黄芪多糖体外抗CVB3病毒活性

黄芪多糖体外抗CVB3病毒活性
郑兰兵;魏青;刘小玲;刘小雷
【摘要】目的研究黄芪多糖(ASP)对柯萨奇B3病毒(CVB3)所致的VERO和乳鼠原代心肌细胞病变抑制作用及病毒繁殖抑制反应,并测定其对乳鼠原代心肌细胞培养上清液中乳酸脱氩酶和血清肌酸磷酸激酶(LDH、CK-MB)活性的影响.方法在VERO细胞、大鼠原代心肌细胞中加入不同稀释度ASP后,感染CVB3病毒,观察细胞病变,MTT染色比较各组间活细胞数的变化,病毒繁殖抑制实验比较半数组织感染量(TCID50)的差别;紫外分光光度法测定心肌细胞培养上清液LDH和CK-MB活性.结果 ASP在上述实验中可降低CVB3病毒造成的细胞凋亡(P＜0.01)及抑制病毒的繁殖对心肌细胞释放心肌酶也有一定的抑制作用(P＜0.05).结论 ASP对CVB3病毒感染的VERO和乳鼠心肌细胞具有保护作用.在一定浓度下可降低心肌酶的释放,其作用机制尚需做进一步实验来探讨.
【期刊名称】《中国医药指南》
【年(卷),期】2011(009)013
【总页数】3页(P45-47)
【关键词】黄芪多糖;CVB3病毒;细胞病变;LDH;CK-MB
【作者】郑兰兵;魏青;刘小玲;刘小雷
【作者单位】内蒙古自治区第三医院,内蒙古,呼和浩特,010010;内蒙古医学院第一附属医院,内蒙古,呼和浩特,010059;内蒙古自治区医院,内蒙古,呼和浩特,010018;内蒙古医学院药学院,内蒙古,呼和浩特,010059
【正文语种】中文
【中图分类】R96
病毒感染是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）最常见的病因，近年来，
发病率有逐渐增多的趋势，有多种可病毒引起VMC，其中以柯萨奇B组3型病毒（Coxsackie virus，CVB3）最为常见[1]。

许多文献报道中药具有明显的心肌细
胞保护和抑制病毒增殖作用，黄芪就是其中最重要的一种。

现研究发现黄芪中小分子化合物如黄芪甲苷、黄酮类具有肯定的抗病毒作用外，较大的分子化合物，黄芪多糖（ASP）也具有提高免疫保护心肌细胞的生物活性[2]。

本文利用已经建立的
病毒性心肌炎细胞模型，观察黄芪多糖对心肌细胞的保护作用，并试图探讨其心肌保护作用机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受试物、病毒及细胞株
黄芪多糖（ASP），从蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，黄芪多糖ASP（Astragalus Sachalinensis Polysaccaride），由中国科学院兰州化学与物理研究所汪道全教
授提供，质量分数95.6%；Wistar新生乳鼠心肌细胞，购自内蒙古大学动物中心，生产许可证：SCXK（蒙）2002-0001；VERO细胞：由中国军事医学科学院五所惠赠；CVB3病毒：中国科学院昆明病毒所提供。

1.1.2 主要试剂
免疫组织化学试剂盒（中山生物技术公司，SA102）；凋亡检测试剂盒（宝赛生
物技术公司，CX101-3）；心肌细胞anti-α-actin（中山生物技术公司，
3111003）；盐酸胍（华美生物工程公司，BR136）；CK-MB试剂盒（华美生物工程公司，03104）；LDH试剂盒（华美生物工程公司，031020）。

1.1.3 主要仪器
CO2孵箱：日本三洋株式会社；酶标仪（Model550）：美国Bid-Rad公司；低
温离心机（RC SC）：美国Sorvall公司；高速冷冻离心机（Z360K）：德国Hermle公司；微量移液器：德国EPPENDORF公司；生物倒置显微镜：日本Nikon公司。

