微小RNA在骨分化过程中的作用机制

微小RNA在骨分化过程中的作用机制
刘润恒;刘于冬;陈卓凡
【摘要】在口腔种植治疗过程中常常会遇到骨量不足的问题，植入骨替代材料是目前临床上最主要的重建骨缺损方法之一，因此骨替代材料的成骨性能及其分子机制成为了研究热点。

微小RNA（miRNA）是一种短链非编码RNA，通过转录后调控细胞分化、增殖、程序性死亡等病理生理过程。

miRNA可影响成骨相关因子的表达和激活成骨相关信号转导通路中的信号转导，从而对骨组织动态改建过程进行调控。

本文就miRNA与成骨细胞特异性转录因子、核心结合因子-α1基因、Smad基因、转化生长因子-β诱导因子，与骨形态发生蛋白信号转导通路、无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族信号转导通路、促丝裂原激活蛋白激酶信号转导通路、成脂信号转导通路以及miRNA与口腔相关材料和miRNA在骨缺损修复中的应用研究进展作一综述。

%The problem of insufficient bone usually occurs during oral implantology treatment. The use of bone substitute materials is one of the most important methods to reconstruct bone defects clinically. Therefore, the properties and molecular mechanisms of these bone substitute materials have been a controversial topic in research. MicroRNA(miRNA) is a short, non-coding RNA. It regulates cell differentiation, proliferation, apoptosis, and other pathophysiological processes by post-transcription. In addition, miRNA can regulate the dynamic remodeling of bone tissue by affecting the expression of osteogenic factors and the activation of osteogenic signal transduction pathway. This paper reviews the role of miRNA in osterix, core binding factorα1, Smad, and transforming growth factor-β. The regulating function
of miRNA in the signal transduction pathways of bone morphogenetic protein, wingless-type mice mammary tumor virus integration site family, mitogen-activated protein kinase, and adipogenesis is investigated. The relation of miRNA with dental materials and its application in repairing bone defects are also reviewed.
【期刊名称】《国际口腔医学杂志》
【年(卷),期】2017(044)001
【总页数】6页(P108-113)
【关键词】微小RNA;骨分化;骨分化调节因子;信号转导通路
【作者】刘润恒;刘于冬;陈卓凡
【作者单位】中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院种植科广东省口腔医学重点实验室广州510055;中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院种植科广东省口腔医学重点实验室广州510055;中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院种植科广东省口腔医学重点实验室广州510055
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
骨替代材料可分为同种异体骨、异种骨、人工合成材料和组织工程骨；然而，这些骨替代材料在促进成骨方面的机制迄今尚不清楚[1]。

骨替代材料可通过改变微小RNA（microRNA，miRNA）水平，调控细胞内骨分化基因的表达[2]。

miRNA 是一组由19~23个核苷酸组成的不编码蛋白质的单链RNA，表达具有组织特异性和阶段特异性，能与靶基因的mRNA的3’端非翻译区结合，影响转录后的翻
译。

经过加工后的成熟miRNA与其他蛋白质一道共同组成RNA介导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）参与RNA的干扰途径，主要作
用是抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA，从而对靶基因进行负性调控[3-4]。

Hassan等[5]发现：1）miRNA可协调不同信号转导通路中不同水平的信号因子；2）参与多种复杂的正反馈和负反馈系统；3）在不同阶段选择性地利用miRNA
的亚型调控对骨密度和骨质量具有重要作用的胞外基质蛋白，参与骨分化和骨缺损修复过程。

可见，研究miRNA在骨分化中的作用，有利于进一步了解骨替代材料成骨的相关分子机制。

1.1 miRNA与成骨细胞特异性转录因子
成骨细胞特异性转录因子（osterix，OSX）在骨代谢平衡过程中起着至关重要的
作用，敲除Osx基因后，基因缺陷型小鼠的成骨分化能力完全丧失[6]。

骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）在成骨分化过程中有29个差异表达的miRNA，其中miR-31可结合在Osx基因的3’端非翻译区并控制其表达。

Baglìo等[7]通过分析miR-31和Osx基因之间的关系发现，两者在成骨分化和骨肉瘤细胞系中的表达呈负相关，而抑制miR-31的表达可增强Osx基因的内源性
表达。

Shi等[8]通过双荧光蛋白酶报告基因验证了miRNA-214结合在Osx基因3’端非翻译区，且增强miRNA- 214表达会导致OSX蛋白质量下降，即miRNA-214可通过调控OSX蛋白质量而影响成骨分化。

Osx是miR-143的靶基因，而miR-143抑制小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化，抑制Osx基因
则可抑制MC3T3-E1的成骨分化，过表达Osx基因之后可部分逆转miR-143对
成骨分化的抑制作用[9]。

1.2 miRNA与核心结合因子-α1基因
核心结合因子-α1（core binding factor α1，CBFA1）又称RUNX2，可通过与
成骨细胞标志基因启动子上的成骨细胞特异性顺式作用元件2结合，调控成骨细
胞发育过程中的多种基因表达。

Liu等[10]发现在成骨诱导液的诱导下，BMSC中的miR-338-3p表达将下调，而在模拟骨质疏松的小鼠模型中，miR-338-3p的
表达却上调；过表达miR-338-3p可以抑制成骨细胞标志物OSX的表达。

他们还通过双荧光蛋白酶报告基因等技术验证了miR-338-3p的靶基因是CBFA1和编码成纤维细胞生长因子受体2的基因。

给予模拟骨质疏松小鼠合成的miR-338-3p
特异性抑制剂，其BMSC可以部分恢复矿化和成骨分化，改善骨质疏松。

Zuo等[11]发现在人成骨细胞上加载机械循环力，可以刺激骨形成并上调多种成骨标志物的表达，miR-103a的表达在机械循环力作用下明显下调。

他们发现，过表达
miR-103a后可抑制CBFA1的表达，抑制miR-103a表达的结果则与之相反。

他们用生物信息学联合双荧光蛋白酶报告基因验证了miR-103a的靶基因是CBFA1，即miR-103a是CBFA1的内源性抑制分子。

他们通过在动物体内注射Anatagomir-103a特异性地拮抗miR-103a发现，同样在无机械负载下，注射组较对照组的骨丧失程度低。

他们认为在无机械力负载状态下，至少部分是通过上调miRNA-103a的表达来抑制CBFA1蛋白水平和导致骨丧失的，而miRNA-103a
的特异性抑制剂可以部分减缓无机械力负载下小鼠的骨丧失。

1.3 miRNA与SMAD基因
SMAD蛋白可分成3类，SMAD1、2、3、5、8属于受体调节型，SMAD4属于
共同介导型，SMAD 6、7属于抑制型，其中SMAD1、5、8 C-末端的丝氨酸残
基可被已激活的1型受体磷酸化，继而与SMAD4形成复合体并转位到细胞核内，通过与特定DNA序列结合、与核调节因子形成复合物、募集转录共活化或抑制因子作用在下游靶基因，从而调控细胞的分化[12]。

Kato等[13]发现，纳米形貌的
钛可下调人间质干细胞（human mesenchymal stem cell，hMSC）中的miR-4448、miR-4708和miR-4773（5倍以上）表达，miRNA共同靶基因为
SMAD1和SMAD4。

他们还发现：在纳米钛与MC3T3-E1细胞共培养体系中加
入骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2后可更高效地促进成骨；BMP2信号转导通路参与了纳米形貌的钛促进成骨的分子机制，纳米钛可通过miRNA-SMAD-BMP2调控环路促进成骨。

