多糖结构解析

多糖（Polysaccharide）是天然大分子物质， 是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分析较 蛋白质结构分析复杂，一方面是因为组成多糖的 单糖品种繁多（目前已知的单糖有200多种）； 另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连接方 式的不同以及可能有分枝（蛋白质没有分枝）， 所以多糖的结构种类就很多，不容易分析。
结果判断：在270nm处无明显吸收峰增加，提示：糖与蛋
白之间的连接键属非O-型糖苷键。
编辑版pppt
7
三、结构研究的化学方法
完全酸水解
阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常用 的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和 糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α型较 β型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷键一般 较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液，然后用层析方法分析， 常用的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这 种酸水解方法分析已经达到完全自动化。
H O C H 3
O C H 3
H
+1O H O H
O H O H
H O C H 3
(2,3,4,6-O-四甲基Glc)
(2,3,6- O-三甲基Glc)
编辑版pppt
(2,3,6- O-三甲基Glc)
19
(1)各种单糖甲基化衍生物的基峰均为43， 为CH3CO+ ;
(2)被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有 甲氧基的碳原子容易与相邻碳原子间发生断键，形成
编辑版pppt
17
O
O
1 + H 3 CSC H 3 NaOH H 3 CS C H -2 N a +
（二甲基亚砜）
（二甲基亚砜磺酰阴离子）
O
O
2 + + H 3 CSC H -2 N a + R OH R O - N a + H 3 CSC H 3
（糖）
（糖羟基-醇钠）
3 + RO -N a +H 3 C I
以1→2位键合(1→2,6类似)
O H
H
O
H
O H H
HO
0
H O H
C2H OH
CH2O H
IO -4
O N aB H 4
O H+
C2H OH
CH OO HCOOC H 2O HH O H 2C
OH 2O2CHOH
O
C2H OH
以1→4位键合(1→4,6类似)
O H
C2 O HH
C H 2 O H
3、碱降解
4、酶解
编辑版pppt
6
二、糖与蛋白之间连接键型分析
β-消除反应
原理：糖温和条件下稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸
的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来。与 天冬酰胺相连的N-型连键则不能被稀碱水解下来。所 以，β-消除反应在糖蛋白的结构分析中，常被用来区别糖 链的连接性质。
方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在60℃ 水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比，在230270nm范围内扫描。
m/e145
20
4、多糖中的乙酰基定位
原理：利用甲基乙烯醚将多糖结构上的游离羟基保 护起来，脱去乙酰基，使结合的羟基游离。对游 离羟基进行甲基化，去除保护基团并完全水解。 单糖上甲基化的位置即是原始多糖中的乙酰位 置。
编辑版pppt
1
多糖结构测定的意义
从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即 使具有很强的活性与具有较大的安全性，但如果 结构不清楚，则无法进一步开展其药理学与毒理 学研究，也就不可能进行人工合成或结构修饰改 造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究， 其学术及应用价值将会大大降低。
编辑版pppt
2
结构研究的主要程序
部分酸水解
控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较低 分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。 其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压 液相层析。解析寡糖结构较多糖简便的多，但需减少回复现象，水 解时多糖的浓度小于5%。
编辑版pppt
8
碱降解反应
(1)初步推断化合物类型 1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。 2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的溶解
度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。 3 结合文献调研。
(2)测定分子式,计算不饱和度 1、元素定量分析 2、分子量测定 3、同位素峰法 4 、HI – MS等
编辑版pppt
3
(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结构分 析）
编辑版pppt
4
一、组成成分分析
1、酸水解 1-3N硫酸，100℃，水解6-8小时。用碳酸钡 中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。
气相色谱分析 纸层析（PG）：
展开剂： 正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5； 正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3
显色剂：常用硝酸银显色剂 A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V） B：1%NaOH乙醇溶液（W/V） C：6 mol/L氢氧化铵
C2 O HH
+ H
O
H O HH
O
0
H O H
IO -4
O N a B H 4
O H + CHO CH 2 O H
OOO HC HO C
OH C O H 2 O 2 H CHO H 2 O H C2 O O HH H CC 2 O H
源自文库
以1→3位键合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4类似)
①喷试剂A，室温风干；②将纸浸入B液中，待斑点显色；③再浸 入C中以洗去滤纸上的氧化银；编辑④版水ppp冲t 洗1小时左右，风干，显棕黑 5 色斑点。
2、乙酰解 冰醋酸溶液加入少许硫酸进行 乙酰解，可以生成乙酰化单糖通过气相色 谱鉴定。
原因：因为1-6糖苷键多糖对酸水解相对 稳定一些，但在乙酰解中则优先断裂，有 利于结构的研究。
OH
OH
H
O
H
IO-4
NaBH4
H+
H H
OH
OH H
O
0
H OH
编辑版ppH p2O t HOO HH
H OH
OH
11
2、Smith降解：是将氧化产物还原后进行酸水解。
1 2位和1 6位键结合的经Smith降解后都有甘油产生。 （但1 2位结合的不产生甲酸，可供以区别）。
1
4键合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤藓
防止发生超氧化：控制pH3-5；避光；空白对照实验
编辑版pppt
10
1→、1→6键型
O H
+ H
H
O 2IO 4-
O H H
C H 3 O
C H 2O H
N aB H 4
O
H O
0
H O H
C+HOOHCOC H 2O H
H C O O H
H O H 2C
