抗菌肽抑菌活性测定方法的研究

抗菌肽或肽类抗生素为生物体内稳定存在或 在 创 伤 感 染 后 诱 导 产 生 的 一 类 活 性 分 子 ［1 ，2 ］ 。 其 分 子 量 较 抗 生 素 大 ，分 子 结 构 复 杂 。 抗 菌 肽 具 有 水 溶 性好，无免疫原 性 ，抗 菌 性 广 谱 等 特 点 ，并 对 肿 瘤 细胞、病毒、真 菌 和 原 虫 等 有 杀 伤 作 用 ，是 一 类 令 致病菌很难产生耐药性的新概念药物
脂 ， 溶解后于 0.1 Mpa 、121℃ 下灭菌 20 min ， 冷却至
再 以 MH 培 养 基 对 其 进 行 稀 释 , 稀 释 度 以 5 μg/mL 为 中 心 进 行 系 列 2 倍 稀 释 ， 终 浓 度 为 160 μg/mL ，
80 μg/mL,40 μg/mL ，20 μg/mL ，10 μg/mL ，5 μg/mL ， 2.5 μg/mL,1.25 μg/mL ，0.625 μg/mL ，0.3125 μg/mL ，
图3
7）注 入 空 气 ： 向 每 组 2 片 叶 中 的 另 一 片 的 塑 料 袋
内 注 入 空 气 ， 向 “ 装 置 ” 注 入 10 mL 水 替 代 NaOH 溶 液 ）； 重 复 实 验 步 骤 6 （ 或 用 注 射 器 吸 取 空 气 直 接 注 入 ）。
图4 光合作用需要二氧化碳的实验
抑菌圈大小及现象
菌株 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌
160 80 40 20 10
+ +
5 2.5 1.25 0.63 0.31 0
40 μL （40 μg/ 纸片 ）。 1.2 1.2.1
方法
18 h 后 观 察 结 果 。 1.2.4
在配制好的
TTC 微 量 稀 释 法
抗菌肽的加入 、菌液配
TTC 浓 度 对 菌 生 长 的 影 响
制 及 菌 液 接 种 与 微 量 稀 释 法 相 同 ， 当 （ 35 ± 1 ） ℃ 生 化培养箱孵育至空白孔明显有肉眼可见细菌生长 时 ， 于 每 孔 加 入 0.5% TTC5 μL ， 继 续 （ 35 ± 1 ） ℃ 生 化 培 养 箱 孵 育 1~3 h ， 观 察 实 验 结 果 。
aureu ） ATCC29213 ， 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli ）
ATCC25922 ， 铜 绿 假 单 孢 菌 ［ Pseudomonas aerugi-
nasa （ Schroeter ） Migula ］ ATCC27853 ， 3 种 菌 均 由 中
国菌种保藏中心提供。
以 微 量 稀 释 法 为 基 础 ， 利 用 氯 化 三 苯 四 氮 唑 的 显 色 原 理 设 计 了 简 单 的 显 色 MIC 方 法 ， 且 用 该 方 法 与 K-B 以 及 常 规 微 量 稀 释 法 做 了 3 种 标 准 菌 株 的 对 比 。 与 K-B 法 及 常 规 微 量 稀 释 法 相 比 ， TTC 微 量 稀 释 法 可 以 准 确 地 判 断 细 菌 生 长 抑 制 终 点 ， 得 到 确 切 的 结 果 。 TTC 微 量 稀 释 法 反 应 灵 敏 ，操 作 简 便 ，尤 其 适 合 在 分 离 、纯 化 过 程 中 跟 踪 检 测 抗 菌 肽 的 活 性 。 关键词 抗菌肽 氯 化 三 苯 四 氮 唑 (TTC) 文 献 标 识 码 ：B 的菌苔 ［6］（ 即 “ 卫星现象 ”） 或不生成抑菌环 ， 使得现 象不明显 ， 判断错误 。 另外 ， 以微量稀释法 ［5，7］测定其 活性时 ， 在被抑制的比浊孔中有少数细菌生长 ， 肉 眼无法看到 ， 需要借助精密度高的仪器设备观察 。 为 此 ，以 微 量 稀 释 法 为 基 础 ，利 用 氯 化 三 苯 四 氮唑的显色原理设计了简单的显色 MIC 方法 ［8－10］。 此法 快 捷 、 简 便 ， 不 需 要 借 助 精 密 度 高 的 设 备 ， 用 肉 眼 即 可 观 察 结 果 。 且 用 该 法 与 K-B 以 及 常 规 微 量 稀 释 法 做 了 3 种 标 准 菌 株 的 对 比 ， 证 实 了 TTC － 微量稀释法 中 国 图 书 分 类 号 ： Q-31
