产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定-定稿

产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定
摘要：试验中的真菌一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。

包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌对其进行了微生物纯化、分离、筛选、酶活的测定及复核鉴定等。

关键词：纤维素酶活筛选真菌 ITS 鉴定
纤维素是自然界存在量最大的一类天然资源，且可无限再生。

麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。

并且我国每年产秸秆约7亿多吨，实现秸秆资源高效利用，是我国可持续发展面临的重要问题。

能源危机和环境危机是整个人类社会目前面临的严峻问题，而合理有效的处理和利用纤维素资源将为解决这些问题提供一种有效的手段。

本实验通过对菌种产纤维素酶活的测定确定其酶活高低，并综合形态观察和ITS序列分析对其进行鉴定。

1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验菌种
试验菌种一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。

包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌，所有菌种均来源于中国农业微生物菌种中心（ACCC）。

1.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基
马铃薯200.0g 葡萄糖20.0g 琼脂15.0~20.0g
蒸馏水1000.0mL pH 自然
马铃薯去皮，切成块煮沸30.0min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000.0mL
羧甲基纤维素培养基（CMCNa）
NH4NO3 1.0g KH2PO4 1.0g KCl 0.5g Mn SO4 0.004g ZnCl20.0017g CoCl20.002g MgSO4•7H2O 0.5g FeSO4 0.01g CMCNa 10g 琼脂20g 蒸馏水1000ml pH 6.5
羧甲基纤维素液体培养基（同羧甲基纤维素固体培养基配方，不加琼脂）
液体发酵培养基
玉米秸秆粉（40目）10.0g 麸皮 2.5g KH2PO4 1.5g (NH4)2SO4 1.3g K2HPO4·3H20 2.9g CaCl20.15g MgCl2 1.0g FeSO4 0.005g MnSO40.0061g NaCl 1.0g 蒸馏水1000 mL
1.1.3主要试剂
1.0%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：2g羧甲基纤维素钠（粘度300~600里泊）溶于200.0mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤，取滤液100.0mL加pH4.8的醋酸盐缓冲液20.0mL，再加蒸馏水410.0mL，贮冰箱备用。

一周后应重新配制。

3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)制备：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和
2.0mol/L NaOH溶液262.0 mL，加到500.0mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌溶解。

冷却后用蒸馏水定容至1000.0mL，贮于棕色瓶中，半个月后使用。

pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8mL冰醋酸定容至100.0mL，称取27.2g的醋酸钠溶解并定容至100.0mL，将上述两种溶液等体积混合。

1%水杨苷溶液：1g的水杨苷溶液加少许pH6的缓冲液,，再用pH6的缓冲液定容至100mL。

1 mg/mL刚果红、水杨苷、whatman NO.1试纸、1 mg/mL 的葡萄糖标准液、羟基纤维素钠、葡萄糖、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、无水乙醇（预冷）、70%乙醇（预冷）、氯仿异戊醇（24:1）、液氮、CTAB缓冲液、ITS1、ITS5、Buffer、Taq酶、dNTP、TE缓冲液、DNA电泳胶（0.8g，100ml，5%TBE）、PCR电泳胶（1.0g，100ml，1%TBE）。

1.2 实验方法
1.2.1菌种的初筛
采用的刚果红染色法对菌株的酶活力进行初步筛选。

1.2.1.1实验原理：刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

1.2.1.2实验步骤：菌落长满平皿后，加入适量1.0mg/mL的刚果红溶液，染色1h后倾去染液，加入适量1.0mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。

菌体若能分泌纤维素酶，则在菌体周围会出现清晰的透明圈，根据透明圈与菌落直径比值的大小选择菌株。

1.2.2菌株的复筛将初筛的11株真菌接种到液体发酵培养基中，加一个空白对照管，进行摇瓶发酵培养(28℃，200r/min)，分别测定菌株在培养第3d、4d、5d、6d 的CMC酶，以酶活力为指标筛选菌株。

