色层分析法

第五章色层分析法
一、本章的教学目的与要求
了解色层分析法的原理及应用
二、授课主要内容
§5—1 概述
§5—2 柱层析column chromoyraphy
一．吸附柱层析
二．分配柱层析
三．柱层析的操作
§5—3 纸层析
§5—4 薄层层析法TLC
一．薄层层析用吸附剂
第一版P183
二．铺层方法
三．薄层层析中展开剂的选择、点样和展开
四．薄层层析中定性检出和定量测定
一．定性
二．目视比较半定量法
三、重点、难点及对学生的要求
掌握各种层析分离法的原理及分离条件的选择
四、主要外语词汇
column chromatography; paper chromatography; thin line chromatography
五、辅助教学情况（多媒体课件）
六、复习思考题习题：
1、说明分离的基本过程
2、阐述三种分离法中固定相和展开剂选择的原则
3、薄层层析中定性检出和定量测定的方法？
4、薄层层析中斑点显现的方法
七、参考教材references
参考书：《工业分析》机械工业出版社、重庆大学出版社，1997年，第一版《分离及复杂物质分析》邵令娴编，化学工业出版社，1984年，第一版
第五章色层分析法
§5—1 概述
色层分析法又称色谱法，1946年由M∙茨维特首次提出，1913年将其应用于分离复杂的有机混合物，开始引起广泛注意并得到迅速发展。

分类：按流动相、固定相性质分气相气—固
气—液
液相液—固仪器分析范围
液—液
按固定相状态分柱色谱
纸色谱
薄层色谱
按分离原理不同吸附色谱
分配色谱
离子色谱
凝胶色谱
§5—2 柱层析（Column Chromography）
一.吸附柱层析
1．吸附等温线
吸附是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象，吸附剂吸附能力的大小与其表面性质有关，若吸附剂表面的吸附中心被水分子占据活性降低，失去活性，称之为“脱活性”。

加热驱除水分称“活化”。

吸附等温线就表示某种组分在吸附剂表面的吸附规律。

由平衡时此组分在两相中浓度的相对关系曲线表示。

a．线性吸附等温线Cs 固定相
Cm 流动相
吸附等温线
C
V
洗提或洗脱曲线为一对称的层析图谱
溶质A在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断吸附，脱附达到平衡，
Cm Cs,K
=Cs/C,称作吸附平衡。

D
测定流出液中A的浓度，绘制C～V的曲线
b．非线性等温线
Cs Cs
Cm Cm
Langmuir等温线anti—langmuir等温线
由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上分配系数不同，吸附力强的溶质在其上分配系数大，反之则相反。

因此随着强吸附中心被饱和，K D逐渐变小，曲线向下弯曲，洗脱时弱的或较弱的先洗脱下来，流出柱子。

吸附强的后洗下流出，出现拖尾峰
试样中各组分分配系数有差异。

K D 大的与吸附剂结合牢。

在柱中保留的时间较长，反之相反。

利用各组分在固定相上吸附能力的差异即保留性的差异把它们分开。

保留值保留时间
保留体积
2．吸附剂及其选择
吸附剂要求：①粒度均匀细小
②表面积大和一定的吸附能力
③与分离试样及洗脱剂不起化学反应且不溶于洗脱剂中
（1）Al2O3（中性、酸性、碱性）
2Al（OH）3 300－400℃Al2O3 +3H2O
a．分类
中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯合化物苷的分离
酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等
碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质
一般能用酸性和碱性分离的也能用中性分离
b．活性：活度级1～Ⅴ级
吸附能力1～Ⅴ减弱
在不同的温度下活化氧化铝
100～150ºC活化有一定活性
﹥150ºC Ⅱ～Ⅲ级
300～400ºC Ⅰ～Ⅱ水减少，活性增强
﹥600ºC 脱水开始烧结
每一批表面积和表面孔穴结构不一致，活性不同，应测定一般：分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂。

反之则相反分离弱极性组分用吸附活性强一些的吸附剂
（2）硅胶
弹性多聚硅酸脱水
Si O Si 硅氧烷
Si OH
游离型硅酸醛
Si
HO
Si
OH
束缚型
硅酸醛
活泼型
硅酸醛
a b c d 硅氧烷不具吸附性
吸附性能d﹥b﹥c 表面孔穴较小的硅酸吸附能力较强
Si O OH 2
使硅胶失活，活化条件
105～110ºC 加热30 min
﹥200ºC Si
HO Si
OH 加热
Si
O Si
+H 2O
脱水吸附能力下降
﹥400ºC 烧结
用途：微酸性吸附能力较Al 2O 3 弱，可分离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）。

