柑橘酒酿造酵母的筛选及鉴定

柑橘酒酿造酵母的筛选及鉴定
张大为;张洁;高健;王能强;唐依依
【摘要】Citrus wine is a low-alcohol and high-nutrition fruit wine product produced by the fermentation of citrus juice. In this study, yeast strains with excellent fermenting performance and suitable for the production of citrus wine were screened out as follows:natural citrus fer-menting liquid used as the separation source, through alcohol domesticating and primary screening, three-stage screening was performed (TTC screening, Durham tube fermentation, and small triangle bottle fermentation). The results showed that, No.1 yeast strain had strong fermenting power, good alcohol-producing capacity (wine yield reached up to 6.2%after 5 d fermentation), good aroma-producing capability, good ester-producing capacity (ester yield reached up to 0.16 g/L) , and good sugar utilization rate and low sugar residues. Accordingly, No.1 yeast strain could be used for the production of citrus wine in practice.%柑橘酒是利用柑橘汁发酵而产的低酒精、高营养的果酒。

以柑橘的自然发酵液作为分离源，通过耐受酒精能力的驯化、初筛，经过TTC筛选、杜氏管发酵、小三角瓶发酵等三级筛选，筛选出发酵性能优良且适合于柑橘酒发酵的菌株。

实验结果表明，1号菌株在柑橘汁中起酵能力较强，产酒精能力较好，发酵5 d产酒率达到6.2%，产香较好，产酯达到0.16 g/L，而且糖利用率高，残糖较低，所以1号菌株可作为独立的发酵菌株使用。

【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2016(000)007
【总页数】5页(P42-46)
【关键词】酵母;柑橘酒;筛选;鉴定;特性
【作者】张大为;张洁;高健;王能强;唐依依
【作者单位】湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.1;TS262.7;TS261.4
柑橘是世界园艺植物的主导物种，是全球最重要的经济农作物和加工品之一。

柑橘的种植面积大，产量高，营养好，商品价值大。

根据专业人员测定，柑橘果肉含脂肪、糖、蛋白质、磷、钙、铁以及苹果酸、柠檬酸等多种营养物质，而且维生素含量很高，其维生素C含量是苹果的7倍，梨的10倍［1］。

柑橘产业的发展促进地区经济和贸易的发展，对环境保护和社会进步起着推动作用，甚至于对人类的健康与营养都有着至关重要的作用［2］。

在众多水果品种中，柑橘的种植面积及其年产量都居于世界首位。

全世界有100多个国家和地区都种植柑橘，其中有40多个国家以柑橘为主要种植水果，全球柑橘的年贸易量比其他水果均高出很多，是全球第三大贸易农产品［3］。

我国柑橘产业的发展很迅速，尤其是近30年来的发展，无论是柑橘的种植面积还是总产量都增长迅速。

到2004年我国柑橘的种植面积达到1.7万hm2，在世界柑橘种植排名中居首位；柑橘的总产量达到
1495.8×104t，仅比巴西种植低，更是首次超过了美国，成为全球柑橘第二大国［4］。

柑橘不仅具有营养价值，而且还具有药用价值，是比较常用的中药之一。

柑橘产品入药部分有很多，而且同一种产品在不同状态或者不同收获时期药效也有不同。

例如陈皮，即柑橘的果皮干品，是药食两用的食品之一［5］。

我国柑橘的年产量很高，但是大多数都是简单加工或以鲜食为主。

但是由于柑橘产量大，而且保鲜期有限，这导致了柑橘出现相对过剩，价格不高，果农收益不好的现象，高效利用率不高，仅有少数用于生产果胶和黄酮，其余用来制备饲料和肥料，造成了资源的巨大浪费［6］。

柑橘果酒具有酒度低、营养高、益脑健身等特点，柑橘酒中含有柑橘中大部分的营养物质，如糖类、维生素类、柠檬酸、黄酮类化合物等物质均对人体有好处，而且其中的黄酮类化合物，是天然的抗氧化剂，具有美容养颜的功效［7-8］。

