Western-blot实验操作步骤

Western-blot实验操作步骤
Western blot实验步骤
一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）
1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。

2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.
4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）
常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。

融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。

二、蛋白浓度测定(BCA法)
BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。

在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。

蛋白样品在什么溶液中，
标准品也宜用什么溶液稀释。

但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。

1.配置BCA工作液
A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本
2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。

（96孔板）,
总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。

96孔编号#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7
BSA标准
蛋白
0ul 1ul 2ul 4ul 6ul 8ul 10ul ddH2O 10ul 9ul 8ul 6ul 4ul 2ul 0ul
96孔待测
蛋白
样本1待测
蛋白
样本2
待测蛋
白样本
3
待测蛋
白样本
N
10ul/
well
3.37度，温箱中孵育30min。

562nm波长，测OD值。

待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。

根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul）
5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐）
绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值
插入—XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线—选项（显
示公式，显示R2，R2>0.99有意义）
三、蛋白变性
1.室温融解SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（溴酚蓝染料）（2x 或 5x）
2.将适量蛋白样本与SDS-PAGE上样缓冲液混合，使其终浓度为1x
3.100度或沸水煮3-5min，充分变性蛋白。

冷却至室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

或冷却后-80保存用于后续实验。

四、蛋白电泳
1．配胶：根据配胶试剂盒操作步骤,按照目的蛋白分子量大小，选择相应浓度的分离胶。

配胶时最后加10%过硫酸铵和TEMED.每板分离胶5ml，浓缩胶3ml.短板在内侧。

配好后如暂时不用，可将胶板取下，电泳液中浸泡，4度保存。

2.配电泳液 1x 甘氨酸-Tris电泳缓冲液1L
Tris 3.03g
甘氨酸 14.4g
SDS 1g
3.蛋白上样：样本10-30ul(保证蛋白质量最少为30ug) 20-25ul
蛋白Marker 5ul
选择较好的孔加样，并记录加样位置
4.连接电极，跑电泳：电泳条件 80V,30min(蓝色条带到达浓缩胶底部)---110V,90min(参考Marker的位置，蓝色条带跑到胶底部即可)
五、转膜
1.配转膜液：1L Tris 3.03g
甘氨酸14.4g,加水至800ml，最后加甲醇200ml，调至总体积为1L.
2.切胶：起胶时将胶留在长玻璃板上，将裁减好的膜做好标记后浸泡在转膜液中。

确定目的蛋白的位置（根据Marker条带），切胶，保留目的蛋白位置，将膜置于胶上，膜数字面在上，背面与胶相贴，数字标记端贴在Marker上。

3.准备转膜：按如下顺序
————————————阳极（红）
———————————滤纸
————————————膜
———————————胶
_______________________滤纸
———————————阴极（黑）
4.连接电极，转膜： 90V,90min
六、封闭
1.配封闭液：0.5g 脱脂奶粉 + 10ml PBS
2.取下膜，注意蛋白在膜与胶贴合的一面，取下后将膜有蛋白面朝下，封闭1小时
七、抗体孵育
配抗体稀释液：0.5g 脱脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS
配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS
一抗孵育，4度过夜
次日，洗膜液洗4次，每次5min，注意将有蛋白面朝下。

孵育二抗，
避光，30-60min(一般不超过60min),避光，洗膜4次，每次5min,将有蛋白面朝下。

PBS冲洗一次，洗掉Tween.准备扫描，将膜上有蛋白的一面朝下。