8 ） 光 照 处 理 ： 天 竺 葵 光 下 照 射 2～3 h 。
（ E － mal:lhm551001@ ）
* 基 金 项 目 ： 四 川 省 科 技 厅 科 技 攻 关 项 目 （ 2006J13-016 ） ； 成 都 大 学 校 基 金 项 目
2011 年 第 46 卷 第 4 期
4
0.125 5.8 × 104 3.5 × 10
4
0.25 5.0 × 104 4.0 × 104 520
3.8 × 104
4.2 × 104
3.6 × 104
4.1 × 104
6.8 × 103
6.2 × 103
5.6 × 102
注 ： TTC 浓 度 单 位 为 mg/mL ， 菌 落 数 单 位 为 cfu/mL 。 表 中 结 果 均 为 3 次 实 验 的 平 均 值 ， 以 下 同
于 聚 苯 乙 烯 U 型 微 量 板 每 孔 加 入 100 μL 。 将 以
80℃ 后倒平板备用 ， 厚度约 4 mm 。 3 ） 标准菌株 。 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus
MH 培 养 基 培 养 的 处 于 对 数 生 长 期 的 3 种 标 准 菌
分 别 用 无 菌 生 理 盐 水 稀 释 至 0.5 麦 氏 标 准 浓 度 单 位 (1.5 × 108cfu/mL) ， 将 这 种 菌 液 再 稀 释 10 倍 ， 使 终 浓 度 达 到 107cfu/mL 后 ， 作 为 接 种 菌 液 。 在 U 型 微 量 板 上 ， 每 孔 加 入 5 μL 菌 液 ， 最 终 接 菌 量 为
［3 ］
。 目 前 ，有
关抗菌肽的研究均集中于提取、 分离纯化及基因 表 达 等 方 面 。 然 而 ，在 抗 菌 肽 分 离 纯 化 过 程 中 ，如 何 保 证 其 活 性 是 最 重 要 的 。 因 此 ，在 抗 菌 肽 分 离 的 每一步均要跟踪测定抗菌肽的活性， 否则就失去 了 分 离 、纯 化 的 意 义 。 以 K-B ［4，5］ 法 测 定 其 活 性 时 ， 由 于 其 较 大 的 分 子 结 构 ，在 琼 脂 内 扩 散 慢 ，对 某 些 快 速 或 蔓 延 生 长 的病原菌作抑菌活性测定时 ， 常在抑菌环内生成薄
基四氮唑 （ TTC ） 是一种氧化还原色素 ， 可作为 氢 受 体被细菌脱氢辅酶上的氢还原， 由无色的氯化三 苯四氮唑 （ TTC ） 变为红色而不溶于水的三苯甲 腙 。 但 TTC 在高浓度时也可作 为 一 种 抑 菌 剂 ， 对 某 些 细菌有明显的抑菌作用， 从测定的 3 种标准菌株 中可以看 出 ， 金 黄 色 葡 萄 球 菌 在 0.03 mg/mL TTC 存 在 时 ， 出 现 了 生 长 抑 制 现 象 （ 见 表 1 ）， 为 此 ， 在 之后的实验中使 TTC 的终浓度为 0.005 mg/mL 。
4） 抗 菌 肽 及 药 敏 纸 片 。 抗 菌 肽 由 成 都 大 学 中
药化学实验室提供， 药敏纸片为自制的空白灭菌 纸 片 ， 每 一 纸 片 上 滴 加 1 mg/mL 的 抗 菌 肽 溶 液
104cfu/ 孔 。 菌 液 要 求 在 配 制 后 15 min 内 接 种 ， 在 每
块 微 量 板 上 ， 第 12 孔 为 不 含 药 物 的 培 养 基 ， 作 为 细 菌 生 长 的 对 照 。 （ 35 ± 1 ） ℃ 生 化 培 养 箱 孵 育 16~
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物
学
通
报
表4
2011 年 第 46 卷 第 4 期
TTC 微 量 稀 释 法 测 定 抗 菌 肽 对 试 验 菌 的 MIC
肽浓度
出 抑 菌 圈 ，但 抑 菌 圈 内 出 现 一 些 菌 苔 ，使 得 抑 菌 圈 不 是 很 明 显 ，脂 扩 散 法 药 敏 结 果
释 至 1 × 10 cfu/mL ， 取 100 μL 接 种 于 TTC 营 养 琼
6
2 2.1
结果与分析
TTC 浓 度 对 测 定 菌 生 长 的 影 响
