VEGF在人胚胎干细胞向神经元分化中作用的研究

作者单位:430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科
V EGF 在人胚胎干细胞向神经元
分化中作用的研究
焦淑洁 许慧芳 许 杰 张苏明 湛彦强
摘要 目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelia l g row th factor ,V EGF)在人胚胎干细胞分化为神经元过程中是否发挥作用及相关机制。

方法 人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组:A 组为常规诱导组,B 组为常规诱导+VEGF (10ng/mL )作用组,C 组为常规诱导+V EGF (10ng/mL)+V EG FR 2/Fc 嵌合体(10ng/mL)作用组;用RT -P CR 、免疫荧光法检测各阶段细胞标志物,计算并用流式细胞仪检测各组不同阶段细胞阳性率。

结果 用RT -PCR 分别检测到OCT 4、N estin 、M AP 2表达;免疫荧光法检测显示B 组产生神经干细胞、分化为神经元的阳性率明显高于A 、C 两组,差异有统计学意义(P <0.01),A 、C 两组之间无显著性差异(P >0.05);流式细胞仪检测与免疫荧光法相似。

结论 人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过血管内皮生长因子受体2来促进神经干细胞增殖及向神经元分化。

关键词 人胚胎干细胞 神经分化 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体2 中图分类号 R 741 文献标识码 A 文章编号 1007-0478(2009)03-0134-04
Effect of VEGF on Neural Differentiation of Human Embryonic Stem Cells in vitro J iao S huj ie,X u H ui -f ang,X u J ie,et al.D ep ar tment of N eurol ogy ,T ongj i H osp ital ,H uaz hong Univer sity of Science and T ech -nology ,W uhan 430030
Abstract Objective T o obser ve the effect of V EG F on neural differ entiat ion of human embry onic stem cells(hESCs)in v itr o .Methods After embr yonic body for matio n,hESCs w ere differentiated int o neural cells thro ug h selection and ex pansio n pro cedures.hESCs w ere div ided into three gr oups:g roup A ,ro utine induc -tio n;gr oup B,ro utine inductio n +10ng/mL V EGF t reated and g roup C,r outine induction +10ng /mL V EG F +10ng/mL V EGF R 2/Fc tr eated.T he cellular mor pho lo gy was observed by co ntr ast phase micr oscope.T he marker s o f every stage of induct ion w ere detected t hr ough R T -PCR.N estin and M AP 2ex pressing cells w ere det ected via immunof luor escence method.T he percentages of the imuno st aining positive cells w ere deter mined by flow cytometer (F CM ).Results OCT 4、Nestin and M A P 2w ere detected by RT-PCR.T he per centage of N est in and M A P 2po sitiv e cells in g roup B w ere much hig her than in g r oup A and g roup C(P <0.01).T here w as no difference between g ro up A and gr oup C(P >0.05).T he r esults of FCM wer e r oughly sim ilar.C onclu -sions VEGF ,v ia V EGF R 2,stimulates the neur al cells pr oliferat ion and differentiation o f human embr yonic stem cells in v itro .
Key words Human embry onic stem cells I nduction V ascula r endothelial gr ow th factor V ascular endot helial gr ow th facto r r eceptor 2
近年来研究发现,哺乳动物的神经发生过程与血管发生相耦联,增生活跃的血管内皮细胞在时间空间上都与神经发生相互关联
[1]。

血管内皮生长因
子(vascular endo thelial g row th factor,VEGF)由
血管内皮细胞分泌,是其发挥生物学作用的关键因子。

人胚胎干细胞(hum an embryonic stem cess,hESCs)定向诱导分化为神经元的过程亦依赖诸多
信号分子的相互协调作用。

本研究拟通过体外观察VEGF 在这一过程中是否发挥作用及相关机制。

1 材料与方法
1.1 人胚胎干细胞及相关培养基 人胚胎干细胞系T JM U 1和TJMU 2由本实验室与同济医院生殖中心前期研究人员陈红博士等人建系[2]
,本实验室
保存。

诱导分化相关培养基有(1)hESCs 培养基:KNOCKOU T DMEM (Gibco )、血清替代物(Gib -
co)、L -谷胺酰胺(H yclone )、非必需氨基酸(H y -clone)、 -巯基乙醇(Sig ma)、重组碱性成纤维细胞生长因子(basic -fibroblast g row th factor ,bFGF )
(Sigma)及青链霉素(H yclone);(2)拟胚体(Embry -o nic body ,EB)培养基;hESCs 培养基去除bFGF;(3)神经干细胞培养基:DMEM /F 12(H y clone)、B 27(Gibco)、No ggin(R&D)、bFGF 、非必需氨基酸、L -谷胺酰胺及青链霉素;(4)神经元培养基:DMEM /F 12、ITS(Sigm a)、N 2(Gibco )、脑源性神经生长因子(R&D)、表皮生长因子(R&D)、B 27、L -谷胺酰胺、非必需氨基酸及青链霉素。