（3）聚酰胺
己内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶
O
N O
N
H O
N
O
N
H
H
O
O
HO
可与酚类，酸类，醌类，硝基化合物形成氢键而分离。

形成氢键基团多的吸附能力大。

对、间位形成氢键﹥邻位（空间位阻），芳香核由于共轭，吸附能力大。

3．流动相及其选择
洗脱过程实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。

强极性组分选用强极性洗脱剂，反之相反
功能团极性按由小到大排列
烷烃（—CH3，—CH2—）﹤烯烃（—CH=CH—）﹤醚类（—OCH3，—OCH2—）﹤硝基化合物（—NO2）﹤二甲胺（—N（CH3）2）﹤酯类（—COOR）﹤酮类（—C=O）﹤醛类（—CHO）﹤硫醇（—SH）﹤胺类（—NH2）﹤酰胺（—NHCO—CH3）﹤醇类（—OH）﹤酚类（Ar—OH）﹤羧酸类（—COOH）
有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强；分子中双键多，吸附力强；分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键。

常用流动相极性：
石油醚﹤环乙烷﹤二硫化碳﹤CCl4﹤三氯乙烯﹤苯﹤甲苯﹤二氯甲烷﹤氯仿﹤乙醚﹤乙酸乙酯﹤乙酸甲酯﹤丙酮﹤正丙醇﹤乙醇﹤甲醇﹤吡啶﹤酸。

在某些情况下可配成混合流动相
聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等
溶解试样用的溶剂极性应与流动相相近
二、分配柱层析
根据欲分离组分在两种互不混溶（或部分混溶）的溶剂的溶解度差来实现的
担体：硅胶：在较低温度下活化，使其表面残留部分水分
纤维素：天然纤维素
微晶纤维素
硅藻土：淘洗，干燥灼烧
固定相：一般为水，也有用稀硫酸，甲醇，甲酰胺
流动相；与水互不相溶的有机溶剂，应选以水饱和并加入醋酸、氨水，防分离组分分解。

含一定水分的硅胶失去活性，但所含水分为固定相，硅酸为载体。

假设一个分子在流动相中停留的时间分数R ，则在固定相中为1—R ，对大量分子可认为在流动相及固定相中溶质的量Cm ∙Vm 、Cs ∙Vs 分别为R 和1—R
11D
R Vs K Vm =
+
为溶质分子在流动相中出现的几率，也表示了溶质分子与流动相分子在层析柱中移动速度的相对值用R f 表示之，称作比移值
应用：分离强极性，亲水性物质，脂肪酸，多元酸，水溶性氨基酸等
若用其分离亲脂性有机物，用疏水性有机物作固定相，亲水性溶剂作流动相。

此时极性强的脂溶性差的组分R f 大，称为反相分配层析，固定相极性小于流动相极性。

三、柱层析的操作
柱：玻璃或塑料制管φ∶L = 1∶10～1∶60 ，底部装玻璃纤维或脱脂棉
装柱 干法：通过漏斗缓缓加入吸附剂，必要时敲打，吸附剂表层盖一滤纸，（加入冲冼
剂）打开下旋塞缓缓加入冲洗剂，不出现气泡和沟流
湿法：一面沉淀一面添加。

先加入已选定的洗脱剂，稍稍打开下旋塞，同时缓缓
加入吸附剂，加入时不易太快以免带入空气。

加样：勿扰动吸附层
样品浓些加入小体积试液
样品溶于极性与洗脱剂相似的溶剂中，若不溶或难溶可先用适当溶剂溶解。

加入少量吸附剂搅匀，待溶剂挥发后，将有试样的吸附剂加入柱中吸附层上
洗脱时保持一定液面高度，不能流干，0.5～2 mL/min洗脱
分析测定：1.分段洗脱
2.吸附剂从柱中推出，分段切开，分别洗脱测定(有颜色)
应用：提纯某些物质
例：有机反应机理分析中，反应产物的提纯，配合IR，NMR等
§5—3 纸层析
一般认为纸层析是一种分配层析：滤纸为惰性载体，纤维素中水分为固定相其实是一个复杂的过程。