Wu等[14]证实：miR-30家族可直接作用于SMAD1和CBFA1基因的3’端非翻译区并降低二者的表达，从而抑制成骨分化过程；在诱导细胞成骨分化过程中，过表达SMAD1和CBFA1基因，可抵消miR-30家族对成骨分化过程的抑制作用；miR-30家族是通过调节SMAD1和CBFA1基因表达对成骨分化过程起抑制作用的。

1.4 miRNA与转化生长因子-β诱导因子
Krzeszinski等[15]在用定量聚合酶链反应检测了骨髓中破骨细胞在刺激物处理后与癌症相关的miRNA的丰度变化时发现，miR-34a与破骨细胞的生长呈负相关关系，miR-34a会抑制破骨细胞产生。

另外，他们通过构建miR-34a敲除及杂合小鼠，检测血清骨转移标志物血清1型胶原C端肽-1发现，miR-34a在抑制破骨细胞生长的同时，也一并抑制了破骨细胞所参与的骨吸收作用，从而在不影响成骨细胞数目、骨骼生产速度和骨矿沉积率的情况下增加骨量。

他们还使用miR-34a 模拟物处理卵巢切除小鼠发现，小鼠卵巢切除所引起的1型胶原C端肽-1上升被遏制，骨缺失得到修复，骨生成增加，骨量提高。

这些结果说明，miR-34a通过对破骨细胞及骨吸收的调控，从而影响骨质疏松症。

他们还发现：转化生长因子-β诱导因子（transforming growth factor-β induced factor，TGIF）2是miR-34a在破骨细胞中的直接靶基因。

敲除Tgif2基因可降低小鼠骨吸收，减少破骨细胞，若同时敲除Tgif2及miR-34a基因，小鼠骨吸收及破骨细胞亦不会增加；TGIF2是一种破骨细胞调控因子，会与某些转录因子形成一个正反馈回路，加强破骨细胞的生成；miR-34a即通过调控此靶点，利用其信号转导通路，对破骨细胞和骨吸收产生影响。

Moorthi等[16]发现，纳米生物活性玻璃陶瓷颗粒（nano bioactive glass-ceramics，nBGC）可影响成骨细胞的分化，可刺激MG63细胞
系中miR-30c的上调，且nBGC是通过miR-30c下调靶基因TGIF2和组蛋白脱
乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）4的表达，促进人成骨肉瘤MG-63细胞成骨分化的。

2.1 miRNA与BMP信号转导通路
BMP在体内刺激骨生长和促进成骨细胞分化中起重要作用。

Kureel等[17]发现，肿瘤抑制分子miR-542-3p可通过抑制BMP7及其下游分子表达，进而抑制成骨
分化和促进成骨细胞程序性死亡。

Hupkes等[18]利用RNA聚合酶2/染色质免疫沉淀技术对比成肌细胞的成肌分化和BMP诱导的成骨分化发现：在这两种状态下，结合在6种miRNA启动子区域的RNA聚合酶2是不同的；在BMP2的诱导下，miR-378过表达可以提高细胞内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的
活性，增加钙化结节以及上调成骨相关标志物的mRNA表达。

Liao等[19]通过杆状病毒将miR-26a、miR-29b、miR-148b和miR-196a转染至脂肪源性干细胞
后发现：细胞的成骨能力有所提高，miR-148b的促成骨能力最明显；将过表达miR-148b和BMP2的脂肪源性干细胞植入骨缺损处，骨缺损处成骨既快又好。

2.2 miRNA与无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族信号转导通路
近年来，无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（wingless-type mice mammary tumour virus integration site family，WNT）/β-连环蛋白信号转导通路在骨形成中的作用备受重视，被认为是调控成骨细胞分化和骨基质形成的关键通路。

WNT/ β-连环蛋白信号转导通路的组成部分主要有WNT蛋白、跨膜受体、共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6及胞内重要信号分子β-连环蛋白等，此外
还有Dickkopf家族、硬化蛋白家族和特异性顶部盘状底板反应蛋白3家族等相关因子[20-21]。