1.2.3纤维素酶活力测定
1.2.3.1原理：纤维素酶是一种多组分的酶，其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素；C x酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维素寡糖；而β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维素寡糖水解成葡萄糖。

纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量就可测定纤维素酶的活力。

1.2.3.2葡萄糖标准曲线的绘制
准确称取葡萄糖250.0mg，溶于蒸馏水中，定容至250.0mL。

分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别定容至50.0mL。

再分别吸取上述溶液各2.5mL于试管中，各加2.5mL 3,5-二硝基水杨酸，煮沸5min(另设1管对照，取2.5mL蒸馏水，加2.5mL3,5-二硝基水杨酸，同样煮沸5min)。

冷却后，用紫外分光光度计在550nm波长下比色，记录各管的吸光值，以吸光值作横座标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵座标，绘制标准曲线。

酶活力定义：在上述条件下，每小时释放1μg葡萄糖的量为一个酶活力单位（U）。

葡萄糖含量（mg）0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
OD550nm值0.048 0.211 0.355 0.595 0.724
葡萄糖标准曲线
1.2.3.3酶液提取
将液体发酵液取出后（包括空白对照），用离心机4500r/min离心10min（去除杂蛋白及一些影响吸光值测定的杂质），取上清液则为粗酶液。

1.2.3.4 CMC酶活力测定
用CMC 酶活力代表内切酶活力。

在试管中加入1.2mL1.0%浓度的羧甲基纤维素钠的缓冲液，再加入0.4mL适当稀释的酶液，于50℃恒温水浴锅保温30min，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min，冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀，取上清液在550nm处测定吸光值。

1.2.3.5滤纸酶活力（FPA）测定
取Whatman NO.1滤纸一条（1cm×6cm，约50mg），卷成筒状，投入试管底部，
加1.0mL pH值4.6的0.05M醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入适当稀释的酶液0.4mL，盖上塞子。

将其置于50℃恒温水浴锅保温60min。

取出试管，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min，冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀。

取上清液在550nm处测定吸光值。

1.2.3.6 β-葡萄糖苷酶活力测定
在试管中加入1.2ml1.0%水杨苷溶液的缓冲液并加入0.4mL适当稀释的酶液，50℃恒温水浴锅保温30min后迅速加入2.4mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却后加水稀释到20.0mL，在550nm处测定吸光值。

空白对照，对照样品预先煮沸灭酶活10min，其它同上。

1.2.4 菌株鉴定
1.2.4.1 菌落形态观察
将菌株分别接种到PDA平皿中培养，进行菌落形态观察和显微形态观察。

1.2.4.2 菌株DNA鉴定
菌株活化：将菌株接种到盖有玻璃纸的PDA平皿中，于28℃培养3~4d，待菌丝茂盛而未大量形成孢子时，用已经灭菌的药匙刮去菌丝进行DNA鉴定。

1.2.4.2.1 DNA提取
（1）将已刮好的装在离心管中的菌丝（装在2离心管中）加入液氮。

（2）将其放入研磨机研磨至均匀。

（3）将预热65℃的CTAB缓冲液800ml加入离心管中并且摇匀。

（4）将离心管放在65℃水浴锅中水浴30min。

（5）水浴结束后加入Tris饱和酚：氯仿异戊醇(25:24:1) 等体积混合，12000r 5min （6）离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇（24:1）混合，12000r 5min （7）离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇（24:1）混合，12000r 5min （8）取上清液加满冰箱预冷（4℃）的无水乙醇，放4℃冰箱20min。

（9）看是否有沉淀，多沉淀的用黄色枪头挑出放入一个干净的离心管中。

无絮状沉淀离心10000r 10min，然后倒出液体。

（10）将冰箱预冷的70%的乙醇加入离心管1ml洗涤DNA。

（11）重复第10步（第二遍加时稍微摇一下，充分接触）
（12）把离心管倒立在吸水纸上至管壁没有水珠，观察DNA的量。

若DNA含量高，加入100ul TE缓冲液，中等加80ul TE缓冲液，少则加入60ul TE缓冲液。

（13）再离心2min，放入4℃冰箱中。

1.2.4.2.2 DNA电泳
(1) 制备凝胶：电泳缓冲液配制的1.0%琼脂糖用微波炉融化，混匀冷却至，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳（琼脂糖的厚度在样品梳的1/3左右）。

