Alu家族在法医DNA分析中的应用

Alu家族在法医DNA分析中的应用
赵贵森;常林;莫耀南
【摘要】Alu家族是灵长类特有的短散在重复序列,在人类基因组内含量丰富,分布广泛,甲基化程度高,有种属特异性和插入变异,为法医DNA分析面临的许多问题提供了潜在的解决途径.目前,Alu元件在法医DNA分析中的应用包括:DNA定量、种属鉴定、种族鉴定、性别鉴定、个体识别和亲子鉴定,以及全基因组扩增等.本文总结各种基于Alu元件的法医DNA分析技术的原理和特点,探讨Alu元件的法医学研究和应用前景,供相关学者参考.
【期刊名称】《法医学杂志》
【年(卷),期】2010(026)001
【总页数】4页(P47-50)
【关键词】法医遗传学;Alu元件;综述[文献类型]
【作者】赵贵森;常林;莫耀南
【作者单位】中国政法大学证据科学教育部重点实验室,北京,100088;河南科技大学法医学院,河南,洛阳,471003;中国政法大学证据科学教育部重点实验室,北
京,100088;河南科技大学法医学院,河南,洛阳,471003
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.2
Alu家族是灵长类基因组内最具特征性的短散在重复序列（short interspersed repetitive elements，SINEs）。

人Alu元件由两个不完全对称的单体组成，总长
度约300bp，在170bp左右有一个限制性内切酶AluⅠ的酶切位点。

Alu是人类
最活跃的遗传元件之一，从灵长类动物进化的早期开始，Alu元件通过逆转录转座机制在基因组内快速扩增，目前在单倍体基因组中重复高达100万次，约占整个
基因组的10%以上[1-4]。

Alu元件以不同密度分散于基因组中，拷贝间的平均距
离只有4 kb，实际上可能更加密集[5]。

基于Alu元件的普遍性、多样性和特异性，在基因组学、基因工程、遗传、进化、肿瘤、发育衰老、基因表达调控等众多生命科学领域，Alu家族不仅是研究的热点，也是重要的研究工具[1-5]。

在法医学领域，学者们已经根据Alu元件的特点设计了众多的技术方案，用于DNA定量、种属鉴定、种族鉴定、性别鉴定、亲子鉴定、全基因组扩增等[6-11]。

本文系统总结了各种基于Alu元件的法医DNA分析技术的原理和特点，探讨Alu元件的法医学研究和应用前景。

各种现场检材提取的DNA，在遗传标记分析前常需要进行定量，以确定合适的检
验策略。

常用的紫外分光光度法、荧光或化学染料法等对检材需要量大，而且没有种属特异性，不能用于Chelex法提取的单链DNA[12]。

Alu元件有种属特异性，在人类基因组内含量丰富，以Alu元件为靶标，用特异性寡核苷酸做探针或引物
对现场检材提取的DNA进行评估，可以实现对其中人源DNA的高灵敏度精确定量[12-14]。

基于Alu元件的DNA定量方法有杂交法和PCR法两大类。

杂交法以Promega
公司的AluQuant人类DNA定量分析系统为代表[13]。

与一般狭缝（slot blot）杂交不同，AluQuant系统为液相杂交，相对简单省时，定量的线性范围为0.5～50ng。

作为商品化的DNA定量试剂盒，AluQuant系统在PCR定量法普及以前，在法医DNA分析实验室曾经广为采用。

基于Alu-PCR的DNA定量方法较多，有灵长类特异、人特异，以及性别特异等
多种[12-14]，各种方法的特异性主要取决于引物的设计。

灵长类特异的PCR方案
以整个Alu家族为靶标，覆盖范围广，灵敏度高，但不能区分人和非人的灵长类
动物。

人特异的PCR方案以进化上出现较晚的、人类特异的Alu-Y亚族为靶标，可以排除其他灵长类动物DNA的干扰。

性别特异的PCR方案以X和Y染色体上
固定的Alu插入序列（AluSTXa和AluSTYa）为靶标，可以分别对混合斑中的男
性和女性DNA进行定量估计，在性犯罪案件的DNA分析中有重要意义[6]。

从技术角度看，基于Alu-PCR的DNA定量技术有inter-Alu PCR和intra-Alu PCR两大类，两者均可以采用荧光染料终点法或实时定量PCR法[13]。

