Clusterin在UUO大鼠模型中的表达及诊断意义

Clusterin在UUO大鼠模型中的表达及诊断意义
黄秀英;耿嘉男;刘凯;陈艳芳;刘畅;雷冬艳;于晓艳;孙波
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2014(000)010
【总页数】2页(P1601-1602)
【作者】黄秀英;耿嘉男;刘凯;陈艳芳;刘畅;雷冬艳;于晓艳;孙波
【作者单位】吉林大学第一医院，吉林长春 130021;吉林大学药学院，吉林长春130021;吉林大学药学院，吉林长春 130021;吉林大学药学院，吉林长春130021;吉林大学药学院，吉林长春 130021;吉林大学药学院，吉林长春130021;吉林大学药学院，吉林长春 130021;吉林大学药学院，吉林长春130021
【正文语种】中文
Clusterin被发现与许多肾脏损伤有关，在肾缺血再灌注损伤、有明显排斥反应的
肾移植患者以及一些药物导致的急性肾损伤中Clusterin表达均有上调［1］，可
作为肾损伤的分子生物标志物。

单侧输尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）能直接导致肾间质炎症和纤维化等多样性病理学改变，而Clusterin的表
达与UUO造成早期肾损伤的关系尚未见详细报道，本实验拟通过大鼠单侧输尿管结扎建立急性肾损伤模型，探讨Clusterin在早期肾损伤中的变化，观察Clusterin在UUO大鼠肾组织中和尿液中表达情况，为早期肾损伤的无创临床诊
断提供实验依据。

1.1 主要试剂
小鼠抗Clusterin单克隆抗体（R＆D公司），辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗、通用型二步法免疫组化试剂盒（PV－6000）和DAB显色剂（北京中杉生物技术
有限公司）。

1.2 实验动物及UUO模型建立
40只健康雄性Wister大鼠（210－230g，吉林大学实验动物中心），适应性饲
养1周，大鼠造模前禁食12小时后乙醚吸入麻醉，仰卧位固定。

无菌条件下于左侧中腹部切开皮肤，打开腹腔，在左后腹壁沿肾门向下辨认白色细线状的输尿管，游离左侧输尿管，分别在肾盂处和输尿管上1／3处用手术线双重结扎，在结扎线之间切断输尿管，逐层缝合腹壁皮肤。

右侧不结扎作为自身对照，假手术组仅游离输尿管但不结扎［2］。

分别于术后1、3和7d处死大鼠，取肾脏备用。

1.3 免疫组化检测UUO大鼠肾脏Clusterin表达
UUO大鼠肾脏于10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片。

切片经过脱蜡、水化，微波热修复，冷却后经3%H2O2灭活内源性过氧化酶，血清封闭后依次加入相应一抗和二抗后进行显色。

Clusterin一抗以1∶100稀释后加入，滴加二抗
以及染色步骤严格按照PV－6000说明书操作。

在高倍镜（×400）下，Clusterin 以细胞质内出现黄色颗粒为阳性信号，每例切片随机选5个肾小管－间质染色阳
性视野，阳性细胞染色程度按0－3分计算：0分，正常；1分，浅黄色；3分，
黄褐色；介于二者之间为2分。

染色后同时观察肾小管间质病理改变。

1.4 ELISA检测UUO大鼠尿液Clusterin水平
大鼠于造模后第0d－7d每日收集尿液，假手术组为对照，尿液离心后取上清包被于96孔酶标板（按85μl包被液＋15μl样品加入），4℃过夜；次日加入1%BSA 150μl／孔封闭1h后洗板3次×3 min；小鼠抗Clusterin单克隆抗体（以1∶1 000稀释）100μl／孔，37℃1h后洗板；羊抗小鼠二抗（以1∶3 000稀释）
100μl／孔，37℃1h后洗板；邻苯二胺－过氧化氢显色系统显色，置37℃避光显
色10 min后终止反应，经酶标仪检测A490值。

1.5 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，实验数据以均数±标准差（¯x±s）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05时视为有统计学意义。

2.1 UUO大鼠肾脏病理学检查
免疫组化结果显示：假手术组大鼠肾脏无明显病理改变，Clusterin蛋白无显著表达，免疫组化评分为0分；造模1天的大鼠可观察到肾小管扩张，偶见Clusterin 有表达，评分为1分；造模3天后大鼠梗阻病变明显，可见肾间质纤维化，肾小
管严重损伤，且Clusterin表达明显增多，评分为3分；4组（造模7天）大鼠梗阻病变相比3组有所减轻，纤维组织增加，Clusterin表达有所减少，评分为2分。

