SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量

SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量
一、药剂准备
a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：
1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml
2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml
3、10%SDS 5ml
4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克
先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。

可可
5、TEMED 0.5 ml
6、1M Tris-HCL,PH6.8 15ml
b、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）
2ml，1ml/管，共2管
c、蛋白质分子量标准（200ul）
d、SDS-PAGE电泳液（1L）
由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。

（不宜超过两周）
e、考马斯亮染色液（250ml）
f、考马斯亮染色脱色液（500ml）
注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：
甲醇或者乙醇
乙酸250ml 80ml
去离子水补至 1000ml,混匀，备用。

二、器材准备
移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子
三、SDS-PAGE 分析操作过程：
1、配制蛋白质溶液
用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。

确保质量分数为3～5g/L。

试管依次标号1、2、3、4、5。

用保鲜膜和皮筋封口保存备用。

最好当天现配。

2、制分离胶（即下胶层）
鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。

按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。

依照15%胶，5ml（打勾）一栏。

如图：
注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。

a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。

b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次
用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-
3/4。

c. 紧接着，用移液枪从槽上面间隔均匀地注入1000ul（即1ml）蒸馏水以
水封，目的是使分离胶凝胶上层界面平滑。

d. 在30度烘箱中静置半小时，冬天室温50min。

直至分离胶与水之间出现一
条平滑光亮的界面痕迹。

3、制浓缩胶
按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格，依照5%胶，4ml（打双勾）一栏。

如图：
a. 分离胶在烘箱中10min左右后，按上图配浓缩胶，迅速摇匀。

b. 待分离胶与水之间平滑光亮的界面痕迹稳定后，抬高电泳仪一侧，用移
液枪从边缘吸出分离胶上的水，尽量吸干净。

c. 电泳仪放平稳后，沿着槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入浓缩胶，注
意勿打入气泡，迅速平稳地插入齿梳。

d. 在30度烘箱中静置半小时。

4、配样。

用移液枪配合微量进样针，从每支试管中吸取15ul蛋白质溶液，加入
1-5号对应小样管，每支小样管中再加入1/5（3ul）的上样缓冲液。

在 100℃沸水中煮 5min。

5、加电泳液及上样
小心拔出齿梳，卸下封条。

将制好的凝胶用电泳架固定至电泳槽中。

注：短板朝里。

若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。

倒入1L电泳液，液面至短板和长板之间。

每孔上样量15ul, 即小样管中全部上样（1-5号对应）。

蛋白质分子量标准上样量7ul。

6、电泳仪接线，打开电源，稳压状态下将电压调到 180v（15min 左右），待样
品跑过浓缩胶后将电压调到 200v 至样品电泳到胶底部为止，整个过程
1.5-
2.5h。

7、关掉电泳仪电源，拆线。

从电泳仪上拔出玻璃槽。

打开玻璃板，将凝胶小心剥
下放入容器中，加入染色液，用摇床摇 2－3h，染液可回收。

8、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。

第二天换脱色液2-3次。

脱色4
-24h。

9、将脱色液倒掉，可以用 Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估
算蛋白浓度。

注：具体染色脱色等步骤见说明书。