结直肠癌中S100A4的表达及意义
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结直肠癌中S100A4的表达及意义
任延松;王博;顾页;王倩;林洁
【摘要】目的探讨S100A4在结直肠癌组织及细胞系中的表达,并分析其与结直肠癌临床病理特征的相关性.方法采用免疫组化法检测65例结直肠癌及对应癌旁正常结直肠组织中S100A4蛋白的表达;分别采用RT-PCR法和Western blot法检测S100A4 mRNA和蛋白在7个人类结直肠癌细胞系中的表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果显示S100A4在多数结直肠癌细胞中均有表达.免疫组化检测结果显示S100A4阳性表达主要定位于结直肠癌细胞质内,结直肠癌组织中
S100A4蛋白阳性率高于癌旁正常结直肠组织(P<0.0001).S100A4蛋白表达与结直肠癌患者年龄、性别有关,高龄组阳性率高于低龄组(P=0.026),男性组S100A4蛋白阳性率高于女性组(P-0.038),其表达与肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移均无相关性(P>0.05).结论 S100A4在多数结直肠癌细胞中均有表达,在癌组织中的表达高于癌旁组织,S100A4蛋白表达与结直肠癌患者年龄、性别有关,可能为结直肠癌患者的个性化诊断及治疗提供指导.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)010
【总页数】5页(P1084-1088)
【关键词】结直肠肿瘤;S100A4;RT-PCR;Western blot;免疫组织化学
【作者】任延松;王博;顾页;王倩;林洁
【作者单位】南方医科大学基础医学院病理学系/南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系/南方医科大学南方医院病理科,广州
510515;南方医科大学基础医学院病理学系/南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系/南方医科大学南方医院病理科,广州510515;南方医科大学基础医学院病理学系/南方医科大学南方医院病理科,广州510515
【正文语种】中文
【中图分类】R735.3
结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤,在国内其发病率和病死率分别居第3位和
第5位[1,2]。
近年来,随着我国人民生活水平的提高,饮食习惯的改变,加之人
口老年化趋势的影响,结直肠癌的发病率和病死率均呈上升趋势,并且发病年龄逐年呈年轻化趋势。
因此深入研究结直肠癌的发病机制、寻找结直肠癌发生、发展的关键基因对于结直肠癌的早期诊断、有效治疗和预后指导具有重要意义。
本实验采用RT-PCR和Western blot法检测结直肠癌细胞系中S100A4 mRNA
和蛋白的表达。
采用免疫组化SP法检测65例结直肠癌组织及对应癌旁正常结直
肠组织中S100A4蛋白的表达,分析S100A4蛋白表达与结直肠癌临床病理特征
之间的关系。
以期明确S100A4在结直肠癌发生、发展中的意义。
1.1 细胞系和细胞培养将购自ATCC的人类结直肠癌细胞系SW620、SW480、LS174T、HT29、HCT116、LoVo和Colo205在37 ℃、5%CO2细胞培养箱内
培养,使用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Los Angeles, CA,Gibco公司),当细胞覆盖率接近80%~90%时用于RNA分离和蛋白质提取。
1.2 标本收集和分组选取2010~2011年在南方医科大学南方医院普外科接受常
规手术治疗的结直肠癌患者组织标本,癌组织和配对癌旁组织各65例,术后经病理检查证实。
其中65例结直肠癌组织中43例位于结肠,22例位于直肠,患者年龄16~84岁,中位年龄50岁,男性39例,女性26例,中+低分化腺癌41例,
高分化腺癌24例,有淋巴结转移者27例,无淋巴结转移者38例,患者术前均
未行放、化疗等抗肿瘤治疗。
所有用于检测的组织标本均与患者以书面形式签署南方医科大学南方医院的伦理协议。
所有组织标本手术切除后均经10%中性福尔马
林固定,常规脱水,石蜡包埋,3 μm厚连续切片。
1.3 RNA分离和逆转录使用Trizol试剂(Carlsbad, CA,Invitrogen公司)从7个上述细胞系中分离总RNA。
取0.8 μg总RNA加入Oligo dT引物和随机的6核苷酸引物配制20 μl体系,使用PrimeScript RT试剂盒(大连宝生物工程公司)在50 ℃的条件下行RT-PCR检测
30 min,在99 ℃的条件下5 min后终止。
1.4 RT-PCR 设计S100A4,上游引物序列:5′-TCAGAACTAAAGGAGCTGCTGACC-3′和下游引物序列:5′-TTTCTTCCTGGGCTGCTTATCTGG-3′,退火温度59 ℃。
内参为GAPDH,上游
