211132690_不同生物型牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞后免疫相关基因表达谱分析

·研究论文·
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报摘 要：为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）感染细胞后的免疫相关基因在不同时间差异表达，以及细胞病变型（CP ）和非致细胞病变型（NCP ）牛病毒性腹泻病毒感染MDBK 细胞后免疫相关基因表达差异及功能，本研究采用基因表达谱芯片技术，将BVDV NM01株和JL 株分别接种MDBK 细胞，同时设正常细胞对照，分别将接种48 h 、72 h 和96 h 后的细胞和对照细胞收集，提取总RNA ，进行免疫相关基因扫描分析。

实验结果显示：BVDV 感染后48 h ，MN01株病毒感染细胞有9个基因上调，1个基因下调；JL 株有3个基因上调，3个基因下调；感染后72 h ，MN01株病毒感染细胞有33个基因上调，14个基因下调；JL 株有15个基因上调，8个基因下调；感染后96 h ，MN01株病毒感染细胞有43个基因上调，30个基因下调；JL 株有7个基因上调，7个基因下调。

通过研究不同生物型BVDV 感染MDBK 细胞后相关免疫基因表达情况，为进一步了解BVDV 感染细胞的免疫机理提供了线索。

关键词：BVDV NM 01株；BVDV JL 株；不同生物型BVDV ；免疫相关基因表达谱中图分类号：S858.23
文献标志码： A
文章编号：1674-6422（2023）01-0153-06
Analysis of Immune Related Gene Expression Profi les in MDBK Cells Inoculated
with Different Biotypes of Bovine Viral Diarrhea Virus
MA Yanhua 1,2, ZAN Xiaohui 1, WANG Yan 1, WU Youzhi 1, WANG Jialei 1, GUO Li 3, WANG Wei 1
(1. State Key Laboratory of reproductive regulation and breeding of grassland livestock, School of life sciences Inner Mongolia University, Hohhot 010020, China; 2. College of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China; 3. Institute of special
animal and plant sciences, CAAS, Changchun 132109, China )
收稿日期：2020-08-19
基金项目：内蒙古自治区科技重大专项资助项目（30500-5203902）；国家自然科学基金资助项目（31960696） 作者简介：马艳华，女，博士，主要从事动物疫苗与免疫学研究
通信作者：王炜，E-mail：**************；郭利，E-mail：*****************
不同生物型牛病毒性腹泻病毒感染MDBK 细胞后
免疫相关基因表达谱分析
马艳华1,2，昝晓慧1，王 岩1，武有志1，王镓磊1，郭 利3，王 炜1
（1.内蒙古大学生命科学学院 草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室 呼和浩特010020；2.内蒙古医科大学
基础医学院 呼和浩特010080；3.中国农业科学院特产研究所，长春132109）
2023,31(1):153-158Abstract: In the present study, gene expression profi le chip technology was used to study the expression levels of immune related genes in different times in MDBK cells inoculated with CP and NCP Bovine viral diarrhea viruses (BVDVs). The infected cells and non-infected control cells were collected at 48, 72 and 96 hours post inoculation. The total RNA samples were extracted and the immune related genes were scanned and analyzed. Results showed that at 48 hours post infection, 9 genes were up-regulated and 1 gene was down regulated in NM 01 virus infected cells while 3 genes were up-regulated and 3 genes down-regulated in JL virus infected cells. Subsequently at 72 hours post infection, 33 genes were up-regulated and 14 genes were down regulated in NM01 virus infected cells while 15 genes were up regulated and 8 genes were down regulated in JL virus infected cells. At 96 hours post infection, 43 genes were up-regulated and 30 genes were down regulated in NM 01 virus infected cells, 7 genes were up regulated and 7 genes were down regulated in JL virus infected cells.
· 154 ·中国动物传染病学报2023年2月
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea/ mucosal disease virus, BVDV）属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）成员，与猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）和边界病毒（Border disease virus, BDV）在同一属。

病毒基因组为单股正链RNA，基因组全长约12.5 kb，根据病毒基因组5'UTR区差异，将病毒分为BVDV1和BVDV2两种基因型[1]。

根据BVDV感染细胞后能否产生细胞病变，将BVDV分成两种不同的生物型，致细胞病变型（Cytopathogenic, CP）和非致细胞病变型（Noncytopathogenic, NCP）[2]。

