眼针疗法干预MCAO模型大鼠抗氧化机制的研究

眼针疗法干预MCAO模型大鼠抗氧化机制的研究

随着人口老龄化的加重，中风病发病率也随之提高，严重威胁着人类健康，探索中风病发病机制及有效防治方法成为医疗工作者的首要任务。眼针是以祖国医学脏腑经络理论为基础，根据眼球结膜上血管的形色变化，判断性质和部位，然后辨证针刺眼周特定穴位以治疗全身疾病。根据后天八卦将眼周分为八个区，再与五脏六腑联系起来，治疗急性缺血性中风时选取肝区、肾区、上焦区、下焦区以滋肾阴，清肝火，输通上下焦气机，活血通络，使病得愈。

眼针对于缺血性中风的疗效已为众人所承认，但其作用机制尚不清楚，本研究拟采用动物实验的方式，探索眼针对缺血性脑病的抗氧化作用机制。

1实验材料

1.1实验动物SPF级SD大鼠60只，购自中国医科大学，许可证号：SCXK （辽）2008-0005。大鼠购入后适应性饲养1w，1w后用于正式试验。大鼠饲养于通风干燥的环境中，室温（18±2）℃，相对湿度45%。常规颗粒饲料喂养，自由饮水，12h昼夜节律，更换1次/d垫料，以保证大鼠生存环境洁净。

大鼠体重均匀，均在（300±30）g范围，毛色纯白，富有光泽，活动度适中，晚间活动度增加，步态正常，行为学观察未见异常大鼠。

1.2仪器设备恒温水浴振荡器，SHA-B型，常州国华仪器设备厂生产。电子天平，JY5002型，0.01g～500g，上海精密科学仪器有限公司生产。电子天平，BS223S型，0.001g～220g，北京赛多利斯仪器系统有统公司生产。微量移液器，美国热电公司生产。紫外分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器设备有限公司生产。

1.3实验试剂及耗材MDA、SOD和GSH-PX测试盒购自南京建成生物研究所。针灸针购自成大方圆连锁药店（陵东分店）。冻存管、吸头、PCR管等耗材均购自沈阳博尔美生物有限公司。

2实验方法

2.1实验动物模型的复制

2.1.1脑缺血再灌注大鼠模型的复制参考马贤德[1]等人发表的”线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究”一文复制脑缺血再灌注大鼠模型。模型复制成功后，栓塞2h后，拔除栓塞线，进行再灌注，再灌注时间为72h。

2.1.2假手术组动物模型复制假手术组手术方式同模型组，但不做栓塞，仅暴露出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），然后逐层缝合即可。

2.2模型评价神经功能缺损评分：参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉完全清醒后进行评分[2]。0分：没有神经损伤；1分：对侧前爪不能自由伸展；2分：向对侧旋转；3分：向对侧翻到；4分：行走不自由，意识模糊。分值越高，说明动物所表现出的问题就越多。选取评分在1～3分的动物模型进行试验。

2.3实验分组及干预因素施加

2.3.1实验分组SPF级SD大白鼠60只，随机分为四组：空白对照组（10只），假手术组（10只），MCAO模型对照组（20只），眼针治疗组（20只）。

2.3.2各组干预因素施加空白对照组，常规饲养，不施加任何干预。假手术组，采用2.1.2中所述方法，复制假手术模型，模型复制后正常饲养，不做任何处理，模型复制后72h进行相关指标检测。MCAO模型对照组，采用2.1.1中所述方法，复制脑缺血再灌注模型，模型复制后，正常饲养，不做任何处理，于再灌注72h进行相关指标检测。眼针治疗组，采用2.1.1中所述方法，进行MCAO 模型复制，再灌注即刻开始进行针刺治疗，2次/d，连续3d。于再灌注72h进行相关指标检测。

2.3.3眼针取穴及刺法取13mm毫针，眼针组选定大鼠眶周2mm处进行针刺，选择的位置比对人体取穴措施[3，4]，选取肝区、上焦区、下焦区、肾区，见图1。采用针刺的手段：从眼眶边缘2mm部位进行平刺，左眼从顺时针方向（右侧按逆时针方向），从该穴区起始定位线向终止定位线进针，进行平刺操作，刺入真皮，达到皮下组织，进针3mm，到终止定位线为止。留针20min，留针10min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。

