氟对不同发育时期中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性及安全浓度评价-修改20120620

氟对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性试验及安全浓度评价
杨电明，王宏元, 吴民耀*
陕西师范大学生命科学学院，西安 710062
摘要：氟与人体生命活动所需的重要元素之一，而过量的氟能够导致多种疾病。

随着工业化程度的不断提高，氟离子浓度过高已经成为水域污染中一种严重的污染物。

两栖类作为重要的水域环境评价生物，对水质的变化反应灵敏。

本试验以不同时期中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）的蝌蚪为试验材料，通过在水中添加不同浓度的氟化钠，研究不同发育时期的蝌蚪对不同氟离子浓度的耐受性和毒性效应；测出了不同发育时期蝌蚪对氟离子的半致死浓度（LC50)和安全浓度；并通过组织学方法对氟对蝌蚪肝脏的影响进行了研究。

研究结果表明，不同发育时期的中华大蟾蜍蝌蚪对氟离子的敏感性存在差异，并且存在明显的时间效应关系；氟能损伤蝌蚪的肝细胞。

关键词：氟离子；中华大蟾蜍蝌蚪；毒性；LC50
Acute Toxicity and Safety Assessment of Fluoride to Bufo gargarizans
Yang Dianming, Wang Hongyuan, Wu Minyao*
College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China
Abstract:Fluorine is an important element for human life activities. Excessive fluoride caused variety of endemic fluorosis. Fluoride ion must be considered as a serious pollutant since its concentration in many aquatic ecosystems is significantly increasing as a consequence of man's activity. Amphibian is an important evaluation life in aquatic environment that can responsive the changes of water quality. Safe concentrations (SCs) and LC50of fluoride ion for different developmental stages of Bufo gargarizans are estimated from short-term toxicity bioassays using different concentrations of sodium fluoride in the water. We also studied the influence of fluorine on the tadpole of liver using histological methods. The present study suggests that larval sensitivity is different at larval age and have a significant time dependent. Fluoride can damage the liver cells of the tadpole.
Keywords: fruoride; Bufo gargarizans; tadpole; toxicity; LC50
氟是动物及人体所必需的微量元素之一，一般以氟离子的形式广泛分布于自然界。

海水中氟的含量在1.2~1.5mg/L之间[1]，淡水中氟的含量为0.01~ 0.3 mg/L[2]。

在人体中，氟化物与人体生命活动密切相，主要表现在牙齿和骨骼组织的代谢过程，少量氟可以促进牙齿珐琅质对细菌酸性腐蚀的抵抗力，防止龋齿。

然而过量的氟会对动物和人体产生毒性作用，如氟斑牙、氟骨症等[3]，含量达到一定程度时甚至会导致动物的死亡。

庄平等[4]报道西伯利亚鲟仔鱼在400mg/L氟中暴露42h即开始死亡。

两栖类的幼体通常生活在水中，变态后则栖息在陆生环境或靠近陆地的浅水环境中，两栖类对水体环境中化学污染物非常敏感[5-10]。

中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）广泛分布于中国的大小水域，主要生活在河流、湖泊的靠岸浅水区，繁殖季节为2月到3月，蝌蚪期以藻类、腐殖质或一些植物为食。

目前氟对水生生物的安全浓度值还有很大的空白，为了保护水生生物资源免遭氟污染，需要进行氟对多种水生生物包括蝌蚪类的急慢性毒性研究，以丰富氟对水生生物的毒性数据，为氟对水生生物安全浓度的制定提供参考。

本试验以不同发育时期的中华大蟾蜍蝌蚪为试验材料，研究了氟对不同发育时期中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性，计算不同发育时期蝌蚪在不同时间内对氟离子的半致死浓度（LC50)并和安全浓度，并对36期蝌蚪肝脏组织进行切片和染色，旨在为建立保护两栖动物的水质标准提供理论依据。

随着工业和其他环境污染的加剧，我国及世界其它国家的部分水域中氟浓度已远远超过本试验所得的安全浓度，应引起高度重视。

1 材料和方法（Materials and methods)
1.1实验动物
实验所用的动物为中华大蟾蜍蝌蚪，2012年2月在陕西西安秦岭山下的小水塘中取中华大蟾蜍卵，将卵在实验室内发育，取不同发育时期蝌蚪进行试验。

23期中华大蟾蜍胚胎外鳃基部皮肤形成褶皱并向后遮盖外鳃；26期特点为后肢芽长度小于宽度的一半；30期特点为后肢芽长度是宽度的2倍；36期特点为后肢芽顶端出现三个缺凹，缺凹加深分化为三趾[11]。