本研究以自然发酵的柑橘酒为分离源，经过三级分离纯化，得到了发酵能力强、产香适中的柑橘酒酿造酵母，经鉴定该菌种为酿酒酵母。

1.1 材料
柑橘：采于柑橘园。

1.1.1 培养基
（1）分离培养基：PDA固体培养基，称取去皮的马铃薯200 g，葡萄糖20 g，
琼脂15～20 g，加水定容到1 L，pH值自然，以121℃高压蒸汽灭菌20 min。

（2）驯化培养基：分别含有2%vol、4%vol、6%vol乙醇的PDA液体培养基，pH值自然。

（3）YEPD培养基（质量分数）：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母膏2%，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

（4）酵母保藏培养基：PDA固体培养基。

（5）TTC上层培养基：参见参考文献［9］；TTC下层培养基：参见参考文献［9］。

（6）发酵培养基：把成熟、新鲜的柑橘去皮再用榨汁机榨成柑橘汁，调整糖度为15°Bx，pH5，121℃灭菌20 min。

1.1.2 主要试剂
（1）斐林试剂甲液［10］：称取15 g硫酸铜，溶于水中并定容至1000 mL，然后储存在棕色瓶中备用。

（2）斐林试剂乙液［10］：称取50 g酒石酸钾钠、75 g氢氧化钠，在水中彻底溶解，然后再加入4 g亚铁氰化钾，待完全溶解后，用水定容至1 L，放在橡胶塞玻璃瓶内储存。

（3）葡萄糖标准溶液：精确称取1 g葡萄糖在110℃的恒温干燥箱中干燥3 h并冷却，然后用无菌水定容至1 L。

（4）次甲基蓝指示剂（10 g/L）：准确称量1.0 g亚甲基蓝用水定容至100 mL，备用。

1.2 仪器
洁净工作台（ATR TECH型，苏净集团安泰公司）；手持糖度计（成都豪创光电
仪器有限公司）；酒精计（武强县精创仪器仪表厂）；生化培养箱（CIMO SPX-300BS-Ⅱ型，上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.3 实验方法
1.3.1 柑橘中酵母菌的分离纯化和筛选
（1）样品预处理：把柑橘在研钵中捣碎放到250 mL锥形瓶中室温下自然发酵
24 h，菌悬液备用。

（2）酒精驯化培养：参见参考文献［12］。

（3）分离纯化与保藏：参见参考文献［11］。

（4）对上述分离得到的酵母菌进行筛选，得到发酵能力和产酒精能力较强的菌株。

1.3.2 TTC显色法
TTC能与发酵过程中产生的脱氢酶发生显色（红色）反应，脱氢酶产生的量又与
酒精产率为正比关系，即产酒精度越高的菌株，脱氢酶越多，颜色越深。

因此通过TTC显色法能筛选出产酒精能力较强的菌株。

具体做法如下：
（1）TTC上层平板的制备：按比例取药品共2 g，加入100 mL水，煮沸，装好，121℃灭菌20 min，冷却到50～60℃时再加0.05 g TTC。

TTC下层平板的制备：按比例取药品共9 g，加入200 mL无菌水，溶解并煮沸，冷却后调pH5.5，灭完菌后冷却到一定温度再倒平板［12］。

（2）取适量待筛选的酵母菌液涂布于TTC下层平板，在28℃的恒温箱中倒置培
养2 d。

（3）待长出菌落后在无菌环境下注入适量TTC上层培养基，摇匀，在28℃下培
养3 h左右。

待平皿中长出菌落后，根据颜色深浅挑选菌株，作为一级筛选选定的菌种。

根据该方法原理，红色越深，证明产酒精能力越强。

1.3.3 杜试管发酵筛选
将上述通过TTC平板筛选得到的酵母利用杜氏管发酵法，在相同的培养条件下，
测定酵母菌产气泡的速度及在指定的时间内产气泡的多少，从而比较各株菌株发酵能力，进而选择出发酵性能优良的菌种。

步骤如下：取1 mL菌悬液接种到加有已灭菌的杜氏管和2 mL PDA液体培养基
的大试管中，放到28℃恒温箱中培养，每隔12 h观察并记录酵母菌株产气泡的
快慢及产气泡的多少，并记录发酵48 h以后的产香情况，挑选出产气量多且快，产香能力强的菌株作为入选菌株［13-14］。

