三聚氰胺测定不确定度评估报告

HPLC法测定奶粉中三聚氰胺含量的不确定度评估
1.目标
为了三聚氰胺测量方法的优化和更准确地评价三聚氰胺的结果，采用B类评定方式确定该方法的相对不确定度。

2.测定程序
2.1.方法依据：GB/T 2388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰安检测方法》
2.2.样品提取
称取3g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL 乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。

上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待测净化液。

2.3.净化
将待净化液转移至固相萃取柱（BESEP HR-XC）中。

依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。

整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。

洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

2.4.液相色谱条件
a)C18柱，250m m×4.6mm×5um
b)离子对试剂缓冲溶液-乙腈（88+12，体积比）。

c)流速：1.0mL/min
d)柱温：40℃
e)波长：240nm
f)进样量：20uL
2.5.标准曲线的绘制
2.5.1.标准储备液的配制
准确称取0.2330g三聚氰胺标准品于50mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为464ug/mL的三聚氰胺标准储备液。

2.5.2.标准工作液
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度分别为0.8、2、20、40、80ug/mL的标准工作曲线，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度做标准曲线，得到标准曲线回归方程。

具体配制过程见下表：
表1 标准工作液配制过程
标准工作液浓度（ug/mL ）
稀释过程
吸取液浓度（ug/mL ） 吸取量（mL ）
定容体积（mL ）
80 464 1.725 10 40 80 5 10 20 80 2.5 10 2 80 0.25 10 0.8
80
0.1
10
3. 建立数学模型
试样中三聚氰胺结果计算公式如下：
f
m V C X ⨯⨯⨯⨯=
1000
1000
式中：
X ——试样中三聚氰胺的含量，单位是毫克每千克（mg/kg ）； C ——样液在标准曲线所读的浓度值； V ——样液最终定容体积，单位为mL ； m ——试样的质量，单位为克（g ）； f ——稀释倍数。

4. 分析确定不确定度的来源
从测量过程和数学模型分析，影响三聚氰胺含量的测量不确定度主要来源于：体积的相对不确定度()rel u v 、质量的相对不确定度()rel u m 、标准溶液校准的相对不确定度()rel u c 和前处理影响因子的相对不确定度()rel u f 。

体积的相对不确定度()rel u v 是由人员、温度和量具本身影响的；质量的相对不确定度()rel u m 是由称量过程中人员和天平本身影响而导致的；标准溶液校准的相对不确定度()rel u c 是由工作曲线的非线性、标准溶液的不确定度影响；前处理影响因子的相对不确定度()rel u f 是由仪器不稳定性、前处理和其他因素影响。

详细如图一鱼骨图所示。

图一 鱼骨图
)(C u rel （曲线校准） )(f u rel （前处理影响因子）
工作曲线拟合 定容过程 配制容器校准 标准物质称量 稀释过程
标准溶液的不确定度 仪器测试的影响
)(X u r e l 样品中三聚氰胺含量
测量重复性 测量重复性
实验室温度波动 可读性（电子天平的量化误差） 器具校准的不确定度 天平校准产生的不确定度
()r e l u v (体积) ()r e l u m （样品质量）
5. 计算不确定度分量
5.1. 由标准曲线求得样液中三聚氰胺的浓度引入的标准不确定度u （Cx ） 5.1.1. 配制标准工作溶液引入的不确定度 5.1.1.1. 标准物质引入的标准不确定度u （p ）
根据标准物质证书给出的信息，三聚氰胺标准物质的相对不确定度为0.5%，参考文献[3]中由于标准证书给出无法定量的限值，因此按矩形分布处理：
3
%5.0)(=
p u rel =0.00289
5.1.1.2. 标准物质称量引起的标准不确定度
准确称取0.2330g 标准品，根据电子天平检定证书，0≤m ≤5g ，天平最大允差为：0.0005g ，按均匀分布考虑，3
0005
.0)(1=
m u =2.89410-⨯g ，天平重复性误差：±0.0001g ，
5
210
77.53
0001
.0)(-⨯==
m u ，称量引入的标准不确定度2221)()()(m u m u m u +=总=0.0003，
相对不确定度2330
.00003.0)(=
s rel m u =0.00129。