文献报道，这两种生物型病毒均可感染免疫细胞和非免疫细胞，感染宿主后，会引起不同的免疫应答[3]。

MDBK细胞是国际上用于BVDV研究、生产的常见细胞系。

已有研究表明，BVDV感染MDBK细胞后，不同的毒株可产生不同的生物表型。

本研究利用基因芯片手段，检测两种不同生物型BVDV感染MDBK细胞后，细胞的免疫相关基因表达情况，为进一步研究不同生物型病毒感染宿主细胞后的免疫应答提供线索。

1 材料与方法
1.1 病毒和细胞 cpBVDV NM01株、ncpBVDV JL株和MDBK细胞，由华威特（江苏）生物制药有限公司惠赠。

1.2 主要试剂和仪器RNA提取试剂盒为QIAGEN RNeasy® Mini Kit，基因表达杂交试剂盒与其他主要基因表达试剂、基因芯片及G2505C扫描仪均购自Agilent。

1.3 实验设计与分组 将BVDV NM01株F7代与JL株F7代病毒按MOI为0.03接种已长成良好细胞单层的MDBK细胞，同时设正常细胞对照组。

每个样品设3个重复。

分别在感染后48 h、72 h和96 h取样，分别提取总RNA进行分析。

1.4 病毒总RNA的提取与纯化 将样品按照mirVana TM RNA Isolation Kit试剂盒说明书提取总RNA。

用QIAGEN RNeasy® Kit试剂盒说明书纯化总RNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度计在260 nm和280 nm测定吸光度来测定RNA浓度及纯度，并用RNA Lab-Chip Kit通过Agilent 2100分析仪进行微流体分析，检测RNA的完整性。

1.5 芯片扫描与分析 用预杂交液在60℃条件下孵育30 min进行cRNA片段化，再冰浴1 min。

弃杂交液，加入杂交混合液于65℃、以10 rpm滚动杂交17 h，取出芯片洗涤1 min，再将芯片37℃洗涤1 min。

将处理的样品置Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5 μm，扫描仪自动以100%和10%PMT各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并。

1.6 差异筛选用2way-ANOVA分方法进行分析，表达差异显著（P<0.05）。

用Ingenuity Pathway Analysis软件（IPA，）分析表达基因的生物学功能。

2 结果
2.1 总RNA提取及质量检测本次检测病毒感染细胞和正常对照细胞的RNA的纯度检测值为1.9~2.1，RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）均≥8.7且28s/18s≥0.7，符合试验要求。

2.2 基因芯片质量控制 杂交芯片上每一个亮点代表荧光信号点。

荧光信号点距分布均匀、规则，亮度适中。

这表明该扫描图无非生物学因素对试验数据
造成的误差，芯片杂交效果良好。

图1 芯片信号扫描情况
Fig.1 Chip signal scanning
The expression levels of immune related genes in MDBK cells infected with CP and NCP BVDV virus, we could further understand the immune mechanism.
Key words: BVDV strain NM01; BVDV strain JL; immune related genes expression profi le
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马艳华等：不同生物型牛病毒性腹泻病毒感染MDBK 细胞后免疫相关基因表达谱分析第31卷第1期2.3 差异筛选
2.3.1 病毒感染MDBK细胞48 h基因表达情况2.3.1.1 NM01株感染后基因表达情况 NM01株感染MDBK细胞后48 h，上调表达9个基因，其基因代码为APOE 、CCL3、CD86、CXCL8、ISG15、
PLAU 、PLAUR 、SERPINE1、TNF ，这些基因主要
功能是调控细胞代谢，增强炎症反应，抗原提呈细胞膜蛋白，与相关分子结合激活T细胞反应，激活干扰素。