(2) 取DNA提取产物5.0μL，与2.0μL加样缓冲液混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶，以MarkerⅤ（全式金生物技术公司提供）为分子量标记。

(3) 5V/cm恒压电泳，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源，电泳结束后将凝胶先在溴化乙锭染色液中染色10~15min，然后在凝胶呈像仪上观察其明暗程度并保存于电脑中。

1.2.4.2.3 ITS扩增反应及测序
利用TransGen公司的2×Taq SuperMix进行扩增反应。

以提取的菌株DNA为模板，以ITS1（5’-CGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）（White T. J. et al., 1990）为引物，扩增ITS 片段，扩增体系如表。

PCR反应体系
成分体积备注
dNTP
引物ITS1（10μmol/L）引物ITS4（10μmol/L）
Buffer
IaqE
DNA模板
ddH2O
1μL
1μL
1μL
5μL
1μL
5μL
补足至50μL
（1OD稀释至
500μL）
（1OD稀释至
500μL）PCR反应条件列表
PCR条件温度时间
预变性变性退火延伸循环数延伸95℃
95℃
53℃
72℃
34
72℃
3min
2min
35s
1min
—
10min
取PCR扩增产物于1.0%的琼酯糖凝胶上，以Marker Ⅴ为分子量标记。

于1×TAE 缓冲液中，5V/cm电压下进行电泳，电泳结束后将凝胶先在溴化乙锭染色液中染色10～15min，观察其明暗程度并保存于电脑中。

PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

2结果与分析
2.1 产纤维素酶菌株的筛选
对供试菌株通过刚果红染色法进行初筛，通过发酵培养测纤维素酶活力进行复筛，筛选出11真菌株纤维素分解菌，获得菌种的水解圈直径与菌落直径的比值，结果见表。

从此表可以看出真菌ACCC 31601的水解圈的直径与菌落直径比值最大。

然后分别在100mL的纤维素酶活性测定液体培养基中，接种真菌，培养9d。

每24h取样，测得CMC酶活力见下表。

初筛菌株液体发酵粗酶液CMC酶活力（U/ml）
在初步确定有降解纤维素能力的11株菌中，菌株ACCC 31601、ACCC 32566发酵过程中产生的CMC酶活力相对较高。

其中菌株ACCC 31601发酵液的CMC酶活力最高，为2260.3U/mL，其透明圈与菌落直径的比值也最大。

菌株ACCC 32566发酵液的CMC酶活力稍低，为1802.7 U/mL。

由表可以看出ACCC 31601和ACCC 31726的FPA酶活较高。

初筛菌株液体发酵粗酶液β-葡糖糖苷酶活力（U/ml）
表中五3-303和ACCC 32569的β-葡糖糖苷酶活较高。

下面是其折线图
图1 初筛菌株液体发酵粗酶液CMC酶活力
菌株酶活力：ACCC 31601的酶活力最高，达2260.3U/ml,其透明圈与菌种直径的比值也是最大的。

可以看出水解圈与酶活高低有关联。

其次是ACCC 32566，其酶活达1802.7U/ml。

图2 初筛菌株液体发酵粗酶液FPA酶活力
FPA酶活力：ACCC 31726的酶活力最高1731.2U/ml，其次是ACCC 31601，其酶活达到1666.85U/ml。

图3 初筛菌株液体发酵粗酶液β-葡糖糖苷酶活力
从图3可以看出：五3-303的酶活达到2746.5U/ml，其次是ACCC 32569酶活达到1581.05U/ml。

2.2 对酶活测定的11株菌种进行了形态学鉴定，以下为其鉴定结果
2.2.1 菌株ACCC 31601（原始编号：141-3）形态学鉴定
在PDA上黑暗培养，28℃培养3天菌落直径85mm，在28℃培养48h内出现分生孢子。