1.2试验药品及溶液配制
试验所用化合物氟化钠（EC # 231-667-8）为分析纯，纯度在99%以上，购自Sigma化学试剂公司。

试验前用双蒸水配成1000mg/L F-的母液，试验开始时稀释成试验所需F-浓度的暴露溶液。

1.3试验条件
23、26、30期蝌蚪使用实验室室温（15±2）℃曝气3d 的自来水，36期蝌蚪分两组，分别使用曝气自来水和去离子水，试验所用容器为50cm*20cm*10cm（长宽高）的玻璃缸，每容器盛试验液2L，并在不同实验随机放入相应时期的蝌蚪，试验期间监测水质，水温（15±2）℃、DO≥7.0 mg/L、硬度（30±5 ）mg/L（CaCO3）、pH 值7.0 左右，试验期间不投饵，为保证试验浓度的准确性，每24h 更换全部试验液。

1.4实验方法
首先根据氟对其它蝌蚪毒性试验的相关研究及预试验结果设置10个浓度组，F- 浓度分别为350、400、450、500、550、600、650、700、750、800mg/L，另设自来水对照组，对照组不加入F- 。

暴露后前12小时每隔2h 观察1次蝌蚪行为、中毒症状及其死亡情况，暴露12h后，每隔6h观察1次，暴露72h后，每隔3h观察1次。

每24小时完全换水一次，实验过程中不给蝌蚪投食。

当蝌蚪沉于水底，用玻璃棒多次刺激蝌蚪的尾部，蝌蚪没有任何反应时就认为其死亡。

及时将死亡的蝌蚪捞出，避免蝌蚪皮肤分泌有毒物质对其他蝌蚪的影响，也避免同类相食对结果的影响。

记录24、48、72、96h 死亡蝌蚪数。

将36期对照组和800mg/L组蝌蚪进行解剖，取出肝脏进行石蜡包埋，对包埋组织块以6µm 厚度连续切片，进行HE染色，然后比较对照组和实验组肝脏细胞的差异。

在肝脏组织切片不同区域中选取多个相同面积，分别计数对照组和实验组的肝细胞数目，比较其细胞数目的差异。

1.5结果计算与数据统计
氟对中华大蟾蜍蝌蚪不同发育时期的安全浓度及95％置信区间采用多因素概率分析法(MPA)进行分析[12-13]。

本实验中利用蝌蚪在氟中暴露时间24h、48h、72h、96h 所引起的蝌蚪死亡数进行回归分析，得到不同发育时期蝌蚪在不同暴露时间下对氟的半数致死质量浓度（LC50）及95％置信区间[14]。

以时间为X轴，氟对蝌蚪的半致死浓度为Y轴建立线性回归方程，得出暴露时间与氟对蝌蚪半致死浓度的线性回归关系。

安全浓度为导致实验蝌蚪死亡率为0.01%的氟浓度，通过安全浓度SC = 应用系数（AF）x 96h LC50计算得出氟对中华大蟾蜍蝌蚪的AF[15-16]。

2 结果（Result)
4个不同发育时期的蝌蚪在对照组的整个试验过程中游动正常，无蝌蚪死亡；实验组中不同发育时期的蝌蚪在氟溶液中的表现情况大体相同，各实验组暴露2h左右即出现中毒症状，刚开始时表现为焦躁不安，部分蝌蚪游泳时出现不规则的转圈，稍后部分蝌蚪的活动能
力降低，游泳频率减缓，中毒程度随F-浓度的升高而明显加重。

4h后，700mg/ L ~ 800mg/ L 组蝌蚪在没受到外界刺激的情况下几乎没有游动情况。

12h后，23期蝌蚪的700mg/ L 组开始出现死亡，其他各期蝌蚪则是在600mg/ L组开始出现死亡。

死亡后蝌蚪沉于水底，身体皮肤溃烂严重。

各组实验过程中没有发生蝌蚪同类相食的现象。

本试验在水温（15±5）℃、DO≥7.0 mg/L、硬度（30±5 ）mg/L（CaCO3）、pH 值7.0 左右的条件下，得出氟对23、26、30、36期自来水暴露的中华大蟾蜍蝌蚪96h LC50和置信区间分别为：693.8（667.71~722.60）、580.81（561.22~600.37）、506.94（477.79~532.78）、557.70（537.75~577.69）mg/L，36期去离子水暴露的为502.58(484.72~520.26)。