其中CXCL8、ISG15这两个基因上调表达最高，CXL8基因编码蛋白为趋化因子，是介导炎症反应的主要因子之一。

ISG15功能主要是介导细胞信号转导，抗病毒感染。

下调表达1个基因，其基因代码为ITGAM 。

研究表明，NM01株感染MDBK细胞后48 h，上调和下调的基因均促进了细胞免疫应答反
应（图2）。

图2B V DV NM01株感染MDBK 细胞48 h 基因表达及其
功能
Fig.2 Gene expression of MDBK cells infected by BVDV
NM01 after 48 h
2.3.1.2 JL株感染后基因表达情况 JL株感染MDBK细胞48 h，免疫相关基因上调表达3个，其基因代码分别为APOE 、CAMP 、SFTPD ；下调表达基因3个，其基因代码分别是IL18、LUM 、TNFSF8。

APOE 基因编码的蛋白功能为调节细胞代谢，该基因表达上调，抑制了细胞的免疫应答。

其他两个上调表达的基因CAMP 基因编码抗菌肽，SFTPD 基因编码的蛋白均参与细胞的免疫反应，这两个基因上调表达均促进了MDBK细胞相关免疫应答。

下调表达基因
IL18编码参与炎症反应的细胞因子，可能刺激γ-干
扰素的产生，LUM 基因编码的小分子蛋白参与细胞的修复等，TNFSF8编码蛋白为肿瘤坏死因子配体，参与调节免疫。

上述3个基因的下调抑制了感染细胞
的免疫应答（图3）。

图3 BVDV JL 株感染MDBK 细胞48 h 基因表达及其功能Fig.3 Gene expression of MDBK cells infected by BVDV
JL after 48 h
2.3.2 病毒感染MDBK细胞72 h基因表达情况2.3.2.1 NM01株基因表达情况 NM01株感染MDBK 细胞后72 h，免疫相关基因上调33个，上调基因中AGER为细胞表面免疫受体，ANPEP 编码的蛋白功能未知，BATF3编码的蛋白抑制白细胞介素2的转录，CASP8编码的蛋白在细胞凋亡中起重要的作用，CCL19编码蛋白为抗病毒作用，CCR7编码的蛋白可能与B淋巴细胞功能有关，CD40是肿瘤坏死因子受体，CD44编码一种细胞表面糖蛋白等。

CH25H参与胆固醇和脂质代谢；CSF2编码集落刺
激因子，是粒细胞和巨噬细胞的分化和活化的重要因子；ETS1编码转录因子；F3编码一种膜表面糖蛋白，凝血因子；FYN 编码一种蛋白酶；ICOS 、
ISG15编码蛋白具有抗病毒作用；TNFRSF11B 编码
的蛋白为肿瘤坏死因子受体，增强T细胞活性等作用。

下调基因14个，其中C3为补体组分，参与激活补体系统；CD47编码一种膜蛋白，作为受体参与信号转导；CD86为抗原递呈细胞表达的一种膜蛋白，与CD28结合激活T细胞；HGF 、CTSS 编码一种溶解酶，参与溶解外来抗原，供MCHⅡ识别；IL2RA 编码白细胞介素2受体的α链；IRF8编码干扰素调控因子；ITGB2编码整合素β链，参与细胞黏附参与信号传导；NOD2编码蛋白识别胞内菌，激活NFKB；
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NOS2编码一氧化氮合酶，参与抗病毒、抗癌等生物介质。

PLP1编码一种跨膜蛋白，髓磷脂的主要成分；RAPGEF3功能未见报道；SOCS3编码一种细胞因子转导信号抑制因子；STAT3编码STAT蛋白，在细胞生长或细胞凋亡起重要作用。

2.3.2.2 JL株基因表达情况 JL株接种72 h上调基因15个，下调基因8个。

上调基因中CCL21、ICOS、ISG15、MAPKAPK2、PRKAA1、SELPLG、TLR7、WNT5A等基因对免疫反应具有促进作用。

其中CCL21是与趋化因子相关基因，ISG15编码蛋白是干扰素刺激基因，具有抗病毒作用。

ANPEP、HMGB1、IL10、IL10RA4等上调基因对细胞免疫应答具有抑制作用。

CD79A、LGALS1、SEMA4A基因在免疫应答中的作用未知。

下调基因中ILRAP对免疫反应具有促进作用；IL6ST、IL7、CD180、SFTPA1、SPIC具有抑制作用。

与NM01株感染MDBK细胞72 h基因表达相比，ANPEP、ICOS、IL10RA、ISG15、LGALS1、SELPLG、TLR7基因均上调表达，这些基因功能均与细胞的代谢调控有关，与外源病毒感染相关。

