一株抗镉真菌的鉴定及其抗性的初步研究

一株抗镉真菌的鉴定及其抗性的初步研究
于洪飞;刘森
【摘要】采用梯度浓度驯化的方法,从河南理工大学煤场土样中分离到一株抗镉真菌,编号为M2.通过传统形态学方法及真菌18S rDNA序列的系统发育分析鉴定,菌株M2为旋孢腔菌属(Cochliobolus)月状旋孢腔菌(Cochliobo-lus lunatus,有性态),即弯孢霉属(Curvularia Boedin)新月弯孢霉(Curvularia lunata,无性态),其可在镉质量浓度为4000 mg/L的平板上生长.同时还初步探索了菌株M2对重金属铅、铬、铜、锌、钴和镍的耐受性,菌株对7种重金属的抗性强弱顺序为Cd2+(4000 mg/L)>Pb2+(1500 mg/L)>Zn2+(600 mg/L)>Cu2+(400 mg/L)>Ni2+(100 mg/L)>Co2+(80 mg/L)>Cr2+(60 mg/L).%A strain of Cd-resisting fungus, named M2, was isolated from soil samples near the coal yield by acclimation based on the concentration gradient approach. M2 was identified as Cochliobolus lunatus(telemorph), namely Curvularia
lunata(anamorph), by traditional morphological method and phyogenetic analysis based on 18S rDNA sequence. This strain was able to grow well on plate con-taining 4000 mg/L Cd2+. We also studied the resistance of M2 to heavy metal Pb, Cr, Cu, Zn, Co and Ni. The resistance decreased in the order of Cd2+(4000 mg/L) > Pb2+(1500 mg/L) > Zn2+(600 mg/L) >
Cu2+(400 mg/L) > Ni2+(100 mg/L) > Co2+(80 mg/L) > Cr2+(60 mg/L).【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2018(035)003
【总页数】4页(P43-46)
【关键词】抗镉真菌;18S rDNA;月状旋孢腔菌
【作者】于洪飞;刘森
【作者单位】河南理工大学资源环境学院,焦作454000;河南理工大学资源环境学院,焦作454000
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-331
煤炭作为主要能源，在相当长的时期内，在我国能源结构中的地位不会改变[1]。

然而，煤中含有多种有害或潜在有害元素，在其采集、洗选、储存、运输过程中，会释放到周边环境中[2-3]。

郭二果等[4]研究发现与采矿前比，土壤中As、Hg、Cu、Cd等重金属含量均高于采矿前水平。

马从安等[5]对胜利露天煤矿重金属含量调查，发现重金属Cd的含量已经超标。

煤矿区土壤中Cd和Pb对人体健康存在健康风险[6]，因此，矿区污染土壤的修复显得尤为重要。

在自然界中，微生物在重金属的迁移、转化过程中起着重要作用，可对土壤中的重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的[7]。

本文采用浓度梯度驯化的方法[8]，从校园内长期堆放煤的下层土壤中筛选出对镉具有较强抗性的真菌，运用传统形态学方法和18S rDNA序列分析对菌株进行了鉴定，同时研究菌株对Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+的重金属抗性，为其实际应用提供参考。

1 材料和方法
1.1 抗镉菌株的筛选与培养
采用梯度浓度驯化法，从河南理工大学校园内煤场采集土样，称取3份土样各10 g加入到90 mL的马铃薯葡萄糖(简称PDA)液体培养基(其中Cd2+浓度为100 mg/L)摇床培养3 d(28℃，150 r/min)，取培养液10 mL加入到PDA液体培养基(Cd2+浓度为200 mg/L)摇床培养3 d(28℃，150 r/min)，依此类推，镉浓度逐渐递增，最后Cd2+浓度达到2000 mg/L。

取最后一批的培养液，将菌液涂布于镉离子抗性平板(浓度为2000 mg/L的PDA固体培养基)，培养分离菌株。

1.2 形态与分子鉴定
1.2.1 形态鉴定
将1.1分离的菌株接种于PDA平板上，置于28℃下培养5 d，期间观察菌落的颜色和形态。

并在显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及分生孢子的形态特征。

根据《真菌鉴定手册》[9]和《植物病原真菌学》[10]进行鉴定。

1.2.2分子鉴定
将菌株接种到PDA液体培养基中，摇床培养(28℃，150 r/min)3 d后抽滤得到新鲜的菌丝体。

使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(No.B518229，上海生工生物工程有限公司)提取基因组。

