紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化苏志芳;包阿东;李亚珍
【摘要】[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达栽体.[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA 序列,并将目的片段插入表达载体pBll21的相应位置,构建植物表达载体
35S∶∶MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∶∶MsCOL1转化到拟南芥中.[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆.经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达.[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∶∶ MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】3页(P1610-1611,1668)
【关键词】紫花苜蓿;拟南芥;转基因;MsCOL1
【作者】苏志芳;包阿东;李亚珍
【作者单位】河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000
【正文语种】中文
【中图分类】S541+.1
有关植物开花时间的分子生物学研究，在模式植物拟南芥上已经进行得相对全面、深入。

在调控拟南芥开花时间的光周期途径中，CONSTANS(CO)基因的表达控制拟南芥感知日照时间的长短，在连接光信号与生物信号过程中起关键性作用，该基因编码一个含有锌指结构的核蛋白[1]。

当植物受到长时间光照时，CO基因的mRNA表达量增加[2]。

CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其转录因子能促进植物开花。

在拟南芥开花时间有关基因调控研究中，CO基因突变体能使开花时间延迟，通过调节增加CO基因的表达，可以使FT基因的表达量提高，使植物开花行为提前发生[1]。

但是在CO基因的同源基因COL的表达模式中，功能有所差异。

过表达COL1基因只能使其昼夜节律明显缩短，但对植物开花时间
没有产生干扰；COL2基因的表达量对植物开花时间没有干扰[4]；COL3基因的表产物对红色波长信号敏感，并且能使根部细胞生长加快[6]。

COL9基因的超量表
达能使植物延迟开花[5]。

相关研究结果表明，通过转基因方法将拟南芥CO基因
导入马铃薯中进行过表达，使马铃薯的带花现象延迟[7]。

此外，水稻中的一个CO 的同源基因OsCO3在水稻中过表达时能导致水稻开花推迟[8]。

在植物生长发育中，开花时间是一个非常重要的生理事件。

开花时间受到多种基因调控。

已克隆的与开花时间相关基因仅在拟南芥、水稻等少数几种植物中成功获得。

通过对这些基因进行分析，种间的CO基因存在较高的保守性，但其在作用机理上却存在较大差异。

此外，由于CO基因在植物中属于一个包含多拷贝的基因家族，这个家族中其他拷贝的基因是否与调控开花时间有关还不是很清楚，故仍需深入研究。

为了揭示植物开花时间的调控基因网络，需要对开花时间相关基因的作用机理及互作模式进行深入研究。

转基因技术是通过构建使目标基因过量表达的DNA载体，将其转化到植物体内实现基因功能。

笔者将构建的紫花苜蓿MsCOL1基因过量表达载体，应用农杆菌转化法获得拟南芥转基因植株，以期为研究该基因的功能奠定基础。

1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒。

大肠杆菌菌株为E.coli DH5α，购自上海申能博彩生物科技有
限公司；克隆载体 pMD19-T与植物表达载体pBI121，由内蒙古巴彦淖尔市农科院畜牧所惠赠；农杆菌菌株GV3101，实验室保存。

1.1.2 主要试剂。

限制性内切酶、T4DNA连接酶及DNA回收试剂盒，均购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，购自北京天根生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法
1.2.1 引物设计。

根据NCBI(DQ661682)序列MsCO1基因，使用Primer Premier5.0设计1对引物，CO1-f和CO1-r用于MsCOL1基因DNA片段扩增，序列如下：
CO1-f：ccctctagaATGGCTACTAAGCTATGTGATTC
CO1-r：cccggatccTCAACAGGAAGGAACGACGCCG
1.2.2 pMD-MsCOL1表达载体构建。

利用总RNA试剂盒，提取紫花苜蓿总RNA，经2%的琼脂糖凝胶检测浓度和质量均可用后，使用Primerscrip反转录试剂盒合成第一链cDNA。

以此为模板，以CO1-f和CO1-f为引物，扩增紫花苜蓿MsCOL1序列，反应条件为：预热94 ℃，10 min；变性94 ℃，30 s；复性
36 ℃，60 s；延伸72 ℃，90 s；33个循环；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分
析后，用PCR纯化试剂盒进行纯化，连接到pMD19-T Vector，转化E.coli
DH5α，涂布在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基上，于37 ℃培养24 h，挑选单克隆菌落，PCR检测后，将阳性克隆送至北京三博远志测序。

克隆载体命
名为pMD-MsCOL1。

1.2.3 MsCOL1基因表达载体构建及鉴定。

利用质粒小提试剂盒，对含有正确MsCOL1基因序列的大肠杆菌，提取质粒，使用XbaI和BamHI双酶切，经凝胶
电泳检测分别回收目的片段后，使用T4连接酶16 ℃连接6 h后，转化感受态大
肠杆菌DH 5α，在含有50 mg/L卡纳霉素的LB固体培养基上划线培养，挑取单
克隆菌落，进行PCR鉴定，以CO1-f和CO1-r为引物；然后将含有目的条带的
菌液送至北京三博远志测序鉴定。