2.3.3 感染96 h基因表达情况
2.3.3.1 NM01株基因表达情况 当CP型病毒感染MDBK细胞感染96 h时，43个免疫相关基因表达上调，在上调表达基因中，CCR7、CXCL8、CSF2、ISG15、TNFRSF11B上调最为明显，其中CCR7编码的蛋白为G蛋白受体，是趋化因子受体之一，介导病毒与B淋巴细胞活化；CXCL8编码的蛋白为趋化因子，介导炎症反应；CSF2编码集落刺激因子，是粒细胞和巨噬细胞的分化和活化的重要因子；ISG15编码蛋白是干扰素刺激基因，具有抗病毒作用；TNFRSF11B编码的蛋白为肿瘤坏死因子受体，增强T细胞活性等作用。

30个基因下调，对下调明显的37个基因进行免疫功能影响分析显示，当NM01株感染细胞后，下调的基因均促进了细胞的免疫应答，上调的基因同样促进了细胞的免疫应答。

2.3.3.2 JL株基因表达情况 NCP型BVDV JL株感染MDBK细胞96 h后，7个基因上调，基因代码是CD28、IL10RA、IL1B、IL1RAP、THY1、PTX3、SPIC。

其中CD28编码蛋白与T细胞增殖具有紧密的关系，其表达上调促进细胞免疫应答；IL10RA蛋白是白细胞介素10的受体，是白细胞介素10的负调控信号，在JL株感染MDBK细胞后，该基因表达上调，抑制细胞的免疫应答；IL1B是白细胞介素1家族成员，主要介导炎症反应。

IL1RAP，白细胞介素1受体，白细胞介素1通过与其结合而发挥功能，该基因上调，抑制细胞的免疫应答；PTX3和SPIC基因编码蛋白功能暂时未知，但在NM01株感染MDBK细胞后，该基因促进细胞的免疫应答；THY1编码细胞表面免疫球蛋白、黏附素，促进细胞免疫应答。

7个基因下调ADORA2A、CCL3、CD180、DEF6、LCN2、SPI1、TAP1。

其中ADORA2A编码一种膜蛋白受体，用于激活胞内信号通路，其下调抑制免疫应答；CCL3编码蛋白介导炎症反应，下调抑制免疫应答；CD180编码一种细胞表面分子，属病原分子模式受体，下调抑制细胞的免疫应答；DEF6编码鸟苷酸交换因子，其下调表达，促进细胞的免疫应答；LCN2编码一种转运蛋白，基因下调表达抑制细胞的免疫应答；SPI1编码一种转录因子，有利于B细胞的活化，基因下调抑制细胞免疫应答；TAP1编码一种运转蛋白，其下调对JL株感染MDBK 细胞作用未知。

3 讨论
本研究用MDBK细胞作为研究BVDV与宿主细胞互作机理的模型，通过对不同生物型BVDV感染MDBK细胞后的免疫相关基因差异表达分析发现，与正常细胞相比，不同生物型BVDV感染MDBK细胞后，免疫相关基因均存在上调和下调表达现象。

其中NM01株CP型BVDV感染MDBK细胞后，相关基因上调数量和下调的数量均明显的高于NCP型JL 株病毒感染MDBK细胞后的基因表达。

NM01株感染MDBK细胞后，其免疫相关基因的上调和下调均促进细胞的免疫应答，而NCP型JL株感染MDBK细胞后，上调和下调的基因中一部分促进了细胞的免疫应答，一部分基因抑制了基因的免疫应答，这种现象可能与NCP型病毒在感染细胞后可以逃避宿主的免疫应答有关，为研究NCP型病毒的免疫抑制和持
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马艳华等：不同生物型牛病毒性腹泻病毒感染MDBK 细胞后免疫相关基因表达谱分析第31卷第1期续性感染提供思路。

本研究发现，NM01株和JL株在感染MDBK细胞后48 h，APOE 基因均出现了表达上调，已有研究报道，APOE 基因其编码的蛋白功能主要参与调节细胞的代谢功能，JL株感染导致该基因上调，抑制了细胞的免疫应答。

