UPLC-MSMS法同时测定黄芪-甘草药对8个有效成分

Vol. 36 No. 6Dec. 2222
第36卷第6期
哈尔滨商业大学学报(自然科学版)
2020 年 12 月
Journal of Harbin University of Commerce (Natural Sciences Edition )
UPLC-MS/MS 法同时测定黄5 -甘草药对8个有效成分
王晶萍2,董微微2,赫志强6,董林争2,赵丽珠2 *
(2.哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨150076 ； 2.鹤岗市检验检测中心，黑龙江鹤岗154122 ； 3.谱尼测试有限公司，哈尔滨150228)
摘 要：建立UPLC - M/M/方法同时测定黄C -甘草药对中毛蕊异黄酮葡萄糖P 、甘
草P 、芒柄花P 、甘草素、毛蕊异黄酮、黄CUP 、芒柄花素、甘草酸8种主要成分.采用 色谱柱为Acquity BEH C 18(54 mm x2. 3 mm ,1.3 p,m )柱，流动相为乙睛-体积分数2.
2%乙酸水溶液洗脱系统，流速为2. 3 mL • min -1,采用E/I 离子源，MRM 模式检测.结
果显示，所测8种主要成分在测定范围内线性关系良好，相关系数均大于2.999 2；精密 度、重复性和稳定性良好；平均加样回收率为96.63% -9964% ,RSD w3.48% .首次建
立可同时测定黄C -甘草药对中8种主要成分的UPLC - M/M/方法，该法操作简便，
灵敏度高，专属性好，分析速度快,为解析黄C -甘草药对的临床应用提供科学依据.
关键词：黄C;甘草;黄CUP;毛蕊异黄酮葡萄糖P;UPLC-MS/MS
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1672 -2946(2222)26 -2665 -26
Simultanerus determination of eighi active componentu in
Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix by UPLC - MS/MS
WANG Jing-ping 2, DONG Wei-wei 2, HE Zhi-qiang 6, DONG Lin-zheng 2, ZHAO Li-zhu 2*
(1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 154276, China ；. Inspection and Testing Center
of Hegang , Heeang 154122 , China ；. Pony Testing International Group , Harbin 154228 , China)
Abstraci ：To estatlisP a metiocl fos the simultayeoui deermindtioa of eight active compoaeei
(celycosin-P -glucosine , liquiritin , oyosin , liquiritihein , celycosin , astragalosine IV , form-
onoaetin , ang hycyrrbizinie acid ) in the Astragali Radix - Glycyrrhizae Radix herb pais. The eeermiatioii was pebormee cm aa Acyuity BEH C^ (54 mm x 2. 3 mm , 2.6 ^m ) , ang
the mobin pPasi was compose of 2. 2% aetie atn in wateb ang acetoaitale in aranieei elu- tioa ang at 2. 3 mL • min -2 flow rate. Mas spehomeeb with electrb spray ioaizatioa (ESI) soarce was opcdan in MRM moOe. All of the dglytes showd -ooS lineebty (M2. 9992 ) in
the testee ibnges. The precisios , reneatanility ang stdaility of the were gooS for the
收稿日期：2222 -22 - 26.
基金项目：黑龙江省属高等学校基本科研业务费科研项目(12XN254)；国家级大学生创新创业训练计划项目
(221812240214)；哈尔滨商业大学博士科研启动金项7(2219DS122);黑龙江省博士后基金(LBH-Z12166)
作者简介:王晶萍(1997 -),女,研究方向：中药质量标准.
通信作者:赵丽珠(1989 -),女,博士,讲师,研究方向：中药质量标准.
•666•哈尔滨商业大学学报（自然科学版）第36卷
eight components.The average recoveries were in the range of96.63%-99.95%with rela­
tive standard deviations(RSD)W3.48%.A simple,accoratn,and sensitive methoV was es-
taniisheC foe qranhtative analysis of8active compoeents in the Astragali Radix-Glycyrrhizae
Radix Oerd paid.These findings wili proviOe Oelpfai information foe the clinicoi anministra-
hoa of the Astagad Radix-Glycyrrhizae Radix herd pair.