1.2 方法
1.2.1 在VERO细胞上抗CVB3病毒实验[3]
试验方法参照文献[3]。

1.2.2 在原代心肌细胞上抗CVB3病毒实验[3]
试验方法参照文献[3]。

1.2.3 病毒繁殖抑制实验[3]
试验方法参照文献[3]。

1.2.4 原代心肌细胞培养液心肌酶活性测定
1.2.4.1 LDH的测定
试验方法参照文献[4]。

1.2.4.2 CK-MB的测定
试验方法参照文献[4]。

2 结果
2.1 ASP在VERO细胞上抗CVB3作用
VERO细胞试验结果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL浓度下，能抑制CVB3病毒对VERO细胞破坏作用，与阴性对照组（病毒）比较，OD值
有显著性差异，并呈效应与浓度依赖的关系（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 ASP抗CVB3病毒作用结果（VERO细胞）（±s，n=8）注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01组别剂量（μg/mL） OD值细胞对照组—0.9493±0.1321病毒对照组 250TCID50
0.5801±0.1299bb病毒＋盐酸胍组31.3 0.6251±0.1567 62.5 0.8130±0.0869a 125.0 0.8275±0.0876a病毒+ASP组7.8 0.5823±0.2292 15.6 0.6781±0.1424 31.3 0.7758±0.2305a 62.5 0.8058±0.1249a 125.0 0.9848±0.3392aa
2.2 ASP在新生乳鼠心肌细胞上对CVB3的作用
Wistar新生乳鼠心肌细胞CVB3感染48h后，心肌细胞出现萎缩、变形及脱落，感染后72h至第5天心肌细胞搏动减弱甚至停止，CPE增多。

从表2数据可看出，病毒+ASP组（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌细胞形态正常、搏动有力。

MTT染色数据表明：给药各浓度组与阴性对照组比较，乳鼠心肌细胞
存活率明显增高，各ASP组与阴性对照组比较，OD值有显著性差异（P＜0.01），见表2。

表2 ASP抗CVB3病毒作用结果（原代心肌细胞）（±s，n=8）注：与病毒对照
比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01组别剂量（μg/mL） OD值细胞对照组—0.8028±0.1685病毒对照组 250TCID50
0.4088±0.0847bb病毒+盐酸胍组15.6 0.4203±0.0952 31.3 0.5985±0.1117aa 62.5 0.6323±0.1248aa病毒+ASP组3.9 0.4532±0.0837 7.8 0.4564±0.0799 15.6 0.6409±0.1965aa 31.3 0.6439±0.0827aa 62.5 0.6594±0.2543aa
2.3 病毒繁殖抑制试验影响
根据表3试验数据，ASP给药组在31.3μg/mL剂量下，已造成病毒繁殖抑制作用，125.0μg/mL浓度时与盐酸胍对照组抑制作用一致，且有药物浓度相关性。

表3 ASP对病毒繁殖抑制影响（VERO细胞）注：*log10TCID50与阴性（病毒）对照组比较，提高1个以上对数值，则表明对病毒繁殖有抑制性作用组别剂量
（μg/mL） log10（TCID50）与病毒对照组升高对数单位病毒+培养液组— -2.4 0病毒+盐酸胍组 62.5 0 2.4*病毒+ASP组 31.3 -1.5 0.9 62.5 -0.9 1.5*125.0 0 2.4*
2.4 对Wistar新生乳鼠心肌细胞LDH测定结果
从表4数据看到：ASP对Wistar新生乳鼠心肌细胞培养液中LDH活性影响，仅
在高剂量下（62.5μg/mL）降低其酶活性（P＜0.05）。

２.5 对乳鼠心肌细胞培养液CK-MB测定结果
表4 ASP对原代心肌细胞上清培养液LDH活性影响（±s，n=8）注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01 ；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01组别剂量（μg/mL）酶活力单位细胞对照组—6233.0±1024.0病毒对照组 250TCID50 8346.5±1875.0bb病毒+盐酸胍组15.6 6918.8±1028.5 31.3 6633.0±1326.1 62.5 6524.0±1423.5a病毒+ASP组3.9 8308.8±1399.1 7.8 7730.5±1870.8 15.6 7663.5±1221.7 31.3 7015.0±1547.4 62.5 6595.0±1192.6a
从表5数据看到：ASP在31.3、62.5μg/mL浓度下可降低Wistar新生乳鼠心肌
细胞培养液CK-MB酶活性，有药物浓度相关性（P＜0.05、P＜0.01）。