NM01株感染后，APOE 基因上调表达却促进了细胞的免疫应答。

这种现象说明不同生物型病毒感染同样的细胞后，细胞的复制、代谢均有所不同，其进一步的机理有待于研究。

丝裂原活化蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2, MAPKAPK2）基因所表达的蛋白是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的重要节点。

该基因编码的蛋白参与细胞增殖、分化、凋亡等[4]，并且与机体感染和炎症反应具有一定的联系。

本研究发现，在NM01株感染MDBK 细胞后96 h，该基因明显上调，而JL株感染后却没有表达，该基因在不同生物型病毒感染细胞中的作用尚待研究。

许多研究表明，只有NCP型BVDV感染牛后能形成持续性感染，持续性感染后免疫相关基因的表达存在一定的差异，细胞免疫应答由趋化因子和干扰素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）引起。

本研究中，当NCP BVDV感染MDBK细胞48 h 后，免疫相关基因APOE 、CAMP 、SFTPD 上调表达；72 h后 ANPEP 、CCL21、CD79A 、HMGB1、
I L 10、I C O S 、I L 10R A 、I S G 15、L G A L S 1、MAPKAPK2、PRLAA1、SELPLG 、SEMA4A 、TLR7、WNT5A 上调表达。

ISG15和TLR7两个基
因出现表达上调情况，促进了细胞的免疫应答作用，这与Smirnova报道的持续性感染动物1型干扰素和ISG15报道的基因表达上调结果一致[5]。

与此同时，下调基因中ILRAP 对免疫反应具有促进作用，
IL6ST 、IL7、CD180、SFTPA1和SPIC 基因对细胞的
免疫应答具有抑制作用。

病毒在感染细胞后的不同时间，其基因的表达有所不同，这也说明，当病毒感染机体后，机体会随着病毒感染的程度和时间不同，表达不同的基因。

Weiner等[6]报道，外周血淋巴细胞感染NCP型BVDV后32 h，其IFN-β、ISG15、RIG1、CXCR4、CXCL12、CD8 的mRNA表达浓度
增加。

另外，用NCP型病毒攻毒后产生持续性感染的牛血清培养外周血淋巴细胞也发现，CXCR4、RIG1和ISG15的mRNA浓度增加。

有研究表明，通过检测持续性感染牛外周血的相关免疫基因的表达情况发现，与健康牛相比，TLR7、IFN-α和IFN-β基因表达上调，MX1、ISG15、IRF3和IRF7表达下调[7]。

这种差异可能是由于淋巴细胞感染与上皮细胞感染基因表达不同所致。

前期研究发现，白细胞介素1（IL-1）在不同的生物型病毒感染细胞后有不同的作用[8]。

CP型BVDV和NCP型BVDV感染宿主后均可造成抗原递呈细胞表达和分泌的细胞因子改变甚至导致细胞死亡或凋亡，但不同生物型病毒感染导致机体产生的免疫学反应有所不同。

体外感染实验中，CP型病毒感染巨噬细胞可产生1型干扰素，NCP型病毒感染巨噬细胞则不产生1型干扰素[9]。

当用CP型病毒和NCP型病毒分别感染单核细胞和树突状细胞时，分别表现出不同的生物学特性，单核细胞和树突状细胞在感染CP型病毒时，单核细胞被诱导凋亡，树突状细胞则不出现病变。

同样在体内试验研究表明，这两种病毒感染病毒后分别造成不同的免疫学反应，CP型病毒感染机体后偏向与产生细胞免疫，伴随着IL-2的上调，而NCP型病毒感染后则产生体液免疫，下调IFN-γ。

其中IFN-γ的表达下调是目前研究表明造成机体持续性感染的重要原因。

NCP型和CP型病毒在感染单核细胞后，IL1β、TNF α和IL6基因下调，但其在不同生物型感染后蛋白表达量有一定的不同[10]。

Toll样受体在细胞识别病原、激发产生天然免疫具有重要的作用，Toll样受体通过与病原相关分子模式作用，启动免疫应答抵抗病原感染，其作用机制包括启动细胞内抗病毒通路，产生干扰素或其他炎性分子[11]。