采用纸层析时一般是取滤纸条，在接近纸条的一端点上欲分离的试液，然后把滤纸条悬挂于玻璃圆筒，即层析筒内，并让纸条下端浸入流动相中，流动相为展开剂。

由于滤纸条的毛细管作用，展开剂将沿着滤纸条不断上升，当展开剂接触点在滤纸上的试样时，试样中的各种组分就不断的在固定相和展开剂之间进行分配过程，从而使试样中分配系数不同的各种组分得以分离。

比移值R f
R f=原点至斑点中心间的距离原点至溶剂前缘间的距离
根据在一种或两种以上不同展开剂中R f一致确定是否为同一物质，进行定性分析。

一、层析条件选择
1．层析用纸：组织均匀，无折痕，边缘整齐，纯净，疏密适当（慢，中，快速）层析方向与滤纸纤维素方向垂直。

2．固定相：纤维素吸附的水分，也可用甲酰胺，二甲基酰胺，丙二醇等处理滤纸而做固定相。

二、点样和展开
1. 点样：溶剂是极性与展开剂相近易挥发的溶剂。

点样量几ug～10几ug，用平口毛细管
或微量注射器，2点间相距2㎝，距滤纸条3～4㎝，样点φ2～3㎝，稀溶液可反复点样（每次待挥发后再点）
2. 展开：层析缸应密闭不漏气，缸内先用展开剂饱和
上升法：取滤纸条，在接近纸条的一端点上欲分离的试液，然后把滤纸条悬挂于玻璃圆筒，
即层析筒内，并让纸条下端浸入流动相中，流动相为展开剂。

由于滤纸条的毛细管作用，展开剂将沿着滤纸条不断上升，当展开剂接触点在滤纸上的试样时，试样中的各种组分就不断的在固定相和展开剂之间进行分配过程，从而使试样中分配系数不同的各种组分得以分离。

下降法：把试液点在滤纸条接近上端处，纸条上端浸入展开的玻璃槽中，玻璃槽放在架子上，然后一起放在层析筒中。

圆形滤纸层析（灯芯法）：滤纸中心穿一小孔，小孔周围点样，滤纸卷成纸灯芯形成同心圆
的弧形谱带。

复杂样双向层析：长方形或方形滤纸在一角点上试剂，先展开，展开完毕溶剂挥发，再用另一展开剂沿与原来垂直方向展开。

如，氨基酸的分离，参考书《纸色谱及其应用》科学技术出版社。

三、显色
1. 有色物：展开后直接观察变色斑
2. 无色物；（1）用紫外灯光照（254 nm或365 nm），有机物对紫外光有吸收或吸收紫外光
后发射出各种不同颜色的荧光
（2）喷显色剂，如被分离物含羧酸时，可喷以酸碱指示剂溴甲酚绿；如有氨基酸
可喷茚三酮而且出不同颜色
四、定性，半定量
通过测定比移值进行定性分析，通过比较斑点大小及颜色深浅可进行半定量测定。

如：磺胺类药物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶化合物的分离和检出，可用1%的氨水作展开剂，用对二甲胺基苯甲醛（即Ehrlich试剂）乙醇溶液作显色剂。

氨基酸的分离和检出，双向层析:先用酚:水（1:3）第一次展开，再用丁醇：醋酸:水（4:1:2）展开，可分离20种氨基酸，展开后喷茚三酮的丁醇溶液使之显色。

§5—4 薄层层析法（TLC）
固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，试液点在层析板的一端距边缘一定距离处，放入层析缸中，使点有试样的一端浸入流动相展开剂中。

由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着吸附剂的上升，遇到点着的试样，试样中的各种组分就沿着薄层在固定相中和流动相之间不断地发生溶解，吸附，再溶解再吸附的分配过程，以致相互分开。

吸附力弱的易溶解，随展开剂在薄层上移动快，反之则相反。

各个色斑在薄层中位置可用比移值R f表示：
R f=原点至斑点中心间的距离原点至溶剂前缘间的距离
有时为了方便取HR f = 100R f
一、薄层层析用吸附剂
氧化铝：1.不加粘合剂，直接用干粉铺层150～200目（φ100～75 μm）—“干板”“软板”
2.加煅石膏作粘合剂，氧化铝G，加水调糊，铺层活化后用，250～300目（φ60～
50 μm）—“硬板”
Al2O3 分级可用偶氮苯，对甲氧基偶氮苯，苏丹黄，苏丹江，对氨基偶氮苯的CCl4溶液点板测R f值。