1.2 其他实验试剂 VEGF(Pepr otech);重组血管内皮生长因子受体2(recom binant v ascular endo -thelial gro w th factor receptor 2,VEGFR 2)/Fc 嵌合体(R&D);抗Nestin 抗体(神经干细胞标志);抗微管相关蛋白-2(ant-i m icrotubule -associated pro -tein 2,M AP -2,成熟神经元标志)多克隆抗体(Chemicon);DAPI(Sig ma);FITC 标记的荧光二抗(北京中杉金桥);T rizo l and RT -PCR 试剂盒(Fer -m entas)。

1.3 hESCs 培养、分化及实验分组
hESCs 复苏后接种于丝裂霉素灭活的胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,加入hESCs 培养基;置于37 、5%CO 2的培养箱中培养,第6~7d 机械法传代。

传代后细胞分为3组:A 组细胞序贯加入EB 培养基、神经干细胞培养基及神经元培养基常规诱导分化,B 、C 组细胞除常规诱导分化外,各阶段培养基中分别加入10ng/mL VEGF (B 组),10ng /mL VEGF +10ng/mL VEGF R 2/Fc(C 组)作用48h,撤出后诱导过程同A 组。

1.4 细胞免疫荧光观察各阶段细胞标志性抗原表达 4%多聚甲醛固定爬片上生长的细胞,一抗4 过夜,二抗37 孵育1h,DAPI 复染核,中性树胶封片,照相。

各阶段各组细胞随机取3张爬片,观察10个视野,阳性细胞率=阳性细胞数/DAPI 复染细胞数 100%
1.5 RT -PCR 检测 (1)提取总RNA,按trizo l 试剂说明书操作;(2)合成cDNA,采用Fermentas RT 试剂盒,按产品说明书操作;(3)聚合酶链反应,GAPDH 作为参照。

1.6 流式细胞仪检测 为避免免疫荧光法计数阳性细胞率可能产生的误差,采用流式细胞仪进一步
精确检测诱导分化过程中各组细胞的阳性率。

胰酶
消化细胞为单细胞悬液,2%台盼蓝液染色,计数活细胞率。

选取活细胞率为80%以上的样本,按活细胞比例计算并收集1 106
个活细胞,2000r/min 离心5min,80%冰乙醇固定,流式细胞仪分别检测不同阶段各组细胞Nestin 、M AP 2的阳性率(%),各组重复实验3次。

1.7 统计学处理 阳性率(%)用 x s 表示,应用SPSS 11.0软件的单因素方差分析。

2 结 果
2.1 hESCs 、拟胚体和诱导分化不同阶段细胞的形态及免疫荧光法鉴定
倒置显微镜下观察hESCs 呈巢式生长,克隆大而扁平,细胞核大,核质比高,核仁清楚呈单个或双个核仁,细胞间界限清楚,折光性强(图1);拟胚体阶段细胞团体积较大,结构紧密,透明度高,细胞间粘附性强(图2);继续诱导分化各组细胞得到不同数量的神经干细胞,荧光显微镜下Nestin 染色阳性(图3);神经元培养基作用后出现大量细长形、梭形、小圆形有突起的神经元,荧光显微镜下M AP 2染色阳性(图4)。

图4 神经元M A P 2染色阳性( 100倍)
2.2 VEGF 及VEGFR 2对各阶段细胞生成的影响
hESCs 到EB 阶段各组细胞得到的EB 数量基本相同,均为60%左右,无明显差异;EB 到神经干细胞阶段B 组产生的神经干细胞阳性率高(89.56 2.88)%,体积大,与A 、C 两组差异有统计学意义(P <0.01),C 组产生神经干细胞的阳性率(68.86 2.83)%与A 组(69.30 3.43)%无明显差异(P >0.05);分化为神经元后B 组产生的神经元比例(58.11 3.30)%明显高于A 、C 两组(46.82 1.58)%、(47.77 3.58)%,差异有统计学意义(P <0.01),A 、C 两组之间无显著性差异(P >0.05)(表1)。

表1 3组hESCs 诱导分化生成的神经干细胞
和神经元的阳性率( x s ,%)
组别n Nestin 阳性率M AP 2阳性率A 组3069.30 3.4346.82 1.58B 组3089.56 2.88 58.11 3.30 C 组
30
68.86 2.83#
47.77 3.58#
注:与A 、C 两组比较, P <
0.01;与A 组比较,#P >0.05
2.3 RT -PCR 检测
经RT -PCR 检测得到hESCs 、神经干细胞和神经元的特异性标志物OCT 4、Nestin 、MAP 2(图5)。

