纳米银的抑菌活性及对红橘青霉病的防治效果

纳米银的抑菌活性及对红橘青霉病的防治效果
甘丽萍;向小飞;陈梦吟;王莉莉;王思敏
【摘要】通过化学还原法制备了粒径为(20 ± 5) nm、分散性较好、分布均一、没有团聚现象的纳米银颗粒,然后选择3个菌种进行纳米银的体外抑菌试验,并进行红橘浸果试验防治青霉病,研究纳米银对不同菌种的抑制效果和对红橘青霉病的有效防治浓度.结果表明:纳米银对3种供试菌种都有一定的抑制效果,并随着质量浓度的升高而增加.当质量浓度为0.4 mg/mL时,纳米银对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有较明显的抑制作用,抑制率分别为94.69%和90.25%,而对指状青霉菌(Penicillium digitatum) 的抑制率为71.43%,说明在相同的质量浓度和处理条件下,纳米银对细菌的抑制作用更强,而对青霉菌的抑制作用稍弱.浸果试验结果表明,纳米银质量浓度高于0.4 mg/mL,才能有效防治红橘青霉病,当质量浓度达到0.8 mg/mL时,相对防效为44.64%,低于1000倍液的百菌清(相对防效为59.07%),说明一定质量浓度的纳米银对红橘青霉病有防治效果,虽然不如百菌清,但鉴于其对人体无毒性,在红橘的保鲜中将有较好的应用前景.%To study the inhibitory effect of nano-Ag on different strains and effective concentration on tangerine blue mold,Ag nanoparticles with an average diameter of (20 ± 5)nm,uniform distribution and no agglomeration were prepared by chemical reduction method,and then nano-Ag was set to in vitro control experiments on three strains and tangerine fruit invasion inhibitory test.The results showed that nano-Ag had certain inhibitory effect on the three strains,and the effect was more obvious with the increase of concentration.When nano-Ag concentration reached 0.4 mg/mL,it had a significant inhibitory effect on Staphyloccocus
aureus and Bacillus subtilis,with the inhibition rate of 94.69% and 90.25%, while the inhibition rate on Penicillium digitatum was 71. 43%,which showed that under the same concentration and treatment conditions,the inhibition effect of nano-Ag on bacteria was more obvious,and weaker on Penicillium.Three concentrations of nano-Ag were used to test the control effect on tangerine blue mold.Nano-Ag could control the disease effectively when the concentration was higher than 0.4 mg/mL. When the concentration of nano-Ag was 0.8 mg/mL,the control effect was
44.64%,still lower than chlorothalonil 1 000-fold dilution(59.07%).In conclusion,certain concentration of nano-Ag has control effect on blue mold of tangerine fruit,although with a certain difference from chlorothalonil,in view of its non-toxicity to human body,it will show a good application prospect in the preservation of tangerine fruit.
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2018(047)003
【总页数】6页(P76-81)
【关键词】纳米银;化学还原法;金黄色葡萄球菌;枯草芽孢杆菌;指状青霉菌;红橘【作者】甘丽萍;向小飞;陈梦吟;王莉莉;王思敏
【作者单位】重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆万州404100;重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆万州404100;重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆万州404100;重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆万州404100;重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆万州404100
【正文语种】中文
【中图分类】S436.66
三峡库区属典型亚热带季风湿润气候，是我国乃至世界红橘的最适宜生态区之一[1]。

红橘成熟期过于集中，果实在贮藏期间会发生青霉病、绿霉病、酸腐病、软
腐病、蒂腐病等多种侵染性病害[2]，病原菌大多为弱寄生真菌，造成较高的烂果率，大大影响了产品性状和经济价值。

过去采用百菌清、菌毒清、富马酸二甲酯(DMF)[3]、2，4-D[4]等防治贮藏期间病害。

但随着病原菌抗药性、农药残留和有害重金属超标等问题的产生以及人们对绿色食品的青睐，研究者们开始把目光转向高效、广谱、低毒及不易产生耐药性的纳米材料[5]。

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围 (1～100 nm) 或由其作
为基本单元构成的材料。