过表达miR-21a，可以促进人脐带间质干细胞中糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）3β的磷酸化，进而提高β-连环蛋白的稳定性并且促进其在细胞质内的堆积，使CBFA1转录增强，促进成骨[22]。

Wang等
[23]发现在人BMSC（human BMSC，hBMSC）的成骨分化中：内源性的miR-346表达上调，过表达miR-346则会明显提高成骨分化能力，低表达效果则相反；miR-346的靶基因是GSK3β，前者能抑制后者的表达，抑制GSK3β表达可促进
成骨；过表达miR-346能活化WNT/β-连环蛋白信号转导通路，且能上调数个下游基因，如编码细胞周期蛋白D1、c-Myc、T细胞特异性转录因子-1和淋巴细胞样增强因子-1的基因，而抑制β-连环蛋白的表达，则几乎能完全阻断过表达
miR-346的促成骨作用。

miR-346通过抑制GSK3β基因表达和活化WNT/β-连
环蛋白信号转导通路促进成骨。

2.3 miRNA与促丝裂原激活蛋白激酶信号转导通路
促丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路有3个亚家族成员，即细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）和P38信号转导通路，它们在调控间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化中起着重要的作用。

Vimalraj等[24]发现，miR-424、miR-106a、miR-148a、let-7i和miR-99a 在hMSC中特异性表达，这些miRNA多数是以MAPK信号转导通路中的关键因子为靶基因。

Zhang等[25]在生物源性羟磷灰石
与BMSC共培养促进成骨的体系中，分别用c-Jun N-末端激酶特异性抑制剂
SP600125和ERK1/2特异性抑制剂U0126阻断MAPK信号转导通路后发现，1
型胶原和非转移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB）等成骨相关标志物表达下调，而miR-185、miR-221和miR-222则通过调控MAPK信号转导通路中的MAPK6、热休克蛋白A8和细胞
分裂周期蛋白42等使部分关键转录因子Myc、Fos、Jun以及活化转录因子2和
4上调，促进AKP、Sox9、1型胶原基因和GPNMB等基因上调最终促进成骨。

ERK-MAPK信号转导通路通过磷酸化不同的转录因子促进成骨和成脂，且这是
MSC成骨、成脂和成软骨分化中所涉及的唯一共通的信号转导通路。

Mei等[26]
发现在成骨分化和成脂分化的过程中，miR-21表达上调，过表达miR-21可以同时上调不同的分化方向相关的基因，如过氧化物酶增生物激活受体γ（peroxisomal proliferator activated receptor，PPARγ）和CBFA1基因，而
抑制miR-21表达效果则相反。

他们还发现，ERK-MAPK信号转导通路的活性与miR-21的表达量呈正相关关系，在MSC的分化过程中，miR-21是通过抑制丝
氨酸蛋白酶Y（serine protease Y，SPRY）2的表达来调控ERK-MAPK信号转
导通路中信号转导的。

2.4 miRNA与成脂信号转导通路
骨代谢是破骨细胞骨吸收和成骨细胞成骨的结合过程，而成骨细胞和成脂细胞是源自相同的前体细胞，因此这两种细胞类型可以互相转化，抑制成脂分化能够促进成骨分化[27]。

Li等[28]发现，miR-26a在转录水平和蛋白质水平均能负性调控高速泳动族基因（high mobility group gene，HMG）A1，miR-26a的靶基因就是HMGA1。

后者是成脂通路中的一个关键因子，miR-26a通过抑制HMGA1的转
录和翻译抑制成脂，反向促进成骨。

Sun等[29]发现，miR-548d-5-p在地塞米松诱导hBMSC的成脂分化中下调，过表达miR-548d-5p是通过下调靶基因
PPARγ的表达使地塞米松诱导的成脂作用减弱，从而提高hBMSC的成骨能力。