5.1.1.3. 配制工作液配制过程中量器校准引入的不确定度
标准溶液配制过程中使用了一系列量器，容量瓶按均匀分布计算，移液器不确定度按照正态分
布计算。

如表2所示：
表2 玻璃量器校准引入的标准不确定度
玻璃量器 最大允差 标准不确定度 相对标准不确定度
50mL 容量瓶
0.05mL
0.0289 =1u 0.000577 10mL 容量瓶B 级（使用5次） 0.04mL 0.023 =2u 0.0023
5mL 移液器（使用2次） 0.005 0.00289 =
3u 0.000577
1mL 移液器（使用2次）
0.002
0.00116
=4u 0.00116
2
4
2
32
22
11225)(u u u u V u s rel ⨯+⨯+⨯+=
=0.0055
5.1.1.4. 标准工作液配制过程中人员读数引起的不确定度)(2s V u
参考文献[3]中有关数据，人员读数允许有1%的不确定度即0.01V ，按三角分布考虑，则人员每次读数引起的相对不确定度为
00408.0601.0=V
V 。

配制标准工作液使用玻璃量器6次，
因此人员读数引入的相对标准不确定度为：
00999
.000408
.06)(2
2=⨯=
s rel V u
)(p u rel 、)(s rel m u 、)(1s rel V u 、)
(2s rel V u 相互独立不相关，故配制标准工作溶液引入的
相对不确定度为：
[][][][]2
22122)()()()()(s rel s rel s rel rel s rel V u V u m u p u C u +++=
=2
2
2
2
00999
.00055
.000129
.000289
.0+++= 0.0118
5.1.2. 标准曲线拟合引入的不确定度u （curve ）
对标准工作液进行测量，测得其峰面积，以峰面积A-浓度C （ug/mL ）作标准曲线，标准曲线为：A=69.037C+23.297，r 2=0.9998，斜率b=69.037，截距a=23.297。

对样品进行两次测量，由标准曲线测得三聚氰胺的含量Cx 为8.38ug/mL 。

序号 1 2 3 4 5 平均值s C 浓度i C (ug/L)
0.8
2
20
40
80
28.56
s i C C -
-27.76 26.56 -8.56 11.44 51.44 峰面积(A) 57.8
141.8
1453.8
2789.9
5532.0
a+bC i
78.52724
161.3726 1404.053 2784.809 5546.321 []2
)(i i bC a A +-
429.618
383.087
2435.126
25.918
205.091
xx
s x S C C N
P
b
s curve u 2
)
(11)(-+
+=
其中，
残差标准偏差[]2
)(1
2
-+-=
∑=n bC a A
s n
i i i
=34.053
离均差平方和∑=-=n
i s x
xx C C
S 1
2
)
(=4326.27
其中：
b-斜率；a--截距；P —样品测试次数；N —测试工作曲线的次数；Cx —样品溶液中三聚氰胺的含量（ug/mL ）；Cs —不同浓度标准工作溶液的平均值（ug/mL ）；Ci —标准工作液的浓度（ug/mL ）；Ai —与标液Ci 对应的峰面积；i —获得标准曲线的测量次数。