C2H OH
H +
C2H OH CHOH
OH 2 OC2H OHC2H OH
1、官能团的定性及定量
2、测定并解析化合物的有关光谱
（UV,IR,MS,HNMR,CNMR等）
(4) 推断并确定分子的平面结构
1、 结合文献调研
2 、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。
(5)推断并确定分子的主体结构
1、测定CD或ORD谱
2、测定NOE,NOESY或ZD-NMR谱
3、进行X射线晶体衍射分析或人工合成
正离子。
H
205 CH3 O
161
H
H 45
O COCH3
O CH3
117
H
161
O CH3
205
O CH3
OCH3
断裂方式如下: 主要碎片(m/e)为：45.117.161.205
OC3H
COC 3 H OC3H
m/e161
-甲醇
H2C
-乙醇
OC3H
-乙烯酮
O COC 3 H
m/e129
H2C
OC3H
编辑版pppt
14
（2）多糖甲基化
精确称取纯多糖200mg，加35ml无水二甲亚砜， 通氮下搅拌至完全溶解后，加入18-20ml制备的 负碳离子液，通氮下搅拌4-6小时，然后加入8ml 碘甲烷，通氮条件下搅拌1-2小时后，停止通氮， 继续搅拌过夜。
注：糖液加入负碳离子后，液渐变为橙黄色；加碘 甲烷后液由混浊变清彻。
OH
m/e87
OC3H
OC3H
m/e101
-甲醛
OC3H
CH2 m/e71
由161、205进一步裂解为71.87.101.129.145。 OCH3
OCH3
-乙醇
实际所得碎片为: 45.71.87.101.117.129.145.161.205编辑版pppt
O COCH3
OCH3
m/e205
OCH3 OCH3 OCH3
碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端的 单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分析多糖碱降 解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分 子的非还原端。
过碘酸及其盐的氧化反应
多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似，其与 过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例 之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二元醇相似，其 开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的 （1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧 化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可 确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
（2）甲酸成： 将样品溶液加少量乙二醇，放置10分钟 后（以中止反应还原剩余的高碘酸），然后用0.01mol/L 氢氧化钠滴定甲酸的释放量。
（3）降解：上述反应物加入1ml乙二醇、对蒸馏水透析 24小时。减压浓缩至小体积，加硼氢化钠还原。
用2 N 硫酸水解（100℃，6hr），碳酸钡中和
纸层析（需标样）、薄层色谱层析、气相层析
编辑版pppt
16
（7）水解、还原和乙酰化 ①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸1ml，充
N2 封管，100℃水解4小时，然后加甲醇蒸除甲酸，至pH 为67，真空干燥，再加入2 mol/L 三氟乙酸2ml，100℃ 水解6小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性，再用 蒸馏水赶除乙醇。 ②还原。加入NaBH4 60mg还原24小时，室温磁力搅拌；然 后加入半匙阳离子交换树脂，磁力搅拌2小时，定量滤纸 过滤，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥; ③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙酰化 2小时，然后移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶除乙酐， 然后真空干燥; (8)样品分析。产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行GC分析 及GCMS分析。
醇）。
1 6键合的，最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。
1 4键合的戊糖聚糖，相应的产物是乙烯二醇和甘油。
操作：高碘酸氧化：多糖液加入一定量的15-20mmol/L 高碘酸钠溶液。
黑暗搅拌反应，定时取样在222nm 测定光密度值， 直到光密度值下降到稳定为止（不再下降）。
编辑版pppt
12
（1）高碘酸消耗量：用0.01mol/L标准碘液滴定高碘酸 消耗量
编辑版pppt
13
3、甲基化（单糖残基的连接方式）
是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基甲基 化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖产物，就 可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置（羟 基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点）。 （氢化钠、碘甲烷）
（1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于100ml试 剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入1.5gNaH，渐 渐加温，然后恒温在65-70℃4-6小时。最终颜色 为墨绿色。整个过程通氮，并搅拌。
R O C H 3 +N a I
（碘甲烷）
（甲醚甲基化糖）
以(1→4)葡聚糖为例:
OH（甲基化）
OH
4
H
O
H OH H
O
HO
H OH
O
H OH H
H
OH
O
n
OH
OH
O
H
H
O
OH
OH
H OH
OH
H OH
H
OH
H H
OH
O H
O
HO
编辑版pppt
18
H
OH
H3C
O CH3
O
H
O O
CH3
O
H O CH3
编辑版pppt
15
（3）透析 产物加蒸馏水稀释一倍，蒸馏水透析2-3天（换水）
（4）真空干燥（或冻干），得部分甲基化多糖，需进一步 甲基化
（5）进一步甲基化： 重复1-4的Hakomori methods 氧化银法
（6）产物：甲基化产物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿层， 干燥得甲基化糖。 甲基化产物分析 气相色谱法。
O CH3
O
H O CH3
HO
O
n CH3
H3C
O CH3
H
O
H
O CH3
O
O
H
O CH3
O CH3 O
H O
O CH3
CH3
OH H O CH3
CH3
H
O CH3
（水解、还原）
OC H 3
OC H 3
O
O
+ H 3 C 3O O H C H 3O H
H
n O C H 3
O H
H 3 C
H OC H 3
编辑版pppt
9
1、过（高）碘酸氧化 原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成
相应的多糖醛、甲醛或甲酸。
结果：
1 2或1 4键：每个糖基仅消耗一个分子的高碘 酸，无甲酸释放。
1 3位键：不被高碘酸氧化
1 6位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一个分 子甲酸。
然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。