采用NS1(5′-gTAgTCATATgCTTgTCTC-3′)和NS8(5′-TCCgCAggTTCACCTACggA-3′)两个通用引物扩增18S rDNA序列[11]。

PCR反应体系(25 μL)：基因组DNA 0.5 μL，引物(25 μmol/L)各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.25 μL，MgCl2 1.5 μL，ddH2O 16.25 μL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。

1%琼脂糖电泳检测，采用SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒(NO.B518131，上海生工生物工程有限公司)回收目的片段。

利用T4 DNA Ligase将其与pUCm-T 载体连接形成克隆质粒，再将重组质粒转
化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，使用选择性LB琼脂平板筛选含重组质粒的白色克隆，提取质粒。

通过上海生工生物工程有限公司测序，获得的序列提交到NCBI数据库，并应用BLAST 程序与数据库中已有的基因序列进行同源性比对分析。

应用MEGA6.0以N-J方法构建系统发育树，对菌株进行系统发育分析。

1.3 菌株对其他重金属的抗性检测
用MIC(Minimal Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)来表示菌株对重金属的抗性，MIC值越大，表示菌株对重金属的抗性越大，反之，抗性越小。

分别配制不同质量浓度的Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+重金属离子的抗性平板。

用打孔器(直径0.5 cm)从培养好的平板上打取菌落接种于抗性平板上，每个浓度3个重复，倒置培养(28℃)2 d后，开始观察并记录菌落直径，以24 h 内菌落直径变化不显著的视为不生长，被完全抑制。

2 结果与分析
2.1 镉抗性菌株的筛选与形态鉴定
采用梯度浓度驯化方法筛选抗镉菌株，当镉离子富集浓度达到800～2000 mg/L 之间时，发现培养基中只有一种真菌存在，培养液呈清澈透明状，悬浮着大量表面粗糙的菌丝球，长势良好，抗性平板培养后，得到一株抗镉真菌，编号为M2。

菌株M2在PDA平板上初期菌丝为白色，疏松的绒毛状，培养到72 h，菌落墨绿色丝绒状，呈放射状向外扩展，老熟后呈黑色，表面平伏，似毡状(图1)。

分生孢子梗褐色，有隔，单生或簇生，直或弯曲(图2-A)。

分生孢子暗褐色，弯曲或呈新月形，大小(25～27.5)μm×(10～15)μm，具隔膜3个，大多4胞，中间两个细胞膨大，其中从基部向上数第3个细胞特别大，颜色深；两端细胞稍小，颜色浅(图2-B)。

根据以上特征，菌株M2符合关于新月弯孢霉特征的描述报道[5-6]，初步鉴定为新月弯孢霉 (Curvularia lunata)。

图1 菌株M2在PDA平板上的菌落生长状态Fig 1 The growth state of strain
M2 on PDA plate culture medium
图2 菌株M2的分生孢子梗及分生孢子(40×10)Fig 2 Sporangiophore and conidia of strain M2(40×10)
2.2 分子生物学鉴定
采用试剂盒提取到高纯度基因组DNA，并成功扩增出18S rDNA基因(1731 bp)。

通过同源性比对发现，M2(GenBank登录号：KX852423)与Cochltobolus sp.，Cochliobolus geniculatus，Cochliobolus lunatus亲缘关系接近，处在同一个
大的分支。

且与Cochliobolus lunatus(GenBank登录号：JN941608.1)同源性达100%，序列覆盖率100%。

通过系统发育分析(图3)，鉴定菌株M2属于真菌界(Fungi)、双核亚界(Dikarya)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌亚门(Pezizomycotina)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、格孢菌亚纲(Pleosporomycetidae)、格孢菌目(Pleosporales)、格孢菌科(Pleosporaceae)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)月状旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)。

图3 以18S rDNA基因序列为分子标记的系统进化树Fig 3 The phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences
2.3 菌株M2对镉离子的抗性检测
菌株M2在镉浓度500 mg/L到4000 mg/L的平板上均能生长，随培养时间的延长，各个浓度下菌株M2的菌落直径均缓慢增加，且随镉浓度的逐渐提高，菌株
生长速度缓慢，菌落直径增加的幅度变小(图4)。