BMSC的成骨能力会随着老化而下降，而且伴随着成脂分化的能力增强；miR-
188在老化的BMSC中表达会明显上调；敲除miR-188基因的小鼠增龄性骨丧失、脂肪堆积得到部分缓解，而过表达miR-188基因效果则相反[30]。

Bio-Oss属于牛骨源性的材料，是颌面部骨缺损治疗中常用的骨替代材料。

有研究者检测该材料与人成骨肉瘤MG63细胞共培养后的差异miRNA发现，一共有9
个表达明显上调的miRNA（包括miR-423、miR-492、miR-191、miR-23a、miR-377、miR-494、miR-214、miR-193b和miR-320）和4个表达明显下调
的miRNA（包括miR-27a、miR-24、miR-188和let-7c），这些表达有差异的miRNA所对应的与成骨相关的靶基因有锯齿（engrailed， EN）1、融合抑制（suppressor of fused，SUFU）、头蛋白（noggin，NOG）、3’磷酸腺苷-5’磷酸硫酸合成酶（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate synthetase，PAPSS）1和远端较小同源异形盒（distal-less homeobox，DLX）5以及胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）2和β4[31]，但是Bio-Oss与miRNA有关的成骨相关机制尚不清楚。

Palmieri等[32-33]在分别检测了MG63
细胞与金属钛、MG63细胞与氧化锆共培养24 h后差异表达的miRNA发现：前者有13个miRNA表达上调，而这些miRNA可下调多种成骨关键基因，如BMPR18、BMP7和1型胶原A1基因等；后者有18个miRNA表达上调，可能
作用在IGF1、BMP1等重要的成骨关键基因上。

有研究[34]显示，亲水性化学活
化喷砂酸蚀处理（modified sandblasted large grift acid-etched，modSLA）
后的钛可以激活转化生长因子-β/BMP以及非经典的WNT/ Ca2+信号转导通路，从而促进成骨。

他们通过对比modSLA、SLA、光滑表面的钛与人骨干细胞共培
养后的miRNA表达谱，筛选出modSLA表面所特有的差异miRNA并对其靶基
因进行预测发现，大多数所预测的靶基因均位于上述两条信号转导通路中；因此，modSLA可能通过影响上述miRNA的表达，从而调控靶基因的表达并通过转化
生长因子-β/BMP和WNT/Ca2+信号转导通路促进成骨。

MSC常作为修复骨缺损的组织工程骨替代材料的种子细胞，然而成骨效能的不足
限制其应用。

目前，诸多研究在于提高种子细胞的成骨效能，转染miRNA是一种提高MSC成骨和成血管效能的新型手段。

有学者[35]发现，转染miR-26a至脂
肪源MSC后并将其接种于多孔的羟磷灰石支架上，再将其植入兔的胫骨缺损模型中可明显促进骨缺损中的新骨形成。

也有学者[36]发现，在β-磷酸三钙支架上接
种已抑制miR-31表达的BMSC，可有效地修复犬的眶内侧壁缺损。

还有学者[37]
致力于研究一种通过操纵miRNA表达治疗骨质疏松患者骨缺损的新型细胞基因治疗手段。

他们发现，通过在骨质疏松的兔临界骨缺损模型中植入能长效抑制miR-214的去势兔BMSC，可在4周内使骨缺损愈合并明显提高骨质量（包括骨密度以及骨小梁数量、厚度和空间）。

综上所述，目前，越来越多的研究阐明了miRNA在成骨分化中具有重要的调控作用，对其靶基因、作用机制、正负反馈调节有了较深入的了解，但目前将miRNA 应用在生物材料中的研究尚不多；因此，从分析口腔生物材料与细胞培养后所表达的差异miNRA入手，进一步寻找其作用靶点，分析其功能学方面的表现，有望更深入地了解这些生物材料在促进成骨方面的机制，有利于研究开发更理想的甚至带有靶向作用的材料，造福骨缺损的患者。

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