Key words:Astraaad Radix；Glycyrrhizae Radix；Astragalosine IV;colycosin-7-glacosine;
UPLC一MS/MS
黄'为豆科植物蒙古黄'［Astraaalus tnembra-naceus（Fisco.）Bge.ver.mongholdys（E>ae.）Hsiao］或膜荚黄'［A*membranaceus（Fisch.）Bge；］的干燥根，具有补气升阳、生津养血、固表止汗、托毒生肌等功效，是我国最具代表的补气药物之一⑴.黄'配伍甘草（Glycyrraizae Radix,GR）,二者相须为用，可以大大提高二者间的协同作用⑵.黄'-甘草药对始载于《太平惠民和剂局方》，能补肺肾二气、调和脾胃表里脏腑、化津布液以滋益肾水、又能外固卫外而强曉理⑶.现代药理研究亦证明:黄'-甘草可治疗诸虚不足⑷、脾肺气虚、慢性乙型肝炎肝硬化⑷，酒精性肝纤维化及糖尿病［］等
黄'中黄'甲昔、毛蕊异黄酮葡萄糖昔，甘草中甘草酸、甘草昔为主要的药理活性成分［「9］，同时上述4种成分也是药典中收录的黄'或甘草药材质量控制指标成分）黄'甲昔具有抗炎、降压、抗癌、治疗代谢性疾病等作用［1°-12］，是黄'-甘草药对中最重要的活性成分之一•毛蕊异黄酮葡萄糖昔具有抗肿瘤、抗氧化活性、抗炎作用、保护血管内皮细胞,还可通过抑制Rho/ROCK通路、上调AKT通路，改善细胞凋亡和抑制炎症，从而保护内皮细胞］.甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗氧化、抗疫调节、抗病毒、抗癌、保肝和稳定细胞膜等作用［15-1?］;甘草昔具有抗抑郁、神经保护、对肝脏毒性的保护、对心脏系统的作用［5-15］）
与大量的药理活性相比，对黄'-甘草药对中主要活性成分的研究未见文献报道•丁淑芹等妙］灌胃给予昆明小鼠黄'-甘草药对水提液，发现其对环磷酰胺诱导的损伤具有保护作用，并可显著抑制增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率•此外，王迪等
的黄'-甘草药对、黄'、甘草均可提高小鼠细胞免疫功能，且黄'-甘草药对组的活性强于黄'组和甘草组•另有研究发现，黄'-甘草药对可使大鼠胆汁淤积性肝硬化程度显著减轻［］）基于此,本研究采用UPLC-M//MS法同时测定黄'-甘草药对中8种主要成分含量,以期为中药黄'-甘草药对的临床应用提供科学依据.
1仪器与材料
1.6仪器
Waters ACQUITY UPLC I-Class系统、Xeve TQS系统（美国Waters公司）;旋转蒸发仪（德国IKA公司）;AG-245电子分析天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；FW177中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；标准检验筛（66目，孔径°3°mm,绍兴上虞华丰五金仪器有限公司）；乙”和甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），乙酸（色谱纯,德国Merck公司）.
1.6材料
对照品毛蕊异黄酮葡萄糖昔（批号: U0520010）、甘草昔（批号：1240001°）、芒柄花昔（批号:G2299012）、甘草素（批号:T4890010）、毛蕊异黄酮（批号：34412012）、黄'甲昔（批号: T0922022）、芒柄花素（批号：Q4122012）、甘草酸（批号:3462）购于上海安谱有限公司.所有化合物经HPLC-DAD分析，纯度均大于98%.黄'购于内蒙古、贵州、河南、西、甘肃、黑龙江•甘草购于新疆、内蒙古、甘肃、西、陕西、黑龙江•样品标本保留在哈尔滨商业大学药学院中心实验室•经哈尔滨商业大学大学曲中原教授鉴定分别为豆科植物蒙古黄'Astragalas membranacees（Fisco.）Bge. vea.monga（/pas（Bge.）Hsiao的干燥根、豆科甘草属植物甘草Glycychizd araleesis Fisco.的干燥根及
第6期王晶萍,等:UPLC-MS/MS法同时测定黄'-甘草药对8个有效成分-666-
根茎.
2方法与结果
2.3色谱及质谱条件
色谱采用Waters ACQUIVY™UPLC系统检测.色谱柱:Acquity UPLC BEH C15(52mm x2.3mm, 2-9p n)柱；柱温26°C；流动相:体积分数2. 2%乙酸水溶液(A)-乙”(B),梯度洗脱；洗脱程序：0~2.9min22%B,2.9~6.9min22%~66%B,6.9~9.2min66%~99%B,9.9~9.2min99% ~22%B,9.1~12.9min22%B；流速：0.3mL-mm-1；自动进样;样品室温度：22C；进样量：2pL.