表5 ASP对培养大鼠心肌细胞CK-MB活性的影响（加病毒48小时后）（±s）注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01组别样本数剂量（μg/mL）酶活力单位细胞对照组 8 —68.9±18.5病毒对照组 7 250TC ID50 152.4±34.8bb病毒+盐酸胍组8 15.6 116.2±31.8 8 62.5 75.1±20.5aa病毒+ASP组6 3.9 126.0±10.8 8 31.3 113.7±25.91 8 7.8
113.5±23.9 8 15.6 112.5±35.9 8 31.3 99.5±19.1a 8 62.5 78.3±15.7aa
3 讨论
本文使用从蒙古黄芪中分离纯化的黄白色粉末状多糖，经测定为a-糖苷键连接，
相对分子质量约35000，水解多糖检出半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及葡萄糖等。

含有糖醛酸为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，为水溶性酸性杂多糖。

CVB3病毒接种于VERO细胞时，可看到VERO细胞发生病变，表现为细胞萎缩、胞质颗粒化、折光度增强、与周边细胞原有的紧密接触渐渐消失，最后细胞变形破裂而从培养皿上脱落[5]。

鉴于VERO细胞对CVB3病毒敏感这一特点，本文以VERO细胞为敏感细胞株，采用MTT染色法，研究了ASP在VERO细胞上的抗CVB3病毒作用。

MTT染色结果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、
125μg/mL浓度下，能抑制CVB3病毒对VERO细胞的损伤，与阴性对照组比较，OD值有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），并呈效应与浓度依赖的关系。

其作
用可能是通过竞争抑制方式阻止CVB3病毒与VERO细胞结合，阻碍病毒的吸附
而影响病毒的复制。

新生乳鼠心肌细胞在感染CVB3病毒后2～5d可出现明显细胞病变，早期可直接
损害心肌细胞，不仅能关闭细胞核酸及蛋白质的合成，且其蛋白酶A2能裂解心肌细胞中dystrophin蛋白，打乱心肌细胞骨架结构。

后期可引起心肌细胞Ca2+内
流增加，胞内Ca2+浓度超负荷从而导致心肌细胞变形、脱落、损伤、破裂及诱导心肌细胞凋亡[6]。

由于心肌细胞的破裂其胞内乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸激酸激
酶（CKMB）释放明显增高。

因此本文采用心肌细胞为敏感细胞株，观察给予
ASP后CVB3病毒对心肌细胞形态（MTT染色）及搏动影响，测定培养液中LDH 及CK-MB的活性。

从试验数据可以看到，病毒+ASP组（15.6μg/mL、
31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌细胞与病毒对照组比较，细胞形态正常、搏
动有力，MTT染色数据表明：给药各浓度组与阴性对照组比较，乳鼠心肌细胞存
活率明显增高，OD值有显著性差异（P＜0.01）。

ASP在高剂量下（62.5μg/mL）降低乳鼠心肌细胞培养液中LDH酶活性（P＜0.05），同样在31.3μg/mL、
62.5μg/mL浓度下可降低CK-MB酶活性，且有药物浓度相关性（P＜0.05、P＜0.01）。

而病毒繁殖抑制的结果也表明，ASP可抑制CVB3病毒在VERO细胞内
的复制。

本文仅观察了ASP体外细胞水平上抗CVB3病毒活性，测定ASP在CVB3病毒的攻击下对VERO和乳鼠心肌细胞的保护及对CVB3病毒的抑制。

ASP的作用机制和对VMC临床治疗效果，尚需进行整体动物实验进一步探讨。

参考文献
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报,1996,12(2):161.
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[4] 刘小玲,张勇,刘小雷.广枣总黄酮体外抗CVB3病毒活性[J].中国医院药学杂志,2007,27(12):1-5.
[5] 刘小雷,张宪武,于东升.病毒性心肌炎细胞调亡机制的探讨[J].内蒙古医学杂志,2005,6(37):92-97.
[6] 刘晓雷,宿瑞俊,贾秀珍,等.黄芪多糖体外抗病毒性心肌炎试验研究[J].中国分子心脏病学杂志,2003,9(2):79.。