后者操作
方便、精确度高、客观性强，随着实时定量PCR设备和技术的普及，逐渐占据主
要地位[15]。

Alu定量法的主要缺点是不能对样品中的线粒体DNA进行精确估计。

由于不同细胞的线粒体拷贝数可能差异很大，核DNA与线粒体DNA的比例不定，对需要进行线粒体DNA分析的样品，需要其他方法的补充。

种属鉴定是法医物证检验的一个重要步骤。

虽然当前主流的STR遗传标记分型系
统本身有种属特异性，但经济、简便、快速的种属鉴定仍然对后续分析有重要指导意义。

同时，当代法医物证检验对象由人向动物、植物、微生物的拓展，也对种属鉴定提出了更高的要求[6，14]。

传统的种属鉴定依赖于血清学、生物化学、形态
学方法，其灵敏度、鉴别能力等局限性日益明显。

DNA的种属试验灵敏度高、与现行的物证鉴定技术和设备兼容性强、鉴别能力高，日益受到重视。

目前已有多种基于DNA分析的种属鉴定技术，常见的靶点有Alu、28SrDNA、细胞色素B基
因等。

Alu是最早用于DNA种属鉴定的靶点[14]。

基于Alu的种属鉴定也有杂交法和PCR法两大类，目前主要为PCR法，而且往往兼具上述定量的功能[6]。

早期的Alu种属鉴定技术一般仅为灵长类特异的，扩增后需用电泳法分离检测，灵敏度低。

后期以Alu的Yb8、Yd6亚族为靶标，特异性强，可以用荧光读数盘或实时法检测，灵敏度高达10～100pg[14]。

目前，根据Alu-PCR鉴定人DNA的原理，学
者们已经根据各种动物的Alu同源序列或类似的SINEs序列，设计了具备各种分
类层次（门、纲、目、科、属、种）特异性的SINEs种属鉴定系统，不仅可以鉴
定人与非人，而且可以确定为何种动物，在微量生物性检材的来源鉴定和肉类食品的禽畜成分鉴定中发挥着日益重要的作用[6]。

当代社会人口流动性强，种族混居现象明显，确定现场人体微量组织、斑痕检材的种族来源对缩小嫌疑人排查范围、争取破案时机无疑有重要意义。

到目前为止，用于种族鉴定的DNA遗传标记系统有线粒体、Y染色体、STR、SNP、转移因子等，其中以基于SNP的方法最为成功[8，16-17]。

美国DNAPrint基因组公司（Sarasota，FL）研发的SNP种族鉴定系统已经有商品化的试剂盒供应，并成功用于一些案件的侦破[8]。

但SNP、STR等遗传标记存在非同源相似遗传，即具有相同遗传标记组合的群体，起源可能不同。

Alu多态性基因座因Alu元件在基因组内特定位置的插入而产生，相同等位基因的来源也相同，一般不存在非同源相似遗传[6]。

在人类各种族分支分离后，仍然不
断地发生Alu插入事件，并在各自的基因库中积累下来。

这些新插入的Alu元件，多数存在种族间的差异，是应用价值很高的种族标记。

在一项法医学者和司法机构联合进行的盲测中，根据100个Alu插入多态性基因座分型结果，应用Structure 2.0软件，对全部被测个体都做出了准确的种族推断。

该软件甚至可以上溯3代，发现混血个体[8]。

根据亚族特异性的Alu插入多态性，进一步推断某种族个体的
亚族或地区归属的研究目前也已经开展起来[6]。

总的来说，与SNP等其他方法相比较，Alu元件用于种族推断有其显著特点和优势。

但目前仍处于研发阶段，尚无商品化的试剂盒供应，在如何实现高灵敏、高通量复合扩增等方面有待继续探索。

现有的各种商品化法医DNA分型试剂盒中都包含有性别基因座，且均为Amelogenin。

但由于部分个体的Y染色体存在Amelogenin片段缺失现象，该
方法有误判男性为女性的可能[18]。

因此，有必要探讨其他性别鉴定技术作为补充
方案。

X和Y染色体上特异的Alu元件为两种性染色体的鉴别，也即性别鉴定提供了一种替代途径。

在一项应用AluSTXa和AluSTYa进行的性别测试中，对来自不同群体的778名个体均实现了准确的性别鉴定[19]。

结合应用Alu和Amelogenin两种性别鉴定技术，只有两个基因座同时发生突变才会影响结果，可以确保性别鉴定的准确性。

Alu元件是人类基因组内最活跃的遗传元件，据最近Cordaux等[3]的估计，平均每20个出生的人中就有一个新的Alu插入。

因此Alu变异不仅存在于种族之间，也存在于不同层级群体内的个体之间，从而可以作为遗传标记用于个体识别和亲子鉴定。

人类基因组内多数的Alu在灵长类进化早期就已经插入，但人猿分离进化后插入的Alu就有5000～7000个，其中约25%有多态性，是潜在的遗传标记[10]。

在法医DNA分析技术发展的早期，Alu插入多态性曾经作为遗传标记被用于个体识别和亲子鉴定，但由于其与SNP一样为二态变异系统，很快即为飞速发展的STR标记所掩盖 [10，20-21]。