引物序列:5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′,下游引物序列:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTTG-3′。
预期S100A4 mRNA长度为210 bp,GAPDH长度为580 bp。
1.5 Western blot 收集离心细胞后尽量吸取残留液体,使用冷PBS清洗2次,加入含1%PMSF的RIPA裂解液裂解,冰上孵育30 min。
在4 ℃、20 000 r/min
的条件下离心30 min,转移含蛋白质的上清液至新的EP管中,检测浓度后-80 ℃保存备用。
取50 μg蛋白样品电泳至10%SDS-PAGE凝胶电泳,后转膜至PVDF 膜(Immobilon P;Millipore, Bedford, MA)。
PVDF膜封闭在PBST配制的5%
脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h,4 ℃条件下过夜,室温孵育1 h后与一抗
S100A4(Abcam Ltd公司)和抗β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)识别,4 ℃条件下过夜,清洗,然后与HRP标记的二抗孵育1 h,清洗,使用增强
的发光液(Rockford, IL,Pierce公司)对S100A4蛋白表达进行检测。
1.6 免疫组化采用超敏SP免疫组化染色技术检测,染色步骤按照试剂盒说明书进
行。
操作前修复抗原,加入3‰过氧化氢室温孵育10 min,一抗为1 ∶500浓度稀释的兔抗人多克隆抗体S100A4(ab41532, Abcam Ltd公司),二抗为HRP标
记的1 ∶200浓度稀释的抗兔IgG (Glostrup, Denmark,Dako公司),使用辣根过氧化物酶显色试剂(福州迈新公司)进行DAB显色。
使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,使用福州迈新公司随试剂提供的已知阳性片为阳性对照。
由3名病
理医师采用双盲法对每一张切片进行全面观察,每例切片随机选取10个高倍视野(400倍),根据阳性细胞百分率以及显色深浅采用半定量积分法分级,评分标准如下:(1)阳性细胞百分率:未见阳性细胞者为0分,阳性细胞数<25%为1分,25%~75%为2分,>75%为3分;(2)着色强度:不显色或显色不清为0分,浅
黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。
将两项得分结果相加:0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中阳性(),5~6分为强阳性()。
阴性和弱
阳性判定为低表达,中阳性和强阳性判定为高表达。
1.7 统计学分析将所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,使用非参数检
验Wilcoxon Z检验和Mann-Whitney U检验,显著性水准取α=0.05(双侧)。
2.1 S100A4在结直肠癌细胞系中的表达 RT-PCR结果显示S100A4 mRNA在
SW620、SW480、HCT116、HT29、LoVo、Colo205中均阳性,在LS174T中阴性;Western blot结果显示S100A4蛋白在SW620、SW480、LS174T、LoVo中阳性,在HT29、HCT116、Colo205中阴性(图1)。
提示S100A4在多
数结直肠癌细胞中均有表达。
2.2 S100A4在结直肠癌组织中的表达 S100A4蛋白表达主要定位于细胞质,镜下观察肿瘤细胞胞质出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒状,染色明显高于背景为阳性。
在65例癌旁正常结直肠黏膜组织中,有42例S100A4蛋白不表达或阴性,细胞
质及细胞核均未见着色,有23例阳性,其中17例弱阳性,6例中等阳性;在65例结直肠癌组织中,有61例S100A4蛋白阳性,其中23例强阳性,28例中阳性,
10例弱阳性,有4例阴性(图2)。
S100A4蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常结直肠黏膜组织,两组相比差异有统计学意义(Z=7.923,P<0.001,表
1)。
2.3 S100A4与结直肠癌临床病理参数之间的关系 40例高龄组有35例S100A4
蛋白高表达,25例低龄组患者仅16例S100A4蛋白高表达,高龄组阳性率明显
高于低龄组,差异有统计学意义(P=0.026);39例男性组有34例高表达,26例
女性组有17例高表达,S100A4蛋白在男性患者中的阳性率明显高于女性患者,差异有统计学意义(P=0.038);S100A4表达与肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移
均无相关性(P>0.05,表2)。
S100A4基因也称为MTS1基因,20世纪80~90年代早期,从各种不同的细胞