一般活化或Ⅱ～Ⅲ或Ⅲ～Ⅳ使用。

一级活性太强，吸附试样中组分不易洗脱。

硅胶：加粘合剂铺成硬板，硅胶250～300目，表面积300～600 ㎡/g，表面孔径100埃（应用多）。

联邦德国E.Merck厂：
硅胶H：不含粘合剂，用时需另加
硅胶G：硅胶加（13～15%）煅石膏混合而成
硅胶GF254：是硅胶中既含煅石膏又含荧光物质，在254 nm紫外光照射下呈黄绿色荧光硅胶HF254+365 ：不含煅石膏只含荧光物质，在254 nm和365 nm均可产生荧光
荧光指示剂ZnSiO4∙Mn——254 nm产生荧光
ZnS∙CdS∙Ag——365 nm产生荧光
80年后青岛海洋化工厂改名如下
硅胶G BCG—S 硅胶GF254 SY254
硅胶H BCG—D 硅胶HF254 DY254
瑞士Fluka厂：
硅胶DO不加煅石膏
硅胶DSF加5%煅石膏并加荧光指示剂
常用粘合剂：煅石膏，羧甲基纤维素（CMC），淀粉，聚乙烯醇
铺层方法：
初步试验用小玻片2.5㎝×7.5㎝
制备用较大的板
1．干法铺层“干板”，“软板”
氧化铝常用此法铺板
此法适用于干颗粒较粗，分离效率较差
2．湿法铺层：加水或其它溶液调糊状
（1）倾倒法：（根据玻璃面积及铺层厚度）称取一定量吸附剂，按比例加水（或其它溶液）调糊状，立即倾倒在玻璃上，大致推开，轻轻颠动玻璃板，使其自动淌成均匀薄层，水平放置10～20 min，固结后阴干备用或活化后备用。

（2）乱层法
（3）涂铺器铺层
二、薄层层析中展开剂的选择、点样和展开
1．展开剂的选择
吸附层析：根据极性的不同来选择流动相
微量圆环技术选择展开剂
分配层析：根据试样中各组分在展开剂中溶解度的不同和纸层析相似
2．点样：快，量适当。

同纸色谱
3．展开
上行法要注意以下几点：
a．缸盖严密不漏气（由于展开剂中各种溶剂的挥发度不同）
b．b．缸底平（可放一玻片垫平）
c．对易氧化样注意可在CO2、N2气氛中
d．温度的影响
下行法：用厚滤纸将展开剂引到薄层上端
三、薄层层析中定性检出和定量测定
1、定性
展开完毕取出记下展开剂前缘位置（溶剂挥发看不出，铅笔或用小针刺出）
（1）显色方法a．紫外光下观察
b．蒸气熏：固体碘，浓氨水，溴
c．喷显色剂：雾滴细而均匀防止损伤薄层表面
（2）计算R f值：与文献值对照
由于R f值受诸多因素的影响，最好用标准物质在同一板上展开比较。

四、目视比较半定量法
1．试液与一系列不同浓度的标准溶液并排点样于同一薄层上，展开后比较斑点的大小及颜色的深浅。

例如检验药物中杂质是否超标
2．测量斑点面积：利用面积测定仪，或用透明纸将斑点描下，印在坐标纸上数出面积相当于多少㎜2 ，出可转到质地均匀的纸上称重以重量代面积
3．从薄层上将组分洗脱下来测定或用小刀将斑点及吸附剂一起刮下置4～5号砂芯漏斗中，抽滤，用适当溶剂将组分洗脱
4．用薄层色谱扫描仪扫描定量
思考题
1. 层析用硅胶，有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF366等等不同标号，这些分别表示什么？应用这些硅胶时应分别注意些什么？
2. 硅胶薄层为什么即可以进行吸附层析，有可以进行分配层析？分别说明他们的作用机理？
3. 用Al2O3薄层层析分离并测定氨基蒽醌中的α-氨基蒽醌时，用环己烷：丙酮 (3:1) 的混合溶剂为展开剂。

你认为下列三种溶剂中选用那一种来溶解试样最为合适？为什么？吡啶、二氧六环、丙酮的沸点分别为116℃、101℃、56℃，溶剂的极性和试样在它们之中的溶解度依次递减。

在层析展开过程中又应该注意些什么？
4. 对于无色试样，应怎样把个组分的斑点显现出来？
5. 为什么从文献查得的值只能供参考?为了鉴定试样中的各组分，应该怎么办？
6. 影响R f值的因素很多，你能说出各种因素使R f值发生改变的原因吗？
7. 用薄层色谱扫描仪在薄层上直接扫定量的基本原理是什么？在这里能否应用朗白-比尔定律？为什么？应如何补救之？。