构建的植物表达载体命名为35S∷MsCOL1。

1.2.4 农杆菌介导法转化拟南芥及其鉴定。

提取35S∷MsCOL1质粒并纯化，用CaCl2冻融法将重组子导入农杆菌GV3101中，菌液PCR筛选阳性克隆。

利用花序浸泡法，对处于花蕾期的野生型拟南芥进行农杆菌介导的转化，具体步骤为：将已经长出腋生花序的拟南芥植株在含有pBI-NCED4的农杆菌菌液浸泡约5 min，罩上塑料袋，在恒温箱中放置，暗培养24 h，一周后再次浸入农杆菌悬浮液浸染，温室中待拟南芥生长成熟。

收集拟南芥种子，在无菌条件下，将拟南芥种子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸馏水清洗，然后均匀撒在含有50 mg/L卡那霉素
1/2Ms培养基上。

15 d后，选取正常生长的拟南芥幼苗，转移到土中，继续生长。

1.2.5 再生植株检测。

采用CTAB法提取抗性苗基因组DNA，以CO1-f和CO1-r 为引物，以基因组DNA为模板进行PCR检测。

2.1 紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体构建及鉴定以紫花苜蓿第一链cDNA为模板，以引物CO1-f和CO1-r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，
得到的片段大小与预期结果一致(图1)。

PCR产物分别用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD19-T载体连接。

转化后，挑取阳性克隆鉴定并测序。

分
析测序结果显示，所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。

用XbaI和BamHI对pMD-MsCOL1双酶切，将回收的目的片段与进行相同酶切处理并回收的pBI121载体上，将连接产物转化大肠杆菌，构建载体命名为
35S∷MsCOL1。

以待检测的菌液为模板，以引物CO1-f和CO1-r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，得到预期大小的电泳条带(图2)。

提取质粒，用XbaI和BamHI对35S∷MsCOL1双酶切，得到预期大小的电泳条带(图3)。

结果
表明，已经成功构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体。

2.2 表达载体转化农杆菌的菌液PCR鉴定提取植物表达载体质粒DNA，转化农杆菌GV3101感受态细胞，在YEB固体培养基上筛选转化子，所用抗生素及浓度如下：利福平(Rif)100 μg/ml，卡那霉素(Km)20 μg/ml，壮观霉素(Sp)25 μg/ml，挑取单菌落在含有相同抗生素的YEB液体培养基中摇菌，以CO1-f和CO1-r为引物，对所得到的菌液进行PCR检测。

PCR产物经凝胶电泳检测显示得到的条带大小与预期大小一致，阴性对照无条带(图4)，证明表达载体35S∷MsCOL1已成功转入农杆菌GV3101中。

2.3 再生植株的鉴定提取再生植株基因组DNA，以CO1-f和CO1-r为引物进行PCR扩增，结果显示4株再生植株含有相应大小的目的片段(图5)，而未转基因的拟南芥植株则未显示条带。

说明4株再生植株已经成功转入目的基因。

CO基因已经在很多植物中扩增和鉴定出来，已经鉴定出来的CO基因能够影响植物开花时间。

周光辉等构建了
具有发夹结构的RNAi载体pART-S-A使紫花苜蓿的MsCOL1基因表达量有所下降[9]。

张威威等构建了银杏pCAMBIA1304-GbCOab表达载体，用转基因来研究CO基因功能是一种常用的方法，该方法已经在很多实验中得到应用[10]。

试验为了构建MsCOL1基因超表达载体，通过PCR扩增的方式在目的基因开放阅读框两端分别引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点，保证了连接方向的准确性。

将分离到的基因构建表达载体转入拟南芥中进行过量表达，得到成功转化的转基因苗，进一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。

试验采用农杆菌介导的方法转化拟南芥，并通过PCR反应与未转化的植株对比验证，结果显示所转化的4株全部为阳性，证实目的基因已转入拟南芥基因组中。

研究将构建的MsCOL1基因过量表达载体导入拟南芥中，得到转基因植株，对该基因功能的研究具有重要的价
值。

【相关文献】
[1] ROBSON F，COSTA M M R，HEPWORTH S R，et al.Functional importance of conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants[J].The Plant Journal，2001，28(6)：619-631.
[2] SUAREZ-LOPEZ P，WHEATLEY K，ROBSON F，et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J].Nature，2001，410(6832)：1116-1120.
[3] LEE H，SUH S S，PARK E，et al.The AGAMOUS-LIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J].Genes Dev，2000，14(18)：2366-2376.
[4] LEDGER S，STRAYER C，ASHTON F，et al.Analysis of the function of two circadian-regulated CONSTANS-LIKE genes[J].Plant J，2001，26(1)：15-22.
[5] CHENG X F，WANG Z Y.Overexpression of COL9，a CONSTANS-LIKE gene，delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2005，43(5)：758-768.
[6] DATTA S，HETTIARACHCHI G H C M，DENG X W，et al.Arabidopsis CONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J].The Plant Cell Online，2006，18(1)：70-84.
[7] GONZLEZ-SCHAIN N，SUREZ-LPEZ P.CONSTANS delays flowering and affects tuber yield in potato[J].Biologia Plantarum，2008，52(2)：251-258.
[8] KIM S K，YUN C H，LEE J H，et al.OsCO3，a CONSTANS-LIKE gene，controls flowering by negatively regulating the expression of FT-like genes under SD conditions in rice[J].Planta，2008，228(2)：355-365.
[9] 周光辉，杨青川，张铁军，等.紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化[J].中国草地学报，2013，35(4)：7-12.
[10] 张威威，宁迎晶，陈柳吉，等.银杏CONSTANS基因植物表达载体构建[J].生物技术，2010，20(6)：8-10.。