镉浓度在500～2000 mg/L时，菌落直径在24 h内变化明显，而高于2000 mg/L时，菌落直径在24 h内增长幅度较小。

当镉浓度为4000 mg/L时，镉抑制作用增强，菌落直径增长不明显。

可见，镉对菌株M2的最低抑菌浓度为4000 mg/L。

同时还发现，在镉抗性平板上
的菌落中央菌丝体呈现灰色，边缘乳白色，菌丝体紧密有褶皱，并分泌有褐色色素
渗入培养基中，菌丝表面不易形成粉末状孢子。

2.4 菌株M2对其他重金属的抗性检测
用MIC来表示菌株M2对铅、铜、锌、镍、钴和铬的抗性。

随着重金属浓度的增加，菌株M2对各个重金属表现出不同的耐受性。

低浓度的铅对M2的抑制作用
不明显，当铅质量浓度大于1000 mg/L时，抑制作用增强，铅质量浓度达到1500 mg/L时，菌株生长被抑制，菌落直径24 h内基本不变(图5-A)，菌株M2
对铅具有很强的抗性。

菌株对锌、铜抗性也较强，当锌和铜质量浓度分别达到
600 mg/L和400 mg/L时，基本抑制了M2的生长(图5-B、C)，锌抗性平板上，菌落周围亦产生褐色色素渗入培养基中。

铜抗性平板上的菌落颜色偏深蓝绿色。

重金属镍、钴、铬对菌株的毒害作用较强，当镍、钴、铬的质量浓度分别为100、
80和60 mg/L时，M2的菌落直径比接种时直径(0.5 cm)只增加0.2～0.5 cm，
可能是借助接种时带入的培养基才有少量增长(图5-D、E、F)。

由图5的抗性结果可知，铅、锌、铜、镍、钴和铬对菌株M2的最低抑菌浓度分别为1500、600、400、100、80和60 mg/L。

图4 不同质量浓度Cd2+对菌株M2菌落直径的影响Fig 4 Influences of different mass concentrations of Cd2+ on the colony diameters of strain
M2
图5 不同质量浓度重金属对菌株M2菌落直径的影响Fig 5 Influences of different mass concentrations of heavy metal on the colony diameters of strain M2
3 讨论
采用梯度浓度驯化的方法从校园内煤场土样中分离得到抗镉真菌M2，它在镉浓度为2000 mg/L的液体培养基中生长良好，抗镉性较强。

根据形态学鉴定菌株M2
为弯孢霉属(Curvularia Boedin)新月弯孢霉 (Curvularia lunata)。

通过18S
rDNA序列分析鉴定菌株M2为旋孢腔菌属(Cochliobolus)月状旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)。

弯孢霉属的有性态是旋孢腔菌属(Cochliobolus)、拟旋孢腔菌属(Pseudocochliobolus)[9-10,12]。

月状旋孢腔菌为旋孢腔菌属的模式种[13]，新月弯孢霉即为月状旋孢腔菌的无性态。

因此，两种鉴定方法结果一致。

研究发现，菌株M2对多种重金属有抗性，强弱顺序为Cd2+> Pb2+> Zn2+> Cu2+> Ni2+> Co2+> Cr2+。

国内外报道的镉抗性真菌种类主要有Metarhizium anisopliae、Saccharomyces cerevisiae、Fusarium oxysporum、Phomopsis sp. [8]、Phanerochaete chrysosporium[14-15]、Paecilomyces lilacinus[16]、Gliocladium viride、Mucor sp.和Aspergillus niger[17]。

关于新月弯孢霉的研究，集中在产甾体化合物，产絮凝剂和产漆酶[18-19]等方面。

新月弯孢霉对重金属的抗性尤其是对镉的抗性研究报道较少，冯宏等[20]从电子垃圾污染区土壤得到一株新月弯孢霉Cd7，其可在镉质量浓度为2000 mg/L的PDA抗性平板上生长，菌株Cd7对9种重金属离子抗性的强弱顺序依次为：Zn2+、Cd2+(>2000 mg/L)>Pb2+(1500
mg/L)>Cu2+(500 m/L) >Co2+(100 m/L)> Ni2+、Cr2+(50 mg/L)>Hg2+、Ag+(25 mg/L)。

M2和Cd7对铅、铜、钴、镍和铬的抗性差别不大，但对镉和锌的抗性上有较大区别。

菌株M2可在镉质量浓度为4000 mg/L的平板上生长，比Cd7的镉抗性强。

而Cd7可在锌质量浓度为2000 mg/L的平板生长，比M2的锌抗性强。

这可能是由于两个菌株分离来源不同，生存环境有差异，对重金属的抗性有所不同。

从煤场区土壤中分离得到菌株M2，能够在煤矿环境中生存，并对各种重金属有一定的抗性。

今后可进一步对其抗重金属机制进行探讨，为生物法修复煤矿重金属污染提供有力的理论支持。

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