构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的相互作用分子_NormalPdf

第42卷第1期2021年1月

Vol.42No.1

January2021中山大学学报（医学科学版）

JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）

构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中

的相互作用分子

巫孟师，熊敏敏，彭丹，韩雪，钟小敏

（中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心，广东广州510080）

摘要：【目的】为了探讨lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的作用机制，本研究拟构建一种新的MS2-RIP方法用于鉴定DANCR的相互作用分子。【方法】利用MS2噬菌体衣壳蛋白可与噬菌体复制酶编码基因5’端一段由19个碱基组成的RNA茎环结构序列，即MS2结合位点（MS2Binding Site，MS2BS）高效结合的特点，构建串联表达MS2BS 和DANCR的过量表达质粒，通过MS2蛋白与MS2BS的亲和作用，使DANCR得到富集，并且同步捕获与DANCR相互作用的分子，用于进一步分析鉴定。【结果】成功构建串联表达MS2BS和DANCR的过量表达质粒用于MS2-RIP 实验，该实验可显著富集DANCR以及作为阳性对照的DANCR结合蛋白EZH2。【结论】基于MS2蛋白与MS2结合位点的高效结合特性，我们针对lncRNA DANCR建立了MS2-RIP方法。该方法可有效富集DANCR以及与DANCR 结合的生物活性分子，为研究DANCR的作用机制提供一种新的技术手段。

关键词：MS2；RNA结合蛋白免疫沉淀；长链非编码RNA；DANCR

中图分类号：R31文献标志码：A文章编号：1672-3554（2021）01-0024-09

MS2-RIP Assay for Identifying the Interaction Partners of lncRNA DANCR in Tumor Cells WU Meng-shi，XIONG Min-min，PENG Dan，HAN Xue，ZHONG Xiao-min （Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-Sen University，Guangzhou

510080，China）

Correspondence to：ZHONG Xiao-min；E-mail：zhongxm23@

Abstract：【Objective】To explore the functional mechanism of lncRNA DANCR in tumor cells，a MS2-RIP method was designed and conducted to identify the molecules that interact with DANCR.【Methods】The specific binding of MS2bacteriophage capsid protein and MS2binding site（MS2BS），a19-base RNA stem-loop structure located at the5′terminus of the MS2bacteriophage replicase gene，was applied to construct a plasmid for tandemly overexpressing DANCR and MS2BS.DANCR was enriched and its associated molecules were further identified and analyzed.【Results】The plasmid for tandemly overexpressing DANCR and MS2BS was successfully constructed for the MS2-RIP experiment，which could significantly enrich DANCR and DANCR-binding protein EZH2as a positive control.【Conclusion】Based on the high affinity binding between MS2protein and MS2BS，the MS2-RIP method was established for lncRNA DANCR，which could effectively capture DANCR as well as its associated molecules，providing a new technology for studying the functional mechanism of DANCR.

Key words：MS2；RNA-binding protein immunoprecipitation（RIP）；long non-coding RNA（lncRNA）；DANCR

［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2021，42（1）：24-32］·基础研究·

收稿日期：2020-10-13

基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFA0105501）；广东省科技计划项目（2015A020212019）

作者简介：巫孟师，在读硕士研究生，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：wwArmy@；钟小敏，通信作者，副教授，博士生导师，E-mail：zhongxm23@

第1期巫孟师，等.构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的相互作用分子

DANCR（differentiation antagonizing non-protein coding RNA）是一个最初在人表皮祖细胞中被发现具有维持细胞未分化状态功能的长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）分子［1］。近年来的研究显示，DANCR在多种肿瘤中存在异常高表达的现象，提示其在肿瘤的发生和发展中具有重要作用［2-7］。虽然DANCR在肿瘤发生发展中的重要功能逐渐被揭示，但是对于DANCR作为癌基因（oncogene）的作用机制尚未完全探讨清楚。研究结果表明，lncRNA发挥功能的主要方式之一是直接结合具有调控功能的蛋白质或核酸分子［8-11］。为了阐明DANCR在肿瘤细胞中的作用机理，本研究致力于构建一种基于MS2RNA结合蛋白的特性，用于鉴定与DANCR相互作用的生物活性分子的新方法。MS2RNA结合蛋白实质为RNA 型噬菌体MS2外表面的衣壳蛋白，通过特异性结合噬菌体复制酶编码基因5’端由19个核苷酸组成的RNA茎环结构，即MS2结合位点（MS2Bind⁃ing Site，MS2BS），起着保护噬菌体核酸以及抑制翻译的作用［12］。本研究计划构建表达Flag-MS2-EGFP融合蛋白以及串联表达DANCR-MS2BS的两种载体，使用Flag抗体对MS2RNA结合蛋白进行免疫沉淀，同时对DANCR-MS2BS进行富集，并进一步使用已被证明为DANCR相互作用分子的EZH2蛋白作为阳性对照［11］，验证MS2-RIP方法的效果。成功构建MS2-RIP方法，对于探讨DANCR的工作机理具有重要的推动作用，也可以为鉴定其他lncRNA的相互作用分子提供技术基础。

1材料与方法

1.1细胞株、菌株及质粒

人结肠癌HCT116细胞（购自中国科学院细胞库）及大肠杆菌菌株DH5α（购于天根生化科技有限公司）。pPyCAGIP（由Prof.Austin Smith from University of Cambridge赠予），pSL-MS2-12X和pMS2-GFP质粒（购于Addgene公司）。

1.2试剂

DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒（购于天根生化科技有限公司）；限制性核酸内切酶BglⅡ、SacⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ（购于New England BioLabs公司）；Infusion kit（购自Takara公司）；Mil⁃lipore RIP试剂盒（购自Millipore公司）；RNA提取试剂TRI-Reagent（购自MRC公司）；逆转录试剂盒（购自近岸蛋白质科技有限公司）；TGXStain-Free 丙烯酰胺免染制胶试剂盒（购自Bio-Rad公司）；荧光定量PCR试剂（购于Roche公司）；EZH2抗体试剂（购自Cell Signaling Technology公司）；ViaFect 转染试剂（购于Promega公司）；ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads试剂盒（购自Sigma公司）；RNA pulldown试剂盒（购自ThermoFisher公司）；IP Lysis buffer（购自ThermoFisher公司）。本文所用引物及探针由生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1，探针序列见表2。

1.3细胞培养

HCT116细胞使用DMEM高糖培养基（Gibco，美国），添加100mL/L胎牛血清（PAN，德国）及双抗（100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；Hyclone，美国），置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。

1.4Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP质粒构建

以pMS2-GFP质粒为模板，用MS2-GFP-F和MS2-GFP-R引物扩增MS2-GFP开放阅读框。扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。然后用限制性内切酶BglⅡ和SacⅠ酶切载体Flag/pPyCAGIP，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。将回收的MS2-GFP片段和线性载体用Infusion酶连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α中，使用氨苄抗性的LB平板筛选阳性克隆。挑取单克隆摇菌扩增，提质粒，送生工生物测序。测序正确的菌液转移至30mL含氨苄抗性的液体LB培养基中摇菌过夜，取0.5mL菌液与0.5mL已灭菌的30％甘油混合保存于-80℃，剩余菌液使用质粒小提试剂盒进行质粒提取。

1.5DANCR-MS2BS(12X)/pPyCAGIP质粒构建

以pSL-MS2-12X质粒为模板，用MS2（12X）-F 和MS2（12X）-DANCR-R引物扩增MS2BS（12X）片段。扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。以HCT116细胞提取的RNA进行逆转录后的cDNA为模板，用MS2（12X）-

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