氯化三苯
脂 平 板 ，另 取 一 普 通 营 养 琼 脂 平 板 作 为 空 白 对 照 。 按 照 GB/T 4789.2-2003 的 方 法 测 定 菌 落 总 数 。 实 验 均 重 复 3 次 ，取 平 均 结 果 ，以 下 同 。
营 养 琼 脂 培 养 基 中 加 入 1% 的 TTC ， 使 其 终 浓 度 分 别 为 0.25 mg/mL ， 0.125 mg/mL ， 0.0625 mg/mL ，
0.03125 mg/mL ， 0.0156 mg/mL ， 0.0078 mg/mL ， 0.0039 mg/mL ， 将 处 于 对 数 期 的 3 种 标 准 菌 株 稀
表1
2.2
K-B 琼 脂 扩 散 法 药 敏 结 果
K-B 法 测 定 抗
菌肽对 3 种标准菌株都显示出抑菌活性， 对绿脓 杆 菌 的 活 性 尤 为 明 显 ，抑 菌 圈 清 晰 可 见 ，但 对 大 肠 杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌不明显，虽肉眼 可 看
TTC 浓 度 （ mg/mL ）
不 同 TTC 浓 度 的 营 养 琼 脂 平 板 菌 落 数
MIC 的 可 靠 性 。 1 1.1
材料和方法 材料
1 ） 氯 化 三 苯 四 氮 唑 （ TTC ） 。 精 确 称 取 TTC 1.000 g ， 用 100 mL 蒸 馏 水 溶 解 ， 配 制 成 1%(W/V)
其 后 ，检 验 叶 片 内 是 否 有 淀 粉 产 生 ，实 验 方 法 与 步 骤 不 变 （ 略 ）， 实 验 现 象 ： 见 图 4 。
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溶 液 ， 于 0.1Mpa 、 121 ℃ 下 灭 菌 20 min ， 冷 却 后 冰 箱保存备用。
孵 育 16~18 h 后 观 察 结 果 。 量 取 抑 菌 环 直 径 (mm) 。
1.2.3
微量稀释法
以灭菌蒸馏水溶解抗菌肽，
2 ） 培 养 基 Mueller-Hinton Broth 培 养 基 ： 参 照 GB/T 4789.28-2003 方 法 配 制 。 MH （Mueller-Hinton ） 平板 ： 配制 MH 培养基 1 000 mL 加入 12 g 琼
1.2.2
K-B 琼 脂 扩 散 法
将 以 MH 培 养 基 培 养
的处于对数生长期的 3 种标准菌分别用无菌生理 盐 水 稀 释 ， 调 整 浓 度 为 0.5 麦 氏 标 准 浓 度 单 位 ， 用 无 菌 棉 试 子 蘸 取 菌 液 ，在 平 板 内 均 匀 涂 布 接 种 。 室 温 干 燥 3~5 min 后 用 无 菌 镊 子 将 不 含 药 物 的 无 菌 空白药敏纸片贴于平板表面， 各纸片中心之间距 离 大 于 24 mm ， 纸 片 距 平 板 內 缘 大 于 15 mm 。 在 每 一 纸 片 上 加 抗 菌 肽 溶 液 40 μL （ 40 μg/ 纸 片 ）， 室 温 放 置 10 min 后 水 平 放 置 于 （ 35 ± 1 ） ℃ 生 化 培 养 箱
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2011 年 第 46 卷 第 4 期
抗菌肽抑菌活性测定方法的研究*
邬晓勇 何 钢 颜 军 郭晓强
四川成都
姚
倩
苟小军
（成 都 大 学 中 药 化 学 实 验 室
610106 ）
摘要
探 讨 建 立 一 种 在 抗 菌 肽 分 离 、纯 化 过 程 中 简 单 、快 速 、灵 敏 的 检 测 抑 菌 活 性 的 方 法 。
菌种 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌
0 4.2 × 104 3.6 × 10
4
0.004 6.8 × 104 3.8 × 10
4
0.008 6.2 × 104 3.8 × 10
4
0.016 5.9 × 104 4.2 × 10
4
0.031 6.3 × 104 3.6 × 10
4
0.063 5.5 × 104 4.1 × 10