大量研究证实，纳米材料具有很好的杀菌抗菌效果[6-7]。

纳米抗菌剂释放正电荷，牢牢吸附并穿透细菌、霉菌的细胞壁，破坏微生物电子传输系统、呼吸系统、物质传输系统从而迅速杀死菌体；进入细胞体后，还能与细菌的羟基反应，使细菌的蛋白质凝固，破坏细菌细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂繁殖能力而死亡[8-10]。

纳米银作为金属银的一种特殊形态，相比银来说，具有更强的抗菌特性，对人体更具有安全性，已被提议应用于手术和医疗器械的消毒[11]。

关于纳米银颗粒的制备方法，文献报道的有化学还原法、电化学法、电子束蒸发沉积法等，这些方法各有优缺点。

其中化学还原法具有设备简单，操作方便，反应条件温和，制得的纳米银产量大、纯度高、颗粒的大小和形状可控、粒径分布相对集中等诸多优点[12-13]。

同一种纳米材料往往对不同菌种抑制作用不同，如纳米氧化锌对扩展青霉的抑菌效果优于灰霉菌[14]，纳米氧化铜对辣椒疫霉病菌的抑制率显著高于番茄早疫病菌及西瓜枯萎病菌[15]。

不同纳米材料的抗菌作用也不同，可
能与纳米材料的粒径、形状、处理方式、微生物本身的结构性状以及剂量和作用时间等有关[16-18]。

本研究采用化学还原法制备了纳米银颗粒，将其与其他的纳米
材料和化学农药做对比，对几种菌种进行体外抑菌试验，并调查其对红橘贮藏期间青霉病的防治效果，以确定纳米银的防效和有效剂量，从而为纳米银材料在柑橘贮藏期间病害预防中的应用提供试验依据。

1 材料和方法
1.1 供试材料
试验中采用的金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由重庆三峡学院微生物实验室提供，置于25 ℃恒温培养箱中，活化待用。

供试药剂：聚乙烯吡咯烷酮[PVP，(C6H9NO)x,相对分子质量10 000]、三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O,99%)、硼氢化钠(NaBH4,99%)、乙腈(CH3CN，99%)、抗坏血酸(C6H8O6,99%)、硝酸银(AgNO3,99%)均购买自Sigma-Aldrich公司；农用链霉素(72%可湿性粉剂)、百菌清(75%可湿性粉剂)由山东省潍坊市农药实验厂生产；纳米二氧化硅
[(20±5)nm]、纳米氧化锌[(20±5) nm]、纳米二氧化钛[(20±5)nm]均产自山西长
治天乙纳米材料有限公司。

以红橘成熟果实为研究对象。

红橘(Citrus reticulata Blanco cv.Tangerine)为芸
香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus Linn.)宽皮橘的栽培品种。

贮藏用果于2016年11
月4日采摘于重庆市万州区龙沙镇红橘园，所有橘果采摘、运输、贮藏条件一致。

仪器：样品的透射电子显微图像使用日立HT-7700电子显微镜拍摄，操作电压120 kV。

高分辨透射电子显微图像使用飞利浦Tecnai F20 FEG-TEM拍摄，操作
电压200 kV。

1.2 纳米银的制备
1.2.1 种子准备将5 mL质量分数5%的聚乙烯吡咯烷酮和10 μL 0.25 mol/L的氯
金酸溶于5 mL 水中。

之后，在剧烈搅拌下向其中注入0.6 mL 0.1 mol/L的硼氢
化钠，产生黄色的Au纳米颗粒溶液。

Au纳米颗粒需要老化6 h，使硼氢化钠完
全分解，然后在纳米银的制备过程中作为种子。

1.2.2 纳米银的制备在25 ℃恒温下，将2 mL 5%的聚乙烯吡咯烷酮、2 mL 的乙腈和100 μL 0.1 mol/L抗坏血酸加入2 mL的蒸馏水中。

然后，加入150 μL 0.1 mol/L的硝酸银，之后快速注入60 μL 种子溶液。

反应在25 ℃下保持15 min。

最后通过离心并用蒸馏水重复洗涤收集纳米银。

通过电子显微镜观察纳米银的微观形貌，进行粒径统计，方法为：在0～100 nm内，每隔5 nm为一个区间，数出粒径分布在对应区间的颗粒数目，再将每个区间的颗粒数目换算成数目百分比。