1.3.4 锥形瓶发酵筛选
发酵能力是判定酵母菌株的一个重要指标。

酵母发酵过程中产生乙醇的同时还生成CO2，而生成的CO2从发酵液中跑出，导致整个发酵体系的重量减轻，根据减轻
的重量，可确定发酵速率的快慢［15］。

将上述杜氏管发酵筛选得到的菌株进行锥形瓶发酵筛选，试验方法：先制备菌悬液，再将菌种按10%的接种量接入15°Bx柑橘汁中发酵。

每隔24 h测定并记录锥形
瓶的重量。

还原糖、酒精含量、总酯、总酸等指标根据GB/T 15038—2006的方法测定［13］。

1.3.5 1号菌株的26S rDNAD1/D2区序列分析
（1）DNA的提取：参见参考文献［12］。

（2）26S rDNA的D1/D2区的PCR扩增：参见参考文献［12］。

（3）PCR扩增产物纯化及测序：委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成，扩增产物利用凝胶回收试剂盒。

（4）系统发育分析：参见参考文献［12］。

1.3.6 1号菌株的生长特性
1号菌株作为入选菌株保存于斜面试管中，挑取适量菌株，接种到YEPD液体培养基中培养，每隔2 h在660 nm波长下测定其OD值，测完之后绘制生长曲线图，横坐标为培养时间，纵坐标为OD值。

该菌株产酒精量和还原糖含量的变化则是
将活化好的菌株接种于15°Bx柑橘汁中，每天测定1次产酒精量和还原糖的含量，得到数据并绘图。

2.1 菌种的初步分离结果
从柑橘自然发酵液中吸取的菌悬液，经过不同的酒精度驯化培养和涂布分离纯化，共得到15株酵母，其基本特征见表1。

2.2 TTC显色法的筛选结果
将上述分离得到的15株菌种按照TTC方法培养，获得12株具有产酒精能力的菌株，以此作为入选菌株进行后续筛选，编号分别为1号、2号、3号、4号、5号、7号、8号、10号、11号、12号、13号、14号。

如图1，1号菌株（A）颜色
明显比6号菌株（B）颜色要深，通过颜色对比，选出颜色较深的1号菌株。

2.3 杜氏管二级筛选结果
将上述12株菌种采用杜氏管发酵法筛选，考察菌株产气多少及产气速度，见表2。

由表2中数据显示：发酵12 h后，1号、7号和8号菌株产气量达到杜氏管容积
的3/5，而5号、11号酵母的产气量则达到了2/5，其余菌株则很少或没有产气。

说明1号、7号和8号的起酵能力强。

发酵24 h以后，1号、5号、7号和8号
4株酵母的产气量都达到了4/5，11号、12号产气量达到了3/5，发酵36 h后，1号、5号、7号、8号、11号5株酵母产气量都充满了杜氏管，表明这5株酵母菌株比其他7株的起酵时间、发酵速度和发酵能力相对来说更好，因此将其他7
株淘汰。

根据实验结果及感官评定可知，1号、5号、7号、8号、11号菌株具有发酵能力强、产香浓郁的特点，具有较优良的特性。

2.4 三角瓶发酵三级筛选
通过杜氏管二级筛选得到的1号、5号、7号、8号、11号菌株重新标号为1号、2号、3号和4号，进行三角瓶发酵，从而进行三级筛选实验，将得到的数据以发酵时间为横轴，二氧化碳失重量为纵轴作图，结果见图2。

