组实验两种方法的检测结果显示，98.7%的IDH1基因突变发生在R132H位点，仅1例IDH1基因突变不在R132H 位点。

本实验结果显示，IDH1-R132基因突变主要发生在WHOⅡ～Ⅳ级的弥漫性星形
细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、间变型少突胶
质细胞瘤、间变型少突-星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，与国外报道[10-14]结果一致。

但突变率除了胶质母细胞瘤与国外报道一致外，其他类型胶质瘤中IDH1的基因突变率均较国外报道的突变率低，特别是间变型星形细胞瘤突变率仅有29.2%，远
低于国外报道的50%～80%[10-14]。

国内也有文献报道[15]间变型星形细胞瘤IDH1基因突变率低于国外报道，突变率为27.8%，与本组实验检测的突变率相近。

至于突变率偏低的原因，作者分析可能与中西方人种和地域的差异有关，是否与检测样本少以及诊断标准存在差异等有关需进一步观察。

29例WHOⅡ级室管膜瘤
和10例WHOⅠ级的胚胎发育不良性神经上皮肿瘤中各出现1例IDH1基因突变病例，而毛细胞星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、毛黏液型星形细胞瘤等其他类型肿瘤中均未发现IDH1基因突变。

1例IDH1基因突变的胚胎发育不良性
神经上皮肿瘤，经组织切片复核，发现伴有少突样胶质细胞和星形细胞增生活跃和异型性。

本实验结果显示，免疫组化法和HRM法的IDH1基因突变结果具有高度一致性(Kappa=0.955)。

HRM法具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，结果容易判读且准确，且可检测IDH1-R132H以外的其他突变类型。

但该方法对标本质量、实验室环境、设备和技术要求高，收费也较贵。

免疫组化法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展。

因此作者推荐免疫组化法作为临床工作中IDH1基因突变的首选检测方法。

本实验中有4例由于样本DNA质量不佳，无法进行DNA扩增导致HRM法检测无结果。

应用免疫组化法检测显示，3例IDH1基因突变阴性，1例IDH1基因突变阳性。

另有4例免疫组化法检测结果为IDH1基因突变阳性，但HRM法检测为阴性的病例，分析原因可能是由于标本固定不及时或其他原因导致DNA量少和质量不佳所致。

1例胶质母细胞瘤使用免疫组化法检测为IDH1突变阴性而HRM法检测为阳性，可能为免疫组化法检测的局限性造成，免疫组化法主要针对R132H 位点突变，而HRM法可以检测多种类型点突变。

综上所述，IDH1突变主要发生在WHOⅡ、Ⅲ和Ⅳ级的星形细胞、少突胶质细胞以及星形-少突胶质细胞混合的胶质瘤中，中国人IDH1基因突变率较国外低，原因尚待进一步观察和资料积累。

免疫组化法和HRM法检测IDH1基因突变的结果具有高度的一致性，推荐免疫组化法作为临床检测IDH1基因突变的首选方法，IDH1突变分子检测适用于免疫组化检测突变阴性的病例。

2南方医科大学基础医学院病理学系，广州 510515
韩慧霞，女，教授，硕士生导师，通讯作者。

E-mail：****************【相关文献】
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