不同发育时期蝌蚪在不同浓度F-溶液中暴露不同时间的LC50如表1所示。

由数据可知，23、26、30期蝌蚪的LC50逐随着发育时期的增加，不同暴露时间的LC50逐渐降低；36期自来水暴露蝌蚪的LC50比30期高，但是比23、26期低。

作为胚胎期的23期与刚转变为胚后期的26期相比，23期的LC50明显较高；36期自来水暴露蝌蚪与去离子水暴露蝌蚪相比，自来水暴露组在24h和48h的LC50低于去离子水暴露组，但72h和96h组高于去离子水暴露组。

同一发育时期，随着暴露时间的延长，LC50也逐渐降低，且呈明显的剂量效应关系（图1）。

暴露时间与氟对蝌蚪的半致死浓度之间的线性回归关系和可决系数R2，安全浓度SC及其95％置信区间以及AF如表2所示。

Spss16.0分析时，所有输出模型拟合优度检验结果X2均小于0.05，说明差异不显著。

由表2可知23、26、30期蝌蚪96h的SC随着发育时期的增加而逐渐降低；36期蝌蚪的SC比30期高，但是比23、26期的低；AF也表现出同样的趋势。

对36期蝌蚪肝脏组织进行组织切片观察显示，对照组肝脏组织结构正常，细胞排列紧密（图2 A）；实验组（800mg/L F- )肝细胞间出现大量明显的空泡，肝细胞核之间排列疏松（图2 B）。

单位面积内对照组肝细胞数目为32.20，而实验组肝细胞数目为26.00，实验组与对照组相比较，肝细胞的数量明显减少。

由此可见，氟对中华大蟾蜍蝌蚪肝脏组织具有一定的损伤作用。

表 1 四种不同发育时期蝌蚪在氟中不同暴露时间的LC50以及LC50的95%置信区间（36期蝌蚪分别在自来水和去离子水中暴露，其余时期蝌蚪在自来水中暴露）。

Table 1. LC50 values (mg/L F-) and their 95% confidence limits calculated for each test developmental stage groups after fluoride toxicity bioassays（Stage 36 exposured in the tapwater and distilled water, others exposured only in the tapwater）.
时期24h 48h 72h 96h
23 (自来水)
799.42
(766.95~853.76)
738.05
(715.57~766.72)
697.93
(670.84~728.26)
693.88
(667.71~722.60)
26 (自来水)
722.61
(695.57~757.24 )
644.63
(623.25~667.30)
615.55
(595.23~636.32)
580.81
(561.22~600.37)
30 (自来水)
702.27
(672.54~740.22)
552.14
(516.23~585.54)
521.97
(491.88~549.07)
506.94
(477.79~532.78)
36 (自来水)
627.05
(587.96~672.06)
592.38
(557.49~629.33)
557.70
(537.75~577.69)
557.70
(537.75~577.69)
36 (去离子水)
666.73
(608.17~728.61)
642.48
(564.73~732.71)
547.06
(527.70~566.26)
502.58
(484.72~520.26)
图 1 氟对四种不同发育时期中华大蟾蜍蝌蚪的LC50。

图中实心方块代表LC50，方块上下标尺为LC50的95%置信区间。

每个框中从左至右的方块和标尺代表着蝌蚪在氟中暴露24、48、72、96小时的LC50和LC50 95%置信区间。

Fig. 1. LC50 values of F- in test for the larvae of B. gargarizans at four developmental stage groups. Solid square and bars are LC50values and 95% confidence intervals, respectively. The LC50values and the 95% confidence intervals for 24-, 48-, 72-, and 96-h exposure periods are indicated from left to right in each box.
表 2 四种不同发育时期蝌蚪在氟中的回归方程和SC及95%置信区间。

回归方程中X:暴露时间；Y：LC50。

Table 2. Regression equation (X: exposure time; Y: LC50) and safe concentrations (SCs expressed in mg F-/L) and their 95% confidence limits estimated for each developmental stage groups. Application factors and R-square are also presented.
时期回归方程（96h）可决系数R2SC AF
23(自来水) Y= -1.49X+821.51 0.884 5.21（4.33~5.67）0.0075 26(自来水) Y= -1.89X+754.52 0.944 3.44（2.87~3.85）0.0059 30(自来水) Y= -2.57X+724.87 0.788 1.48（0.40~2.20）0.0029 36(自来水) Y= -1.01X+644.39 0.891 3.13（2.54~3.55）0.0056 36(去离子水) Y= -2.45X+736.68 0.953 3.08（2.54~3.45）0.0061
图2 36期中华大蟾蜍蝌蚪肝脏细胞的HE染色。