但随着技术进步和新知识的积累，Alu多态性因其独具的特点正在重新受到重视，未来可能与SNP一样成为STR系统的重要补充[6，10]。

法医DNA分析中经常遇到微量、痕量或非人DNA污染的现场检材。

在分型前放大可用的模板量，以及从含有动物、微生物DNA的样品中分离人类DNA片段是解决此类问题的途径之一[15]。

Alu元件有种属特异性，在基因组内分布广泛，以与Alu保守序列互补的寡核苷酸做引物，可以对微量或混合样品中的人类DNA进行选择性扩增富集[9，22]。

Inter-Alu PCR是最早诞生的全基因组扩增技术（whole-genome amplification，WGA）之一，在基础研究领域曾经广泛用来进行人类DNA片段的分离，但由于扩增的不均衡性，容易造成等位基因的丢失，在法医DNA分析领域较少应用[22-23]。

但为现在的各种WGA方法奠定了理论和技术基础，对当前WGA技术的法医学应用有重要的参考意义。

DNA甲基化是一种复制后共价修饰，主要见于CpG二核苷酸中的胞嘧啶上。

人
类基因组甲基化水平有随年龄下降的趋势，是分子年龄推断的潜在途径之一。

但基因组总甲基化水平检测影响因素多，技术灵敏度低，实用意义有限[24-26]。

人类基因组的甲基化水平主要取决于重复序列的甲基化情况。

Alu家族重复序列富含CpG二核苷酸，Alu-CpG约占人类DNA潜在甲基化位点的1/3[27-28]。

理论上，Alu元件的甲基化情况是基因组甲基化水平的良好代表，Alu甲基化水平与基因组甲基化水平之间的相关性已为众多研究证明。

同时，衰老性低甲基化主要是由重复序列CpG逐渐去甲基化造成的[27-29]。

重复序列甲基化程度随年龄下降的趋势已经为部分研究所证实，其中Alu元件的变化幅度最大、规律性最好[29]。

因此，Alu元件甲基化水平可能是一种比较理想的分子年龄标记。

综合上述，Alu元件的特点为我们解决一系列法医DNA分析问题提供了潜在的途径，可能是法医学者至今关注最多的基因组靶点之一。

但目前Alu元件在法医DNA分析实践中的应用并不多，还没有基于Alu的法医DNA分析商品化试剂盒
问世。

虽然针对Alu某一特点的法医学应用研究较多，但缺乏整合性、系统性的
研究，不能充分挖掘Alu元件的特点，因此不能充分体现Alu元件在解决法医DNA分析问题中优于其他DNA标记的优势。

目前，上述问题已经受到国际法医
学者的关注并有一些新的尝试和探索[6，10]，例如：整合Alu可以用于DNA定量、性别鉴定和种属鉴定的特点，建立多功能的检测系统，可以一步实现种属、性别特异的DNA定量；筛选建立一个从种属、种族、亚族到群体、亚群体、性别，具有不同层次特异性的Alu标记组成的系统，最大程度地提供犯罪者的身份特征，有效缩小嫌疑人范围；开展Alu标记检测技术与现有DNA分析系统和设备的兼容性、互补性研究，开展Alu标记与SNP等其他DNA标记的联合应用研究等。