系中分离出,属于S100家族[3]。
S100家族是一类钙离子结合蛋白,至少有21
种不同成员,相对分子质量低(9~13×103)[4,5],主要在细胞内以同源或异源二
聚体的形态存在[6]。
这些形态与其细胞外活动有关,虽然S100家族成员表现出
高度的序列和结构相似性,但功能各不相同,它们参与广泛的生物学过程,如肿瘤增殖、侵袭、转移、炎症和分化等[7],其中S100A4的异常表达被认为与肿瘤侵
袭和转移有关[8]。
S100A4蛋白由101个氨基酸组成,相对分子质量为1.1×104,人S100A4及其他14个S100基因家族成员定位于稳定性较差的1号染色体长臂2区1带(1q21)上[3]。
该区域结构极不稳定,有很强的变异性,这可能是
S100A4与结直肠癌的发生、发展密切相关的结构基础。
肿瘤的发生、发展是一个极其复杂的过程,越来越多的研究表明,S100A4基因表达与结直肠癌的发生、发展密切相关,S100A4阳性表达往往意味着预后不良,直接影响结直肠癌患者的生存率[9,10]。
S100A4的表达可见于多种人类肿瘤,研究表明S100A4蛋白在人类乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤组织中均有表达,并且在恶性肿瘤中的表达明显高于良性肿瘤和正常组织[11]。
大量研究表明,S100A4在结直肠癌中主要作用为调控侵袭能力。
Huang等[12]
通过RT-PCR和Western blot法分别比较S100A4在mRNA和蛋平在6个结直肠癌细胞系中的差别,结果显示S100A4表达高低与细胞系的侵袭能力大小一致(如在侵袭性最强的SW620中mRNA和蛋白表达最高),而敲除S100A4后大大
抑制肿瘤细胞的侵袭能力并且生长速度均明显下降;Kwak等[13-15]发现
S100A4在原发肿瘤肿瘤浸润深度更深、有淋巴结转移、有远处转移和高TNM分级的患者中表达更高,并且S100A4阳性意味5年复发率增加,5年生存率降低,提示S100A4表达是有关结直肠癌淋巴结转移和预后因素的重要生物标志物之一。
Boye等[16,17]通过免疫组化法发现只有S100A4定位于细胞核时才与淋巴结转移、肿瘤分级及神经侵犯有关,并且无转移生存率和8年总生存率降低,认为可能只
有细胞核表达的S100A4是不良生存率的独立预后因素。
S100A4对结直肠癌的诊断和治疗有着重要意义。
Dahlmann等[18]研究发现细胞外S100A4与其外分泌高级终产物受体(RAGE)间的交互作用增强了结直肠癌的侵
袭和转移能力,S100A4-RAGE相互作用介导S100A4相关的结直肠癌细胞的活
动性,因此在肿瘤进展早期阻滞目标RAGE或者S100A4-RAGE相关信号可能作
为限制S100A4阳性的结直肠癌转移的替代治疗。
Stein等[19]通过检测胃癌、结肠癌、直肠癌患者与正常志愿者的血浆S100A4,发现在各个肿瘤分期的肿瘤患者血浆的S100A4转录明显高于正常志愿者,并且高表达S100A4的患者治疗后更
易发生转移并且无病生存率显著降低,提出对血浆S100A4的检测可以早期确定
肿瘤分期并且评估转移的风险。
肿瘤细胞的生长和转移离不开血管为其输送养分,Ochiya等[20]研究发现在人前列腺癌细胞中敲除S100A4显著降低肿瘤血管形成,并长期抑制肿瘤生长,表明S100A4在血管内皮细胞中参与血管形成,可作为基
于内皮细胞的S100A4对肿瘤血管调控的治疗策略。
S100A4可能是通过活化PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路发挥其在结直肠癌
发展中的调控作用,如通过该通路直接诱导结直肠癌细胞生存、转移,并且结直肠癌中VEGF的上调和E-cad的下调均与该信号通路有关[21]。
进一步的研究表明可能只有定位于细胞核的S100A4对肿瘤有调控作用,其机制为S100A4在细胞核与野生型p53螯合,抑制p53依赖型细胞凋亡,促进细胞恶变[22,23]。
本组实验通过对结直肠癌细胞系中S100A4 mRNA和蛋白的表达进行检测,发现S100A4在多数结直肠癌细胞系中有表达;通过对结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的S100A4蛋白表达进行检测,发现S100A4蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,提示S100A4表达可能与结直肠癌发生、发展相关。
免疫组化结果显示S100A4表达与结直肠癌患者年龄和性别有关,S100A4蛋白在高龄组中的阳性率高于低龄组,男性患者的阳性率高于女性患者,S100A4在不同人群中的表达差异可能为肿瘤患者的个性化诊断和治疗提供指导。
本实验并未发现与肿瘤部位、分化程度及淋巴结转移之间的相关性,这可能是由于条件所限,所选取组织标本量并不足够多并且标本均来源于同一所医院,不能排除地域限制,需进一步实验论证。
林洁,女,副教授,硕士生导师,通讯作者。
E-mail:**************.cn
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