A：对照组(自来水)；B：实验组（800mg/L F- )。

Fig. 2. Histological section and HE staining of liver from a stage 36 tadpole of B. gargarizans. A: Control group (Tap water ) ; B: Experimental group (800mg/L F- ) .
图3 36期中华大蟾蜍蝌蚪肝脏组织对照组（0mg/L F- )和实验组（800mg/L F- )肝细胞数目的比较。

Fig. parison of the number of liver cells between the control group (0mg/L F- ) and experimental group (800mg/L F-) of B. gargarizans of stage 36.
3 讨论（Discussion)
急性毒性测验能够快速准确得到化学物质对水生生物的安全浓度，Chai [17 ]通过急性毒性测验研究了氟对36期蟾蜍蝌蚪的安全浓度。

本试验中对中华大蟾蜍蝌蚪暴露时间与氟半致死浓度进行线性回归分析，综合评价氟对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性。

通过24、48、72和96h 这四个暴露时间蝌蚪的死亡情况，选取导致0.01%蝌蚪死亡的浓度作为安全浓度，得到氟对23、26、30、36期中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度和AF值。

不同发育时期的中华蟾蜍蝌蚪对氟离子的安全浓度和AF值差异明显。

Saka[18]报道非洲爪蟾(Xenopus laevis) 和墨西哥钝口螈(Ambystoma mexicanum)两种两栖类幼体随着发育时期的增加对五氯苯酚钠（PCP-Na）的敏感性增强，LC50下降；Sanders [19]报道福勒蟾蜍(Bufo woodhousii fowleri)的幼体随着发育时期的增加对DDT的敏感性增
加；但是，Saka在对杀草丹（thiobencarb）的急性毒性测试中，五种不同的两栖类除了新孵出的幼体对杀草丹最具有抵抗力外，敏感度和蝌蚪的发育时间没有明显的关联[19]。

本实验可看，23、26、30期中华大蟾蜍蝌蚪随着发育时期的增加，96h LC50逐渐降低；36期自来水暴露蝌蚪的96h LC50比30期高，但是比26期低；36期去离子水暴露的蝌蚪的96h LC50比36期自来水暴露的低。

综上可见，不同发育时期的两栖类幼体对氟离子的敏感性存在一定的差异。

23期到30期蝌蚪在96h LC50的这种变化可能是由于蝌蚪发育过程中生理特征的变化造成的，随着蝌蚪的发育，对氟敏感的一些器官逐渐发育完全，从而对氟的耐受度逐渐降低；36期蝌蚪的96h LC50比30期高可能是由于36期蝌蚪解毒器官特别是肝脏的发育较30期有了一定的进步，使蝌蚪的解毒功能得到发挥，但由于肝脏的解毒能力有限，使得36期蝌蚪的96h LC50比23期和26期的低。

上述表明同一生物不同发育时期蝌蚪氟的安全浓度的差异与其内部器官的发育是密切相关的。

水的硬度也能影响氟对水生生物的毒性效应[21-22]。

本实验结果可见，36期蝌蚪暴露于自来水中的半数致死浓度为557.70mg/L ，高于去离子水中的半数致死浓度502.58mg/L 。

36期蝌蚪在去离子水的应用系数也显著高于自来水中。

以上的实验结果证实氟离子在自来水能够与水中的阳离子相结合，形成多种没有毒性的化合物，从而降低氟的毒性[5,22,23]。

而去离子水中缺少阳离子，氟离子的毒性效应就会增强。

因此，评价氟的安全浓度除了考虑不同物种的耐受程度，应该考虑不同水质也可能造成半数致死浓度的计量中出现差异。

当然在以往的急性毒性试验中，研究者在确定安全浓度时，AF的选取仅仅是基于96h LC50，其他一系列暴露时间的LC50被忽略掉，可能会导致化学物质的安全浓度被高估。

36期蝌蚪肝脏组织切片结果可见，实验组肝细胞之间具有较多的空泡，肝细胞数目显著地少于对照组。

说明在氟的急性毒性实验中，高浓度的氟对中华大蟾蜍蝌蚪肝脏组织具有一定的损伤作用，氟损伤会直接导致肝细胞数目的减少。

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