由图2可以看出，各菌株的发酵能力，其中1号发酵能力最强，CO2产生较早，
较快，发酵能力也最强，CO2产生量最多，5 d时失重量达到4.6 g。

2号、3号、4号酵母的发酵能力差不多，最后5 d的二氧化碳失重量分别是3.3 g、2.7 g、3.5 g。

而5号酵母的起酵能力和发酵能力都是最差的，只有2.2 g。

从实验结果
可知，1号菌株的发酵能力最强。

为确保得到综合能力强的菌株进行柑橘酒的发酵，继续考察5株菌的产酒精量、总酸、残糖、还原糖和总酯5项指标，结果见表3。

由表3可知，1号—5号菌株在发酵5 d后，1号菌株的产酒精量最高，达到
6.2%vol，5号酵母产酒精量最少，仅仅只有3.6%vol。

各菌株的产酯最高达到
0.20 g/L，1号酵母产酯为0.16 g/L，较为靠前；总酸产率最低为5号菌株，为
0.06 g/L，最高为4号菌株，为0.14 g/L，1号酵母产酸略高，为0.12 g/L，；从菌株对糖的利用率来看，1号菌株残糖低，糖利用率较高，发酵5 d后还原糖为0.045 g/L，是最少的。

从酒精产量、糖利用率及产香等情况可知，1号菌株性能最好，故可作为入选菌株，并进行后续实验。

2.5 1号菌株的26S rDNAD1/D2区序列分析
通过菌落特性、细胞形态特征等指标初步分析1号菌株为酵母菌，为确定该菌株的分类学地位，决定采用26S rDNA D1/D2区序列对该菌种进行鉴定。

把1号菌株26S rDNA D1/D2区基因序列在NCBI中GenBank上进行同源性比对，结果表明该序列与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）相似性为100%，结合形态学分析，确定该菌株为酿酒酵母，故命名为酿酒酵母GJ01（Saccharomyces cerevisiae GJ01）。

2.6 Saccharomyces cerevisiae GJ01的生长和特性
2.6.1 Saccharomyces cerevisiae GJ01的细胞形态
从图3可以看出，菌株具有典型的酵母形态，细胞呈圆形，为单端出芽生殖模式［17］。

2.6.2 Saccharomyces cerevisiae GJ01的生长特性
Saccharomyces cerevisiae GJ01的生长曲线见图4。

由图4可以看出，该菌株的生长速率较快，0～5 h为延迟期，5 h后细胞数量增加较快，进入生长对数期，直到22 h以后酵母菌数量增加，速度减慢，开始进入稳定期，到30 h后进入衰亡期。

从生长曲线可以看出，该菌株生长速度较快，具有较短的延迟期，更适合柑橘酒发酵，减少了发酵过程中被杂菌污染的几率。

2.6.3 Saccharomyces cerevisiae GJ01在发酵过程中酒精生成量及还原糖变化情况（图5）
2.6.4 Saccharomyces cerevisiae GJ01在发酵过程中还原糖变化情况（图6）
由图6可以看出，发酵第1天还原糖含量急速上升，原因是酵母将柑橘汁中加的蔗糖首先分解为还原糖，导致还原糖含量急剧上升，然后开始利用发酵液中的还原糖进行发酵。

发酵到第3天还原糖含量达到最大，为0.38 g/L，此时还原糖含量开始降低，至发酵第5天，发酵液中还原糖含量为0.045 g/L。

说明该菌株的发酵过程中糖利用率较高，残糖较低，发酵能力较强，发酵速率较快。

2.6.5 1号菌株在发酵过程中总酯变化情况（图7）
发酵前柑橘汁本身就有部分酯类物质，但是含量不多，仅为0.03 g/L，发酵过程中会产生酯类，产生的酯类物质越多，说明发酵能力越强，发酵速度也越快。

发酵过程中酯类含量持续上升，第3天、第4天酯类生成量较快，到第5天时总酯含量为0.20 g/L。

随着酯类物质的增多，香气越来越浓，到第5天时，酒香浓郁。

从柑橘自然发酵液中分离出酵母，经过TTC平板筛选，杜氏发酵管筛选，三角瓶发酵筛选，得到1株产酒精能力强、产香能力强的1号菌种，通过26S rDNA
D1/D2区序列分析，确定为酿酒酵母，故命名为酿酒酵母GJ01（Saccharomyces cerevisiae GJ01）。

对该菌株特性进行分析。

实验结果表明：发酵5 d产酒率达到6.2%，总酯含量为0.16 g/L且残糖较低，产香能力较强，可以作为独立的柑橘酒发酵菌株来使用，具有较好的研究价值。

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