菌落暗绿色，中间为产孢区，外缘也产孢，菌丝少。

PDA上产生黄色的扩散性色素。

显微镜下分生孢子梗丛束疏松，环状排列。

分生孢子梗主分枝呈树状，其上众多次级分枝，基部变细、中间膨大、以大角度伸出，终极甁梗长而细。

2.2.2菌株ACCC 32566（原始编号：迁4-2）形态学鉴定
PDA上菌落呈绿色，絮状，生长迅速，一般25℃下3 天基本可以铺满平板, 木霉菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。

菌落周围有白色菌丝的生长带。

在显微镜下可以看到其孢子呈爪状，分生孢子梗主分枝呈树状，其上众多次级分枝、以大角度伸出，终极甁梗长而细。

2.2.3菌株ACCC 31572（原始编号：三5-10）、菌株ACCC 32569（原始编号：三4-4）形态学鉴定
菌落特征：该菌生长缓慢，菌落呈放射状向外延生，菌丝初为白色，后期孢子呈绿色；形态特征：菌丝体产生大量的分生孢子梗。

分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。

项囊表面长满一层或两层辐射状小梗(初生小梗与次生小梗)。

最上层小梗瓶状，顶端着生成串的球形分生孢子。

2.2.4菌株五3-303形态学鉴定
菌落特征：该菌生长非常缓慢，菌落呈放射状向外延生，菌丝初为白色，后期孢子呈绿色。

形态特征：基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。

2.2.5菌株ACCC 32491（原始编号：JZG12-1）形态学鉴定
菌落特征：该菌生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。

菌丝有隔分枝，厚垣孢子有或无。

分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。

分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。

2.2.6菌株ACCC 32568（原始编号：JZG7-1）、菌株JZG8-3形态学鉴定
菌落特征：该菌生长较快，菌落呈放射状向外延生，菌丝各细胞之间有横隔膜，菌丝初为白色，后期孢子呈绿色。

形态特征：基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚。

2.2.7菌株ACCC 32567（原始编号：四6-5）形态学鉴定
菌落特征：该菌落生长较快，呈丝绒状至絮状，致密，其表面颜色呈灰绿色。

分生孢子头球形至辐射形，一般直径为52-125μm，小分生孢子头似青霉状，呈疏松柱形或散乱；分生孢子梗直接生于基质或生于气生菌丝，壁较厚，光滑，顶囊较小，近球形或稍呈椭圆形，分生孢子为球形或近球形，壁明显粗糙，具小刺。

2.3 11株菌种的rDNA-ITS序列分析
2.3.1为确定11株菌株在分类学地位，对其进行了ITS基因序列测定，所获的ITS 基因序列长度在600bp左右，然后在NCBI中进行比对。