1.3 纳米银的抑菌试验
1.3.1 金黄色葡萄球菌采用琼脂培养法。

配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，将超声波振荡后形成的纳米材料悬浊液和百菌清分别加入培养基，混匀后倒入已灭菌的培养皿中，制成平板。

分别设置0.4、0.2、0.1 mg/mL的质量浓度处理，对照组(CK)
则加1 mL的蒸馏水。

接种经活化的相同大小的金黄色葡萄球菌菌落于琼脂平板上，每个平板均匀放置4个菌落，25 ℃下培养5 d后观察结果，测量培养皿中4个菌落的直径，统计平均值，计算抑制率。

抑制率=(对照组菌落直径-试验组菌落直径)/对照组菌落直径×100%。

1.3.2 枯草芽孢杆菌采用抑菌圈法。

将枯草芽孢杆菌制成菌液悬浮液。

移取50 μL 菌液于无菌的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用玻璃刮涂布使菌液均匀扩散。

将直径为2 cm的灭菌滤纸圆片置于培养皿正中与其紧密相贴，然后用移液枪移取20 μL质量浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL的纳米银悬浮液滴于其上，
以蒸馏水为对照(CK)。

25 ℃下倒置培养5 d后观察结果，测量抑菌圈直径，计算
抑菌圈宽度和抑制率，公式如下：抑菌圈宽度=(抑菌圈直径-滤纸圆片直径)/2，抑制率=100%-(最大抑菌圈宽度-试验组抑菌圈宽度)/最大抑菌圈宽度×100%。

最大
抑菌圈宽度为(10-2)/2=4,其中10为培养皿直径，2为滤纸圆片直径。

1.3.3 指状青霉菌采用琼脂培养法。

配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将超声波振荡后形成的纳米材料悬浊液加入培养基，混匀后倒入已灭菌的培养皿中，制成平板。

设置处理为纳米银0.8、0.4、0.1 mg/mL，以及链霉素800倍液和百菌清1 000
倍液，对照组(CK)则加1 mL的蒸馏水。

待平板凝固后接种3 mm经活化的指状
青霉菌菌落于琼脂平板上。

每皿4块，25 ℃下培养，2 d和5 d 后测量菌落大小，统计平均值，计算抑制率。

1.4 纳米银对红橘果实贮藏期青霉病的药效试验
1.4.1 供试菌种与药液将指状青霉菌用无菌水
配成孢子悬浮液，以低倍光学显微镜下(16×10)一个视野150～200个孢子为标准。

纳米银设置3个质量浓度，分别为0.1 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL，另
设2个农药处理，分别为链霉素800倍液和百菌清1 000倍液，以无菌水为对照。

1.4.2 试验方法选取大小、色泽、生境一致的橘果，用清水洗净果实表面后再用0.5%的次氯酸钠消毒。

待果实风干，将消毒的针在青霉菌孢子悬浮液中浸泡3 s，之后在果实上人工接种，每果接种10针，接种深度基本一致，以刺破表皮为宜。

接种24 h后，在配好的药剂中浸果2～3 min，期间用玻璃棒搅拌，以克服药剂
沉淀。

每处理50～60个橘果，平行3次。

风干套袋，在常温下分别于处理后15、30、50 d调查青霉病发生情况，取病情指数平均值计算相对防效。

病果分级按以下标准[19]:0级，无病；1级，病害面积占整个橘果1/4以下；2级，病害面积占整个橘果1/4～1/2；3级，病害面积占整个橘果1/2～3/4；4级，病害面积占整个橘果3/4 以上。

病情指数=100×∑(各级病果数×各级代表值)/(调查
总果数×最高级代表值)；相对防效=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病
情指数×100%。