质谱条件：电喷雾离子源(ESI源)，多反应监测模式(MRM)检测,源温度和脱溶剂气温度分别为254C和502C,脱溶剂气为氮气,流速为2002 L-h-1,碰撞气为氮气,毛细管电压为3.9kV.8个分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压等信息见表2-
表18种分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压和碰撞能量化合物保留时间/min母离子/(m•a"1)子离子/(m•a_1)锥孔电压/V碰撞能量/eV电离方式毛蕊异黄酮葡萄糖X 2.99446.2285.9*/276.92022/44ES)+甘草X 2.33426.3255.2*/135.95222/28ESI-芒柄花X 3.56432.9269.2*/291.32022/16ESI+甘草素 4.22255.3119.2*/135.22522/22ES-毛蕊异黄酮 4.35285.9415.2*/272.92033/28ES+黄_'X 5.42826.3626.2*/223.26246/55ES+芒柄花素 5.36266.9252.9*/243.41224/35ES-甘草酸 6.22542.4352.2*/113.22055/66ES-注：*定量离子
2.9供试品溶液的制备
黄'、甘草药材干燥24h,打粉,过62目筛,按6：1比例分别称取干燥的黄'、甘草粉末共计12--置542mL圆底烧瓶中,加水202mL,浸泡12h后，加热回流提取2h,提取3次,3542r/min离心12 min,吸取上清液,合并上清液并旋干.精密称取黄'-甘草提取物12mg-用适量12%甲醇-水溶解,经2.22pm滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液[22]-
2.3对照品溶液的制备
分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花、量42mL量中醇并稀释至刻度，摇匀•配成质量浓度分别为2-9mg•mL-的储备液，置于8C冰箱中储存.
2.9方法学考察
2.9.3专属性考察
分别取对照品、供试品溶液,按“2.2”项色谱条件进行分析,各化合物之间无干扰,方法专属性良好.
2.9.9线性关系考察
精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花素、甘草酸标准系列溶液,配制成相当于毛蕊异黄酮葡萄糖昔质量浓度为2.92、2.22、0.94、2.12和2.92p •mL-1,甘草昔质量浓度为2.22、0.22、0.25、2.32和2.22p g•mL-，芒柄花昔质量浓度为4.42、4.
44、4.48、4.12和2.22pg•mL-,甘草素质量浓度为4.41、4.42、4.45、4.32和2.22pg•mL-,毛蕊异黄酮质量浓度为2.22、2.24、2.28、2.12和2.22 p g•mL'1，黄'甲昔质量浓度为2.26、2.32、2.38、2.24和2.30pg•mL-1,芒柄花素质量浓度为2.
22、2.22、2.25、2.32和2.22p g•mL'1,甘草酸质量浓度为2-02、2.02、5.02、12.2和22.2p g•mL-1，按色谱条件进样分析.以对照品峰面积为纵坐标(门，质量浓度(pg/mL)为横坐标(X ),绘制
• 668 •
哈尔滨商业大学学报(自然科学版)第36卷
标准工作曲线.各指标成分在测定浓度范围内，线 信噪比(S/N) M 3确定检出限(LOD ) ,S/NM2确
性关系良好，结果见表2.以特征离子对色谱峰的
定定量限(LOQ ),结果见表2.
表2 8种分析物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限
化合物
回归方程r
线性范围/( [JLg • mL -2) LOD/ ( n- • mL -2) LOQ/(n •
毛蕊异黄酮葡萄糖X
Y 二50 208. 3X + 28. 4
09993
0.42 〜0. 40
0. 4
2. 5甘草X
Y 二 22 952
X + 25. 4
0. 999 2
0. 42 〜0.22．2 2. 5芒柄花X Y 二 95 608X + ⑵」0. 999 20. 02 〜0. 40
．3
2. 0甘草素
Y 二 2 89
X + 127. 20. 999 40. 02 〜0. 40 2.43毛蕊异黄酮
Y 二 63 023
X - 97-. 5
0. 999 30. 02 〜0. 40 2.43
黄_'X Y 二 4 405. IX + 30. 4
0. 999 40. 06 〜0. 402
．
6
芒柄花素Y
二 45 545
X + 644. 9
0. 999 7
0. 0 2 〜0. 40
．3
2. 0甘草酸
Y 二4 152 4X - 730. 4
0.999 5
2.60 〜20 . 6
2
152
2.6.3精密度精密吸取同一份对照品溶液2 ^L,按“29”项
色谱条件连续测定2次，结果显示:毛蕊异黄酮葡 萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄 董甲昔、芒柄花素、甘草酸RSD 在0.68% -3.62%
之间,表明仪器精密度良好.
2.6.6重复性
以黄'-甘草药对提取物进行重复性考察，按
照上述供试品制备方法，平行制备黄'-甘草样品
6份，进样2
，依法测定,记录峰面积，结果显示:
毛蕊异黄酮葡萄糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、 毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄花素、甘草酸RSD 分
别为 0. 92%、. 83%、. 69%、2. 37%、. 32%、0.