图1 眼针定位示意图

2.4指标检测

2.4.1死亡率和神经功能缺损评分观测各组大鼠模型复制成功后，进行再灌注前参考”神经功能缺损评分”标准进行行为学评分，以评价模型复制成功情况。末次针灸后，清点各组大鼠数量，计算总死亡率，并对各组大鼠再次进行神经功能缺损评分，统计分析组间差异。

2.4.2 各组大鼠血清中MDA、SOD和GSH-PX含量测定各组大鼠末次针灸后，以10%水合氯醛（

3.5ml/kg体重）腹腔麻醉，剖开腹部，经腹主动脉采血，静置1h后，2000转/min，离心10min，分离血清备用。

采用比色法对各组大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的含量进行测定。

2.5统计方法采用SPSS11.5统计软件分析，实验数据均采用”x±s “表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05被认为有显著性差异。

3结果

3.1死亡率和神经功能缺损评分结果空白对照组大鼠10只，除随机抽取1只，处死进行TTC染色外，无死亡大鼠，死亡率为0；假手術组大鼠10只，除随机抽取1只，处死进行TTC染色外，无死亡大鼠，死亡率为0；MCAO模型对照组大鼠20只，除随机抽取1只进行TTC染色，以及模型复制失败大鼠2只，剩余18只，至实验结束后，共计死亡7只，剩余11只，死亡率为38.9%；眼针治疗组大鼠20只，除随机抽取1只进行TTC染色，以及模型复制失败大鼠2只，剩余17只，至实验结束后，共计死亡4只，剩余13只，死亡率为23.5%，见表1。

空白对照组和假手术组大鼠末次针灸后，神经功能缺损评分均为0分，未见明显神经功能缺损体征。MCAO模型对照组大鼠神经功能缺损体征较为显著，其评分与其他三组比较，均有显著性差异（P＜0.01），见表2。3.2各组大鼠血清MDA、SOD和GSH-PX含量各组大鼠血清中MDA含量检测结果表明，与空白对照组和假手术组比较，其余两组大鼠血清中MDA含量均显著升高（P＜0.01），有统计学意义；与MCAO模型对照组比较，眼针治疗组大鼠血清中MDA含量显著减少（P＜0.01），有統计学意义。

各组大鼠血清中SOD和GSH-PX含量检测结果表明，与空白对照组和假手术组比较，其余两组大鼠血清中SOD、GSH-PX含量显著减少（P＜0.01），有统计学意义；与MCAO模型对照组比较，眼针治疗组大鼠血清中SOD、GSH-PX 含量显著增加（P＜0.01），有统计学意义，见表3。

4讨论

自由基可使细胞中的蛋白质、核酸等大分子物质发生交联反应，有损生物膜，细胞的功能也将受到影响。抗氧化系统存在于机体内，能够相互排除自由基，使脂质过氧化物的生成减少，为了自由基在人体内生成，以及人体内自由基的清除处于动态平衡。需借助于如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶，但在缺血再灌注条件下，机体会产生大量的自由基，使其生成与清除平衡失控，造成组织的损伤。通过氧化反应造成细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸的过氧化是自由基，导致磷脂结构产生变异，膜遭受一定程度的创伤，这样导致神经细胞功能受到连锁反应的是生成的脂质过氧化物经过氧化酶催化生成MDA。清除机体自由基的主要类是超氧化物歧化酶（SOD），间接反映脑组织并且消除自由基的功能是靠SOD活性高低程度；脑组织中氧自由基含量的变化，及脂质过氧化程度和脑细胞损伤程度由丙二醛（MDA）是脂质代谢产物，其含量间接反映。机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。GSH-Px酶系的组成成分是硒，催化GSH变为GSSG，是GSH-Px酶系的生成部分，它的作用能使有毒的过氧化物变成无毒的羟基化合物，而且还可以让H2O2得到有效的分解，以此维护细胞膜的组织及能力免遭过氧化物的影响。硒半胱氨酸为GSH-Px的活性中心，反映机体硒水平靠其活力大小。催化GSH产生GSSG是谷胱甘肽过氧化物酶，而