1.5 数据分析
采用Excel和SPSS 20.0版统计分析软件处理数据，并做方差分析和多重比较。

2 结果与分析
2.1 纳米银的制备结果
从电子显微图像可以看出，制备的纳米银颗粒具有非常好的分散性，没有团聚现象，粒径较小且尺寸分布非常均一(图1)。

通过粒径统计发现，平均粒径大约为20 nm，主要集中在15～25 nm(图2)。

A、B：透射电子显微图像；C：高分辨透射电子显微图像图1 纳米银颗粒电子显
微图像
图2 纳米银颗粒的粒径分布
2.2 纳米银的抑菌试验结果
2.2.1 金黄色葡萄球菌从菌落生长来看，各种药剂对金黄色葡萄球菌都有一定的抑制作用，百菌清和纳米银的抑菌效果最为明显(图3)。

经过测量计算，对照组菌落
直径为3.58 cm，药剂组菌落直径都显著降低。

添加纳米银的处理组，当质量浓度为0.1 mg/mL时，菌落直径为1.04 cm，当质量浓度为0.4 mg/mL时，菌落直
径仅为 0.19 cm，抑制率分别达到了70.95%和94.69%；这2个质量浓度下百菌清对金黄色葡萄球菌的抑制率分别为78.21%和92.18%，与纳米银之间没有显著
差异，纳米氧化锌的抑制率分别为 64.25%和89.39%，也表现出了和纳米银以及
百菌清相仿的抑菌效果(表1)。

A：纳米银；B：纳米氧化锌；C:纳米二氧化钛；D:纳米二氧化硅；E:百菌清图3
不同药剂对金黄色葡萄球菌的抑制试验结果表1 不同药剂对金黄色葡萄球菌的抑
制效果
药剂名称质量浓度/(mg/mL)菌落直径/cm抑制率/%纳米银
0.40.19e94.690.20.36e89.940.11.04d70.95纳米氧化锌
0.40.38e89.390.20.85d76.260.11.28d64.25纳米二氧化钛
0.41.37d61.730.22.08d41.900.12.52c29.61纳米二氧化硅
0.41.40d60.890.22.19c38.830.13.30b7.82百菌清
0.40.28e92.180.20.37e89.660.10.78d78.21CK3.58a
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2.2 枯草芽孢杆菌由图4可见，接种枯草芽孢杆菌后5 d，相比于对照组，纳米银处理从初始质量浓度0.025 mg/mL开始就出现了不同大小的抑菌圈，其宽度随纳米银质量浓度的增加呈增大趋势，当纳米银质量浓度达到0.4 mg/mL时，培养皿中只有少数几个枯草芽孢杆菌菌落生长。

从表2可知，低质量浓度的纳米银(0.025 mg/mL)已有一定的抑菌效果，0.05 mg/mL的纳米银抑菌效果增强，当纳米银质量浓度达到0.4 mg/mL，抑菌效果最强，抑制率达到了90.25%，显著高于其他处理。

1：CK；2—6：纳米银质量浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 图4 不同质量浓度纳米银对枯草芽孢杆菌的抑制试验结果表2 不同质量浓度纳米银对枯草芽孢杆菌的抑制效果
纳米银质量浓度/(mg/mL)抑菌圈宽度/cm抑制率
/%CK00a0.0250.389.50b0.051.5639.00c0.11.5839.50c0.21.9047.50c0.43.619 0.25d
2.2.3 指状青霉菌从菌落生长来看，各药剂处理对青霉菌都有一定的抑制作用(图5)。

接种后5 d，对照除了接种的4个菌落外，还产生了大量的小菌落。

从表3可以看出，低质量浓度的纳米银(0.1 mg/L)和链霉素处理后青霉菌菌落直径在1 cm 左右，抑菌效果较差。

高质量浓度的纳米银(0.4 mg/mL和0.8 mg/mL)对青霉菌有较明显的抑制效果，菌落直径在0.35～0.38 cm，抑制率达到了71.43%～7
3.68%，但与百菌清相比存在显著差异。