见图1。

2.2 各组UUO大鼠尿液中Clusterin表达
经检测UUO造模成功第1－2d（0.54±0.16，0.63±0.20）尿液中Clusterin表
达即开始升高，但与假手术组（0.49±0.18）相比无明显统计学差异，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即开始表达，UUO造模后第3－5d尿液中Clusterin（0.70± 0.21、0.81±0.29、0.78±0.27）均较假手术组尿液表达明显升高，且具有统计学差异（P＜0.05），UUO造模后第6－7d尿液中Clusterin含
量开始有所下降，但仍维持在较高水平（0.74±0.23、0.67± 0.21）。

结果表明大鼠UUO造模成功后1－2d尿液中Clusterin即开始出现，第3－5d开始含量明
显增加，且达到高峰，第6－7d开始Clusterin含量趋于下降，但仍高于正常水平。

单侧输尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）模型是被广泛应用的
较好的肾小管间质纤维化模型，肾功能的恶化很大程度上取决于肾小管间质纤维化的程度，且肾小管间质纤维化通常是多种病因所致的慢性肾脏疾病进展甚至发展为
终末期肾病的最后共同通路［3］。

Clusterin是体内一种异二聚体糖蛋白，最初
被发现于公羊睾丸液，在正常肾组织中很难检测到，但在一些疾病导致的肾损伤时，Clusterin可见表达且参与疾病进程，如肾缺血再灌注损伤（IRI）发生时Clusterin即是一个保护细胞功能的分子伴侣蛋白［4］，有研究将肾小管上皮细
胞做缺血再灌注诱导后第1d肾小管上皮细胞开始凋亡，且Clusterin开始表达，
第3d时其表达至高峰，第7d时细胞功能基本恢复正常，但敲除Clusterin表达
后肾小管上皮细胞凋亡的敏感性增强，提示Clusterin的表达缺乏可加重IRI损伤［5］。

Marcella［6］等人采用2.5小时冷缺血的大鼠肾移植模型，研究发现在
慢性肾移植肾病导致的肾损伤时炎症细胞浸润严重，肾间质纤维化明显，肾小管严重扩张，同时Clusterin表达上调且呈时间依赖性，其相比KIM－1和NGAL等分子标志物具更高特异性和敏感性。

本实验通过单侧输尿管结扎造成急性肾损伤模型，造模后梗阻侧肾脏明显肿大，肾皮质变薄，组织病理显示肾间质淋巴单核细胞浸润、肾小管扩张、间质水肿严重，随造模时间的延长，肾小管产生囊性扩张、水肿程度减轻、纤维化病变加重，提示UUO造模成功。

免疫组化检测UUO大鼠肾脏Clusterin表达，结果表明：造模
第1d时肾脏偶见Clusterin表达，第3d时表达最为明显，第7d时Clusterin表达减少，但较假手术组比较肾损伤有所减轻。

ELISA结果显示第1dUUO大鼠尿液即有Clusterin表达，第3－5d尿液中Clusterin表达明显增加且达到高峰，第6－7d开始尿液中其含量开始减少，但仍明显高于正常水平。

提示尿液Clusterin
含量与其在UUO肾脏中含量及病变程度关联性好，即UUO肾损伤早期尿液中Clusterin表达即有改变，提示尿液中Clusterin含量可作为UUO导致的肾损伤的生物标志物，且具较好的敏感性。

本研究为系列研究，在前期研究中我们已证实尿液Clusterin含量与庆大霉素所致大鼠肾损伤病变程度关相关性好，本次又在UUO肾损伤模型中进行了验证，为Clusterin尽早应用于临床肾损伤的早期诊断
提供了实验依据。

【相关文献】
［1］Zhou W，Guan Q，Kwan CCH，et al.Loss of clusterin expression worsens renal ischemia－reperfusion injury［J］.American Journal of Physiology－Renal Physiology，2010，298（3）：F568.
［2］薛痕，樊均明，陈亮，等.大鼠肾间质纤维化动物模型的实验研究［J］.四川动物，2004，23（1）：16.
［3］Hodgkins KS，Schnaper HW.Tubulointerstitial injury and the progression of chronic kidney disease［J］.Pediatric Nephrology，2012，27（6）：901.
［4］Zhou W，Guan Q，Kwan CCH，et al.Loss of clusterin expression worsens renal ischemia－reperfusion injury［J］.American Journal of Physiology－Renal Physiology，2010，298（3）：F568.
［5］Nguan C Y，Guan Q，Gleave M E，et al.Promotion of cell proliferation by clusterin in the renal tissue repair phase after ischemiareperfusion injury［J］.American journal of physiology［J］，Renal physiology，2014，306（7）：F724.
［6］Franquesa M，Herrero E，Torras J，et al.Mesenchymal stem cell therapy prevents interstitial fibrosis and tubular atrophy in a rat kidney allograft model［J］.Stem cells and development，2012，21（17）：3125.。