27
.4326)
56.2838.8(5
12
1037.69053.34)(2
-+
+
=
curve u =0.440 ug/mL
38
.8440.0)(=
curve u rel =0.0525
5.1.3. 样液和标准工作液的峰面积引入的标准不确定度u （A ）
根据高效液相色谱仪的检定证书的定量重复性为0.1%，按矩形分布，则相对不确定度
6
%1.0)(=
A u rel =0.00041
)(s rel C u 、)(curve u rel 、)(A u rel 互相独立不相关，因此标准曲线求得样液中三聚氰胺的浓
度引入的相对标准不确定度则为：
=++=
2
2
2
)]
([)]([)]([)(A u curve u C u C u rel rel s rel x rel 0.0538
5.2. 样品称量m 引入的标准不确定度u （m ）
称取样品3.0g ，根据电子天平检定证书，0≤m ≤5g ，天平最大允差为0.0005g ，按均匀分
布考虑，3
0005
.0)(1=
m u =2.89410-⨯g,天平重复性误差：±0.0001g ，5
210
77.53
0001
.0)(-⨯==
m u ，
称量引入的标准不确定度2221)()()(m u m u m u +=总=0.0003， 相对不确定度3
0003.0)(=
s rel m u =0.0001
由于样品称样采用的是万分之一的分析天平，故称样不确定度可忽略。

5.3. 样品稀释移取过程f 中引入的标准不确定度u （f ） 5.3.1. 量器校准引入的标准不确定度
样品用25mL 容量瓶B 级进行定容，取10mLA 级单标线移液管移取10mL ，待净化液。

25mL 容量瓶B 级最大允差：0.06mL ；10mLA 级单标线移液管最大允差：0.02mL ；所以量器校准引入的相对标准不确定度为：
2
1]3
1002.0[
]32506.0[)(⨯
+⨯
=
f u rel =0.0018
5.3.2. 样品稀释移取过程人员读数引入的标准不确定度)(2f u
按照5.1.1.4同法分析，样品稀释移取过程中使用玻璃量器2次，人员读数2次，由人员读数引入的相对标准不确定度00577
.000408
.02)(2
2=⨯=
f u rel ，故样品稀释移取过程引入的
相对标准不确定度00604
.000577
.00018.0)(2
2=+=f u rel
5.4. 定容体积V 引入的标准不确定度u （V ）
样品经提取净化后用1mL 单标线移液管取1mL 流动相定容。

5.4.1. 定容量器校准引入的标准不确定度)(1V u
1mLA 级单标线移液管最大允差：±0.007mL ；按均匀分布考虑，由此引入的相对标准不确定度为：
00404.03
007.0)(1==
V u mL
5.4.2. 定容量器人员读数引入的标准不确定度)(2V u
按照5.1.1.4同法分析，样品稀释移取过程中使用玻璃量器1次，人员读数1次，由人员读数引入的相对标准不确定度00408.0)(2=V u ，故定容体积（V ）引入的相对标准不确定度为：
[][]2221)()()(V u V u V u +=
=0.00574mL,则相对不确定度00574
.0)()(==
V
V u V u rel
6. 评定测量量之间的相互关系
各测量量之间完全相互独立，没有相关性。

7. 计算合成不确定度
表3 标准相对不确定度一览表
标准不确定度分量u
不确定度来源 标准相对不确定度
)(x rel C u 标准曲线引入的不确定度 0.0538
)(m u rel 样品称量m 引入的标准不确定度 0．0001 )(f u rel 样品稀释过程产生的不确定度 0.0064 )(V u rel
定容体积V 引入的标准不确定度)(V u rel
0．00574
将表3中各相对不确定度合成：
[][][][]2222)()()()()(V u f u m u C u X u rel rel rel X rel rel +++=
=0.0545
8. 计算扩展不确定度
由实验数据计算得样品中三聚氰胺含量为6.98mg/kg ，则测量结果的合成标准不确定度为u （X ）=6.98×0.0545=0.381 mg/kg ；取包含因子k=2。

故测量结果的扩展不确定度为：U=2u （X ）=2×0.381=0.761≈0.8mg/kg 。

9. 说明不确定度
奶粉中三聚氰胺含量的测量结果可表示为6.98±0.8 mg/kg ，k=2。

10.参考文献
[1] JJF1059-1999 测量不确定度评定与表示
[2] GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰安检测方法》 [3] CNAS-GL06 化学分析中不确定度的评估指南。