B 组Nestin 、M AP 2的表达明显强于A 组(图6)。

图5 各阶段细胞不同标志物RT -PCR
结果
图6 A 、B 两组N estin 、M AP 2RT-PCR 结果
2.4 流式细胞仪检测各阶段各组细胞的阳性率
不同阶段各组细胞重复3次流式细胞仪检测,流式细胞仪检测与免疫荧光法计数相近,无明显差异。

B 组细胞诱导的神经干细胞N estin 阳性率、神经元MAP 2阳性率均明显高于A 、C 两组(图7)。

图7 流式细胞仪检测3组细胞N EST IN 、M AP 2阳性率
3 讨 论
hESCs 定向诱导分化为神经细胞的研究方法较多,包括经EB 法、与基质细胞共培养法和直接分化法等,其中经EB 法模拟了体内胚胎发育过程,有利于研究神经发生过程中的一系列问题,故本研究选用该诱导方法[3]。

最近的遗传学研究发现,血管系统与神经系统在各自的发生过程中互相影响[1]。

在周围神经血管发生过程中动脉血管并非随意生长,而是沿神经纤维分布生长;另一方面,血管内皮细胞可以释放神经源性信号如脑源性神经生长因子,刺激神经前体细胞的自我更新。

将神经干细胞与内皮细胞共培养,分化的神经元数量增加,VEGF 在其中发挥重要作用。

在大鼠室管膜下区VEGF 对神经前体细胞具有直接的促生长和分化作用[4]。

VEGF 发挥生物学效应需要通过2种酪氨酸激酶受体VEGFR 1和VEGFR 2,大多数VEGF 的作用通过VEGFR 2实现[5]。

在大鼠海马、脑室周围、嗅鞘等神经发生的部位均检测到VEGFR 2的表达。

VEGFR2通过生成二聚体,自身发生磷酸化,传递 增殖、分化以及细胞保护 等多种不同的信号,主要效应为促进细胞增生和存活[6]。

本研究观察了hESCs诱导分化为EB-神经干细胞-神经元这一系列过程中VEGF(10ng/mL)对细胞分化的影响。

在hESCs分化为EB过程中各组生成EB的量无显著性差异,未观察到VEGF对该阶段的影响。

在EB分化为神经干细胞阶段及神经干细胞分化为神经元过程中VEGF作用组(B组)产生的阳性细胞率明显高于常规诱导组(A组)和VEGF R2/Fc拮抗组(C组),差异有统计学意义(P <0.01)。

流式细胞仪检测和免疫荧光法相似。

这些结果提示在体外人胚胎干细胞分化过程中VEGF 具有较强的促进神经干细胞增殖的作用,经VEGF 作用的神经干细胞向神经元分化的潜能更大,这与Kim等的研究结果相符[7]。

本实验研究发现,用VEGF R2/Fc嵌合体拮抗VEGF的作用,与常规诱导组在各阶段神经细胞的分化率无明显差异(P>0.05),这提示VEGF R2/ Fc嵌合体可以阻断VEGF绝大部分作用,从而证明了血管内皮生长因子通过作用于血管内皮生长因子受体2而发挥促进神经干细胞增殖及向神经元分化的作用。

这与VEGF对大鼠神经干细胞的作用机制一致[5]。

也有研究表明VEGF的作用可被蛋白激酶C抑制剂或通过抑制下游效应器NF- B等而阻断[8],故VEGF发挥效应的具体信号通路有待进一步阐述。

有学者认为不同剂量VEGF对神经细胞的作用具双相性[9,10]。

Yasuhara等研究发现低浓度VEGF(1ng/mL)能够增加多巴胺神经元的生成并产生神经保护作用,而高浓度VEGF(100ng/m L)则表现出更多的血管发生、胶质增生及加剧脑水肿等作用[11]。

也有研究发现高浓度VEGF(500ng/ mL)能诱导大鼠神经干细胞的增殖并增强向神经元分化的潜能,低浓度VEGF(50ng/m L)却不能产生上述效应[4]。

本实验采用10ng/mL浓度,却也观察到了VEGF在体外促进人神经干细胞增殖并且增强神经元分化的作用,与上述研究不完全相符。

Cao等通过RNA干扰抑制大鼠海马内源性VEGF 的表达,发现不能阻断该区域基本的神经发生[12]。

因此,VEGF增强神经细胞增殖和分化作用的具体机制是否与其他因素共同作用以及最适宜浓度,有待于进一步探讨。

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(2008-10-22收稿 2008-11-20修回)。