本研究发现，NM01株和JL株感染MDBK细胞后72 h，TLR7基因表达均上调；感染96 h后，NM01株病毒TRL7表达上调，而TRL4表达下调。

Franchini等[12]研究发现，牛巨噬细胞感染BVDV后，用Real-time方法检测TLR2、TLR3和TLR4表达情况，TLR4表达量上调，该结果与本研究有一定的差异。

研究表明，TLR4的表达与宿主识别细胞外病原菌的脂多糖有关，其表达量提高可能
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与牛在感染BVDV后，机体免疫抑制，继发细菌感染所致[13]。

通过不同生物型BVDV感染细胞的基因表达研究，探索更多差异表达基因的生物学功能和基因之间的关系，以及寻找MDBK细胞在BVDV感染后相关应答基因和信号分子的种类和表达水平，将是后续研究工作的重点，其最终目的是寻找出与BVDV 感染直接相关的抑制基因或信号分子，对了解病毒的致病机制和药物的开发等具有重要的意义。

参考文献
[1] R idpath J F, Bolin S R. Differentiation of types 1a, 1b and
2 bovine viral diarrhoea virus (BVDV) by PCR[J]. Mol
Cell Probes, 1998, 12(2): 101-106.
[2] R idpath J F, Bolin S R. The genomic sequence of a
virulent bovine viral diarrhea virus (BVDV) from the type
2 genotype: detection of a large genomic insertion in a
noncytopathic BVDV[J]. Virology, 1995, 212(1): 39-46.
[3] Peterhans E, Jungi T W, Schweizer M. BVDV and innate
immunity[J]. Biologicals, 2003, 31(2): 107-112.
[4] Gorog A, Jabr R I, Tanno M, et al. MAPKAPK-2
modulates p38-MAPK localization and small heat shock protein phosphorylation but does not mediate the injury associated with p38-MAPK activation during myocardial ischemia[J]. Cell Stress Chaperones, 2009, 14(5): 477-489.
[5] Smirnova N P, Webb B T, Bielefeldt-Ohmann H, et
al. Development of fetal and placental innate immune responses during establishment of persistent infection with bovine viral diarrhea virus[J]. Virus Res, 2012, 167(2): 329-336.
[6] Weiner C M, Smirnova N P, Webb B T, et al. Interferon
stimulated genes, CXCR4 and immune cell responses in peripheral blood mononuclear cells infected with bovine
viral diarrhea virus[J]. Res Vet Sci, 2012, 93(2): 1081-1088.
[7] W eng X G, Song Q J, Wu Q, et al. Genetic characterization
of bovine viral diarrhea virus strains in Beijing, China and innate immune responses of peripheral blood mononuclear cells in persistently infected dairy cattle[J]. J Vet Sci, 2015, 16(4): 491-500.
[8] J ensen J, Schultz R D. Effect of infection by bovine viral
diarrhea virus (BVDV) in vitro on interleukin-1 activity of bovine monocytes[J]. Vet Immunol Immunopathol, 1991, 29(3-4): 251-265.
[9] Brackenbury L S, Carr B V, Stamataki Z, et al.
Identification of a Cell Population That Produces Alpha/ Beta Interferon In Vitro and In Vivo in Response to Noncytopathic Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. J Virol, 2005, 79(12): 7738-7744.
[10] Lee S R, Pharr G T, Boyd B L, et al. Bovine viral diarrhea
viruses modulate toll-like receptors, cytokines and co-stimulatory molecules genes expression in bovine peripheral blood monocytes[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2008, 31(5): 403-418.
[11] Zhang E, Lu M. Toll-like receptor (TLR)-mediated
innate immune responses in the control of hepatitis B virus (HBV) infection[J]. Med Microbiol Immunol, 2015, 204(1): 11-20.
[12] Franchini M, Schweizer M, MäTzener P, et al. Evidence
for dissociation of TLR mRNA expression and TLR agonist-mediated functions in bovine macrophages[J].
Vet Immunol Immunopathol, 2006, 110(1-2): 37-49. [13] Schaut R G, McGill J L, Neill J D, et al. Bovine viral
diarrhea virus type 2 in vivo infection modulates TLR4 responsiveness in differentiated myeloid cells which is associated with decreased MyD88 expression[J]. Virus Res, 2015(208): 44-55.。