82%、2. 49% ,2.65%，表明方法重复性良好.2.6.6稳定性
取黄'-甘草药对提取物供试品溶液，分别于
室温下0、4、8、12、24、48 h,进样2 ^L,依法测定，
记 峰面积， 结果显示:
黄
、昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄'甲昔、芒柄
花素、甘草酸RSD 在0.62% -2.64%之间,表明供
.8e 稳定6
2.6.6加样回收率
取批号为120662的黄' -甘草药对样品6
份,每份约0-12 g,精密加入2种对照品，按照上述
供试品制备方法，平行制备黄'-甘草样品6份,
进样2 ^L,依法测定,结果显示:毛蕊异黄酮葡萄
糖昔、甘草昔、芒柄花昔、甘草素、毛蕊异黄酮、黄' 甲昔、芒柄花素、甘草酸平均加样回收率分别为
99. 62%、98. 62%、98. 12%、97. 23%、96. 63%、98.
60%、98.44%、98.15%.2.5样品测定
精密称取黄'-甘草药对，按“2. 2”项下方法 制备样品溶液，每个样本平行3份，按“2. 2项下
色条件进行测定，色谱图见图2
2.6结果
6批黄'-甘草药对药材，按“2. 2”项下方法
制备样品溶液，精密吸取2咲进样UPLC - MS/
MS 进行分析,测定结果见表3.
表3黄5 -甘草药对中含8种成分的量(mg - g-1)
批次
毛蕊异黄酮葡萄糖X
甘草X
芒柄花X
甘草素
毛蕊异黄酮
黄_'X
芒柄花素
甘草酸
1006020.642 5
5.122 70604 70.349 2
0.095 20.005 70.042 677.221000020.675 6 4.575 7
0.409 9
0.301 20.122 40.057 30.057 975.92
100606
0.277 8 3.602 00.503 80.437 90.122 90.029 70.127 934.82
1006040.606 6
4.282 4
0.695 70.377 80.072 8
0.049 2
0.123 5
09.74200602
0.665 7 2.672 00.969 40.770 8
0.129 20.053 20.099 7
104.0
2006060.360 3
6.953 8
0.477 4
0.523 80.040 70.023 8
0.668 093.55
第6期王晶萍,等:UPLC- MS/MS 法同时测定黄' -甘草药对8个有效成分• 669 •
100%
°0 2.0 4.0 6.0
8.0 10.0
r/min
447.03 > 270.05
100%
417.1 >135.06431.03 >197.11
■ L
2.0(B)甘草昔
(A)毛蕊异黄酮葡萄糖昔
100%
285.03 > 270.04
255.07 > 135.06
8.0 10.0
r/min (D)甘草素
% 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
4.0 6.0
8.0 10.0
r/min
100%
r/min
CD 黄区罠甲昔
100%
4.0 6.0r/min
4.0 6.0 8.0 10.0
r/min (C)芒炳花昔
图1黄5-甘草中8种分析物的UPLC-MS/MS 色谱图
821.22 > 113.07
3讨论
本文考察了不同流动相系统，包括乙睛-水、
甲醇-水、乙睛-0.1%甲酸水溶液、乙睛-0.1% 乙酸水溶液、乙睛- 1 mmol/mL 乙酸钱水溶液、甲
醇-0. 3%甲酸水溶液，结果表明，乙睛-0. 1%乙 酸水系统洗脱时，待测分析物灵敏度较高、色谱峰
峰形、分离度、基线噪音均能达到较好的洗脱效果,
故本实验最终采用乙睛-0. 3%乙酸水溶液作为流
动相系统.3种待测组分分别以质量浓度0. 54mg/
L 和2.0从!^!^的流速直接用注射泵进行优化,
标准溶液通过流动相注入离子源中，在正离子或负
离子模式下得到准分子离子峰,再对准分子离子峰
进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子
信息，对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使每 种组分的准分子离子产生的特征碎片离子强度达
到最大;标准溶液由UPLC 进样，再对离子源温度、
脱溶剂气温度、脱溶剂气流量等进行优化•选择两
对离子对，其中干扰小、信噪比大的离子对作为定
量离子对•设定合适的峰驻留时间(dwell time)确
保色谱峰的采样点数在1〜20点,从而得到较好 的定量重复性,优化得到的质谱参数•
黄酮和皂苜类化合物是黄'-甘草药对的主 要活性成分,因皂苜类化合物无紫外吸收或有微弱
的紫外吸收，故用DAD 检测器无法同时测定黄酮
和皂苜类化合物.所以本文首次建立UPLC - MS/
MS 法同时测定黄' -甘草药对中毛蕊异黄酮葡
萄糖苜、2
2 2 、毛蕊异黄酮、黄
'
2
、2
8种有效成分含量的方
法,多指标控制黄'和甘草药材提供参考.
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