2.3.2 以下为11株菌种的ITS序列
2.3.2.1菌株ACCC 31601的DNA-ITS区序列：
CGCTTCGAATTTACACTCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGAT CTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACT CTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGG CGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTC GAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCGA AATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGA GCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTA GGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAAGAA
通过比对确定其为Trichoderma harzianum（哈茨木霉）
2.3.2.2菌株ACCC32566的DNA-ITS区序列：
TACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGAT TCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAA ACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTT TCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCC GAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACC GGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCAC ACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTCTGAAATGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT
通过比对确定其为Trichoderma citrinoviride（桔绿木霉）
2.3.2.3菌株ACCC32569的DNA-ITS区序列：
ACCGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCT TCGGCGGGGAGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGA GTAATGCAGTCTGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGG
TTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCC GAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGG GGGGGGACGGACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTT TGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAG GTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGC
通过比对确定其为Aspergillus aureolatus（具黄曲霉）
2.3.2.4菌株ACCC32491的DNA-ITS区序列：
TGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGG AGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGC AAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGA
TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCG CCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGG TCCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGT CTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCC ACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCT
通过比对确定其为Trichoderma viride（绿色木霉）
2.3.2.5菌株ACCC32572的DNA-ITS区序列：
GGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGG AGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGAGTAATGCAG TCTGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCAT TGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGGGGGGGGACG GACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCG CTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC
通过比对确定其为Aspergillus aureolatus (具黄曲霉)
2.3.2.6菌株ACCC32571的DNA-ITS区序列：
CGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCCCCCCAGGGGC
GAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGCCTGAATACAA ATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA CTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTG CGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC TTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTG TCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGATTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGC CGGCGTCTCCAACCTTATTTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGC
通过比对确定其为Aspergillus nidulans (构巢曲霉)
2.3.2.7菌株ACCC 31726的DNA-ITS区序列：
CTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTTACTGGCCGCCGGGG GGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCCCGAACTCTGTCTGAAGATTGAA GTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATC GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAG TCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTG CTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTCCGGGGGACGGGCCCGA AAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTA GGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTA GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG
通过比对确定其为Trichoderma ovalisporum（卵孢木霉）
2.3.2.8菌株ACCC32568的DNA-ITS区序列：
TCCCACCCTTGTCTCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCG GGGGACGCACGTCTCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGG GCTGTCTGAGTACTGTGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCAT TTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGG CAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGAC CTGCGGGGGTTGGTCACCACCATGTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTAC CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC
通过比对确定其为Penicillium pinophilum (嗜松青霉)
2.3.2.9菌株ACCC32567的DNA-ITS区序列：
GCCACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCG AGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAA ATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA CTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTG CGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGC TTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTG TCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGC CGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAA
通过比对确定其为Aspergillus sydowii(聚多曲霉)
2.3.2.10菌株五3-303的DNA-ITS区序列：
ATGGTTGGAGACGCCGGCTGGCGCCCGGCCGGCcCTAGTCGAGCGGGTGACAAAGCCCCAT ACGCTCGAGGACCGGACACGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGTCCGTCCCCCCCCCGGAGGG GGGGAACGACAACCCAACACACAAGCCGGGTTTTTATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG CATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAAT TCTGCAATTCACATTACTTATCGCAGTTCGCTGCTTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGA TCCATTGTTGAAAGTTTTGACTGATTATACTATTCAGGCTCAGACTGCATTACTCTCAGGCA TGAAGTTCGGGGGCCCCCGGCGGCTCGCTCCCCGAGGGGCGCTCCCCCCCCAAAAAAACAG TGTAAGGAAGTCACGGGTGGAAGGTTGGGCGCCCGGAGGCAGACCGCACTCGGTAATGATC CTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTT
通过比对确定其为Penicillum chrysogenum（产黄青霉）
2.4 结论
对分离筛选的29株菌种进行产纤维素酶活的测定，通过初筛，确定其纤维素降解活性较好的菌株有11株，结合形态特征和ITS序列分析对这11株真菌进行鉴定和分类，这11株主要为青霉属、木霉属、曲霉属。

它们分别是ACCC31601是Trichoderma harzianum（哈茨木霉）、ACCC32566是Trichoderma citrinoviride （桔绿木霉）、ACCC32569 是Aspergillus aureolatus（具黄曲霉）、ACCC32491是Trichoderma viride（绿色木霉）、ACCC32572是Aspergillus aureolatus (具黄曲霉)、ACCC32571是Aspergillus nidulans (构巢曲霉)、ACCC 31726 是Trichoderma ovalisporum（卵孢木霉）、ACCC32568是 Penicillium pinophilum(嗜松青霉)、ACCC32567是Aspergillus sydowii(聚多曲霉)、五3-303是Penicillum
chrysogenum（产黄青霉）、JZG8-3是Penicillum pinophilum（嗜松青霉）。

木霉具有较强分解纤维素能力，绿色木霉通常能够产生高度活性的纤维素酶，对纤维素的分解能力很强。

ACCC 32566、ACCC 31601、ACCC 31726为木霉，其纤维素酶活比其它的菌株酶活高。

参考文献
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