我们期待着Alu家族新技术、新应用的诞生，推动现有法医DNA分析系统的完善
和发展。

【相关文献】
[1]Comeaux MS，Roy-Engel AM，Hedges DJ，et al.Diverse cis factors controlling Alu retrotransposition：what causes Alu elements to die?[J]. Genome Res，2009，19（4）：545-555.
[2] Bennett EA，Keller H，Mills RE，et al.Active Alu retrotransposons in the human genome[J].Genome Res，2008，18（12）：1875-1883.
[3] Cordaux R，Hedges DJ，Herke SW，et al.Estimating the retrotransposition rate of human Alu elements[J]. Gene，2006，373：134-137.
[4] Wang J，Song L，Gonder MK，et al.Whole genome computational comparative genomics： A fruitful approach for ascertaining Alu insertion polymorphisms[J]. Gene，2006，365：11-20.
[5] 罗迪贤，李凯，何淑雅，等.Alu家族及其生物学意义[J].遗传，2005，27（2）：284-288.
[6] Ray DA，Walker JA，Batzer MA.Mobile elementbased forensic genomics[J].Mutat Res，2007，616（1-2）：24-33.
[7] Sifis ME，Both K，Burgoyne LA.A more sensitive method for the quantitation of genomic DNA by Alu amplification[J].J Forensic Sci，2002，47（3）：589-592.
[8] Ray DA，Walker JA，Hall A，et al.Inference of human geographic origins using Alu insertion polymorphisms[J].Forensic Sci Int，2005，153（2-3）：117-124.
[9] Lasken RS，Egholm M.Whole genome amplification：abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens[J].Trends Biotechnol，2003，21（12）：531-535. [10]Kass DH，Jamison N，Mayberry MM，et al.Identification of a unique Alu-based polymorphism and its use in human population studies[J].Gene，2007，390（1-2）：146-152.
[11]Thomas E，Herrera RJ.Multiplex polymerase chain reaction of Alu polymorphic insertions[J].Electrophoresis，1998，19（14）：2373-2379.
[12]Nicklas JA，Buel E.Quantification of DNA in forensic samples[J].Anal Bioanal Chem，2003，376（8）：1160-1167.
[13]Walker JA，Kilroy GE，Xing J，et al.Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction[J].Anal Biochem，2003，315（1）：122-128.
[14]Walker JA，Hughes DA，Anders BA，et al.Quantitative intra-short interspersed element PCR for speciesspecific DNA identification[J]. Anal Biochem，2003，316（2）：259-269.
[15]Giardina E，Pietrangeli I，Martone C，et al.Whole genome amplification and real-
time PCR in forensic casework[J].BMC Genomics，2009，10：159.
[16]Rowold DJ，Herrera RJ.Inferring recent human phylogenies using forensic STR technology[J].Forensic Sci Int，2003，133（3）：260-265.
[17]Tripathi M，Tripathi P，Chauhan UK，et al.Alu polymorphic insertions reveal genetic structure of north Indian populations[J].Hum Biol，2008，80（5）：483-499.
[18]Chen AP，Chen Y，Wang HP，et al.Types and frequencies of variants in Amelogenin gene in Chinese population[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2007，24（6）：615-619.
[19]Hedges DJ，Walker JA，Callinan PA，et al.Mobile element-based assay for human gender determination[J]. Anal Biochem，2003，312（1）：77-79.
[20]Novick GE，Gonzalez T，Garrison J，et al.The use of polymorphic Alu insertions in human DNA fingerprinting[J].EXS，1993，67：283-291.
[21]Novick GE，Novick CC，Yunis J，et al.Polymorphic human specific Alu insertions as markers for human identification[J]. Electrophoresis，1995，16（9）：1596-1601.
[22]Nelson DL，Ledbetter SA，Corbo L，et al.Alu polymerase chain reaction：a method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86（17）：6686-6690.
[23]Sun G，Kaushal R，Pal P，et al.Whole-genome amplification：relative efficiencies of the current methods[J]. Leg Med（Tokyo），2005，7（5）：279-286.
[24]Wojdacz TK，Hansen LL.Techniques used in studies of age-related DNA methylation changes[J].Ann N Y Acad Sci，2006，1067：479-487.
[25]尹慧，黄代新，翟仙敦，等.HPLC法检测人外周血5-mC含量及其与年龄相关性研究 [J].中国
法医学杂志，2007，22（1）：8-11.
[26]Schmeling A，Geserick G，Reisinger W，et al.Age estimation[J].Forensic Sci Int，2007，165（2-3）：178-181.
[27]Schulz WA，Steinhoff C，Florl AR.Methylation of endogenous human retroelements
in health and disease[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2006，310：211-250.
[28]Choi SH，Worswick S，Byun HM，et al.Changes in DNA methylation of tandem DNA repeats are different from interspersed repeats in cancer[J].Int J Cancer，2009，125（3）：723-729.
[29]Bollati V，Schwartz J，Wright R，et al.Decline in genomic DNA methylation through aging in a cohort of elderly subjects[J].Mech Ageing Dev，2009，130（4）：234-239.。