百菌清在1 000倍液时，青霉菌菌落直径为 0.11 cm，抑制率达到了91.73%，接种的菌落没有扩张，甚至有一点缢缩。

A:接种后2 d；B：接种后5 d。

1: CK; 2:链霉素; 3:纳米银0.1 mg/mL; 4:纳米银0.4 mg/mL; 5:纳米银 0.8 mg/mL; 6:百菌清图5 不同药剂对指状青霉菌的抑制试
验结果表3 不同药剂对指状青霉菌的抑制效果(接种后5 d)
药剂名称使用剂量菌落直径/cm抑制率/%CK1.33a链霉素800倍液1.07b19.55
纳米银0.1mg/mL0.97b27.070.4mg/mL0.38c71.430.8mg/mL0.35c73.68百菌清1000倍液0.11d91.73
2.3 纳米银对红橘果实贮藏期青霉病的药效试验结果
从表4可以看出，1 000倍液的百菌清对红橘青霉病的防治效果最好，病情指数为1.97，相对防效达到59.07%，与其他处理之间都达到了显著差异水平；0.4
mg/mL和0.8 mg/mL的纳米银也有较好的防治效果，病情指数分别为2.87和2.66，相对防效为40.20%和44.64%；低质量浓度的纳米银(0.1 mg/mL)和800
倍液的链霉素处理病情指数都超过4，与对照没有显著差异，相对防效仅为10%
左右。

表4 不同药剂防治红橘青霉病的药效试验结果药剂名称使用剂量病情指数相对防
效/%CK4.80a链霉素800倍液4.28a10.90纳米银
0.1mg/mL4.19a12.650.4mg/mL2.87b40.200.8mg/mL2.66b44.64百菌清
1000倍液1.97c59.07
3 结论与讨论
本试验用化学还原法制备了纳米银颗粒，颗粒具有非常好的分散性，没有团聚现象，粒径较小且尺寸分布非常均一，能够满足后续的试验要求，之后研究了纳米银对不同菌种和红橘贮藏期青霉病的抑制效果。

纳米银对细菌特别是革兰氏阳性菌的抑制作用最强，对酵母菌和霉菌的作用相对较弱[20-21]。

本研究选择的菌种金黄色葡
萄球菌和枯草芽孢杆菌均为革兰氏阳性菌，当纳米银质量浓度为0.4 mg/mL，抑
制率都在90%以上，而其对指状青霉菌的抑制率为71.43%,当纳米银质量浓度增
加到0.8 mg/mL，对指状青霉菌的抑制率为73.68%，说明在相同的质量浓度和处理条件下，纳米银对不同菌种的抑制效果有差异，对细菌的抑制作用更强，而对青霉菌的抑制作用稍弱。

纳米银的作用机制已有学者研究报道，其可通过促进细菌凋亡而影响细菌生长[22]。

纳米氧化锌通过摩擦灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)使菌丝变形而发挥抗菌活性，对青霉菌(Penicillium expansum)则是通过抑制分生孢子的生长而抑制其生长[14]。

不同纳米材料的抑菌机制不同，纳米银抑制真菌的机制还需要深入探究。

探究不同质量浓度的纳米银对红橘果实贮藏期青霉病的防治效果，结果表明，高质量浓度(超过0.4 mg/mL)的纳米银处理与对照相比能使病情指数显著降低，从而有效抑制青霉病。

当纳米银质量浓度达到0.8 mg/mL时，对红橘青霉病的相对防效为44.64%，尽管与1 000 倍液百菌清(相对防效 59.07%)之间有一定的差异，但鉴于纳米银对人体安全无毒，其将成为一种很有前途的新型保鲜剂。

纳米材料在果蔬采后保鲜中已经有一些成功的应用报道，如制成纳米抗菌剂复合涂膜。

在壳聚糖膜中加入纳米二氧化钛，其抑菌效果增强，可延长果蔬的贮藏保鲜时间[23]。

将添加有1%纳米无机抗菌剂(主要成分是纳米银、纳米锌和高岭土)的低密度聚乙烯吹塑制成保鲜袋，可显著提高柑橘采后贮藏品质，减缓柑橘病害的发生[24]。

由此可见，在复合膜中加入纳米抗菌颗粒，可提高抑制致病菌的效果，从而提高果蔬采后贮藏品质。

关于纳米银在果蔬采后保鲜中的应用效果还有待进一步试验。

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